石金敏，周燦，余緒明，鐘鑫昊，王佳，趙利軍*（.十堰市人民醫(yī)院（湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院）藥學(xué)部，湖北 十堰 442000；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，武漢 40070；.湖北醫(yī)藥學(xué)院藥學(xué)院，湖北 十堰 442000）

三金排石合劑由石韋、金錢草、雞內(nèi)金、瞿麥、川牛膝、烏藥、白芍、通草、海金沙和甘草等十味藥材配伍組成，諸藥合用，共奏清熱利濕、通淋排石、活血通經(jīng)、祛瘀止痛之效。對于濕熱下注膀胱，煎熬尿液結(jié)為砂石，導(dǎo)致小便不利或中斷，尿血，腎結(jié)石，尿道炎等泌尿系疾病具有良好的治療效果，療效確切，應(yīng)用廣泛，但未對其制備工藝進行系統(tǒng)的研究，本試驗以槲皮素、山柰酚和干膏得率等指標(biāo)的含量進行CRITIC-AHP 法綜合評分，基于Box-Behnken 設(shè)計-響應(yīng)面法得到三金排石合劑的提取工藝，以期為其深入研究及開發(fā)利用提供數(shù)據(jù)支持，保證臨床用藥的安全有效。

1 材料

1.1 儀器

島津LC-20AT 高效液相色譜儀（日本島津公司）；KGD-15L 超聲波清洗儀（科廣達超聲設(shè)備有限公司）；CP214 電子分析天平（奧豪斯公司）。

1.2 試藥

石韋、金錢草等藥材均購自十堰市人民醫(yī)院，經(jīng)藥學(xué)部雷龍副主任中藥師鑒定均符合《中國藥典》2020年版相關(guān)規(guī)定。

對照品山柰酚（批號：110861-202013，含量93.2%）、槲皮素（批號：100081-201610，含量99.1%）（中國食品藥品檢定研究院）；甲醇、乙腈（色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；無水乙醇、鹽酸、磷酸（分析純，武漢市中天化工有限責(zé)任公司）；水為娃哈哈純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品制備

精密稱量三金排石合劑方中對應(yīng)的中藥飲片共40.3 g，選取1000 mL 圓底燒瓶，將藥材分別加入燒瓶中，按照響應(yīng)面法設(shè)計條件進行回流提取，收集每一次的提取液并濃縮至100 mL 以下，用水定容至100 mL 量瓶中。

2.2 色譜條件

色譜柱：WondaSiL C-WR 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）； 流動相： 甲醇-0.4%磷酸水（43∶57）；流速：1.00 mL·min；檢測波長：360 nm；柱溫：40℃；進樣量：10 μL。

2.3 對照品溶液的制備

分別精密稱取槲皮素、山柰酚對照品適量，加80%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，配制成質(zhì)量濃度分別為7 μg·mL、10 μg·mL的混合對照品溶液。

2.4 供試品溶液的制備

精密吸取樣品10 mL，置于100 mL 錐形瓶中，精密加入40 mL 甲醇和6 mL 鹽酸，稱重，90℃水浴回流提取1 h，迅速冷卻，加80%甲醇溶液補足減失的重量，搖勻，過濾，即得供試品溶液。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗 取“2.3”項下對照品溶液，“2.4”項下供試品溶液，空白溶液（精密吸取純凈水10 mL，同“2.4”項下方法制備），進樣檢測，色譜圖見圖1。

圖1 三金排石合劑HPLC 色譜圖Fig 1 HPLC chromatogram of Sanjin Paishi mixture

2.5.2 線性關(guān)系考察 分別精密稱取槲皮素、山柰酚對照品適量，用甲醇稀釋成質(zhì)量濃度槲皮素為28、14、7、3.5、1.8、0.9 μg·mL和山柰酚為42、21、11、5.5、2.8、1.4 μg·mL的混合對照品溶液，進樣測定，以各成分的峰面積為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，槲皮素、山柰酚線性回歸方程分別為

Y

＝4×10

X

－3783.5（

r

＝1.0000），

Y

＝4.8×10

X

－1.41×10（

r

＝0.9998），線性范圍分別為0.9 ～28 μg·mL和1.4 ～42 μg·mL。2.5.3 精密度試驗 精密吸取同一對照品溶液，連續(xù)進樣6 次，結(jié)果槲皮素、山柰酚峰面積的

RSD

值分別為2.1%、1.3%，結(jié)果表明儀器精密度較好。2.5.4 重復(fù)性試驗 取“2.4”項下供試品溶液6 份，進樣測定，計算得槲皮素、山柰酚峰面積的

RSD

值分別為3.5%、3.5%，表明該方法的重復(fù)性較好。2.5.5 穩(wěn)定性試驗 取“2.4”項下同一供試品溶液，分別在0、2、4、6、8、12 h 進樣測定，結(jié)果槲皮素、山柰酚峰面積的

RSD

值分別為2.0%、1.5%，表明供試品溶液在12 h 內(nèi)穩(wěn)定。2.5.6 加樣回收試驗 分別精密量取“2.1”項下已知含量的樣品5 mL 6 份，分別加入0.02 mg·mL槲皮素對照品溶液和0.035 mg·mL山柰酚對照品溶液適量，按照“2.4”項下方法制備供試品溶液，進樣檢測，計算槲皮素、山柰酚平均加樣回收率分別為98.6%和100.1%，

RSD

依次為2.6%和4.0%，結(jié)果表明該方法準(zhǔn)確度良好。

2.6 干膏得率測定[2]

精密量取“2.1”項下樣品溶液25 mL，置于已干燥至恒重的陶瓷蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，再置于恒溫鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)105 ℃恒溫干燥3 h，冷卻至室溫，迅速稱定重量，計算干膏得率。

2.7 綜合評分

2.7.1 CRITIC 法計算權(quán)重 將方差分析的試驗數(shù)據(jù)經(jīng)過線性插值處理，即[指標(biāo)成分值＝（實測值－最小值）／（最大值－最小值）]，消除單位量綱后，計算各指標(biāo)對比強度（

s

）、沖突性（

δ

）、綜合權(quán)重（

c

）與權(quán)重（

ω

），結(jié)果見表1。由表1 可知，槲皮素、山柰酚、干膏得率經(jīng)CRITIC 法計算得到的客觀權(quán)重分別為0.2504、0.2460、0.5036。

表1 CRITIC 法各指標(biāo)數(shù)值
Tab 1 Index values of CRITIC method

考察指標(biāo)槲皮素山柰酚干膏得率si23.733423.362327.8561 δi 0.5340 0.5330 0.9150 ci12.673612.452125.4883 ωi 0.2504 0.2460 0.5036

2.7.2 AHP 法計算權(quán)重 根據(jù)方中各成分的藥理作用強弱和君臣佐使配伍規(guī)律，將干膏得率和指標(biāo)性成分的重要性作為權(quán)重指標(biāo)予以指標(biāo)量化，構(gòu)建成對比較的判斷優(yōu)先矩陣，各指標(biāo)的優(yōu)先順序：槲皮素＝山柰酚＞干膏得率，賦予各項指標(biāo)的相對評分，經(jīng)層次分析后的結(jié)果見表2。

表2 指標(biāo)成對比較優(yōu)先判斷矩陣
Tab 2 Priority judgment matrix for paired comparison of indicators

指標(biāo)成分槲皮素山柰酚干膏得率槲皮素114山柰酚114干膏得率1/41/41

根據(jù)表2 評分結(jié)果，計算得到槲皮素、山柰酚、干膏得率的權(quán)重系數(shù)分別為0.4444、0.4444、0.1111。一致性比例分子（CR）＜0.1，即指標(biāo)優(yōu)先比較矩陣通過一致性檢驗，權(quán)重系數(shù)有效。

2.7.3 CRITIC-AHP 通過CRITIC 法和AHP 法分別計算得到三金排石合劑中槲皮素、山柰酚及干膏得率的相關(guān)權(quán)重，復(fù)合權(quán)重（

ω

）＝

ω

ω

/∑

ω

ω

，按公式計算得槲皮素、山柰酚及干膏得率復(fù)合權(quán)重分別為0.4023、0.3953、0.2023。

2.8 Box-behnken 響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝

2.8.1 單因素試驗 參考文獻進行相關(guān)的預(yù)試驗，根據(jù)結(jié)果選定加水量（A）、提取時間（B）、提取次數(shù)（C）等連續(xù)變量作為影響因素進行單因素試驗，由單因素試驗的結(jié)果設(shè)計響應(yīng)面試驗各因素的水平范圍，因素水平見表3。

表3 響應(yīng)面試驗因素與水平
Tab 3 Factor and level of response surface methodology

因素水平－101 A 加水量/倍81012 B 提取時間/h0.511.5 C 提取次數(shù)/次123

2.8.2 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果 由綜合評價指標(biāo)對水提取工藝的影響，結(jié)合各項指標(biāo)對其進行運算，確定綜合評分（

Y

）＝[（槲皮素含量/槲皮素最大含量）×0.4023 ＋（山柰酚含量/山柰酚最大含量）×0.3953 ＋（干膏率含量/干膏率最大含量）×0.2023]×100。

根據(jù)響應(yīng)面的組合設(shè)計原理，采用Design Expert 8.0.6 軟件，選擇Box-Behnken 擬合模型，設(shè)置5 個中心試驗點，以3 個指標(biāo)總含量的綜合評分為響應(yīng)值，設(shè)計出17 個試驗點的試驗方案，對加水量、提取時間、提取次數(shù)進行研究，結(jié)果見表4。

表4 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果
Tab 4 Design and results of response surface methodology

試驗號A.加水量B.提取時間C.提取次數(shù)槲皮素/（mg·g－1）山柰酚/（mg·g－1）干膏得率/%綜合評分1－1010.032 330.056 0623.911776.4847 2 1 1 0 0.031 000.052 4822.366372.2465 3－100.040 220.058 4321.526689.9235 4 1 0－10.030 160.050 0715.743965.0890 1 5－1100.030 130.053 4020.385170.3987 6 0 0 0 0.037 680.058 8221.838281.0887 7－10－10.024 850.042 4213.076954.3207 8 1 0 1 0.032 870.050 6423.928574.1956 0.038 440.066 8525.968289.1208 10－1－100.038 220.063 7919.282482.1411 110－1－10.031 880.054 3513.628867.1908 1201－10.032 310.050 6415.246766.9264 130－110.044 850.076 7922.017996.9135 140000.035 170.060 4421.938579.7510 150000.035 940.057 4020.783177.9732 160000.040 340.067 6121.413487.6696 170000.037 290.065 0021.577283.7178 9 0 1 1

2.8.3 試驗結(jié)果分析 采用Design Expert 8.0.6對17 個試驗點對應(yīng)的數(shù)據(jù)進行方差分析，結(jié)果見表5，其中

P

＜0.05 為顯著項，

P

＜0.01 為極顯著項，同時得到三因素與綜合評分的三元二次方程：

Y

＝82.04 ＋2.26

A

－4.68

B

＋10.40

C

－1.48

AB

－3.26

AC

－1.88

BC

－7.94

A

＋4.58

B

－6.58

C

。

表5 方差分析
Tab 5 Analysis of variance

來源平方和 自由度均方F 值P 值模型1679.429186.607.790.0065 A 40.99140.991.710.2321 B 175.561175.567.330.0303 C 865.021865.0236.110.0005 AB8.8018.800.370.5635 AC42.62142.621.780.2240 BC14.17114.170.590.4670 A2265.381265.3811.080.0126 B288.18188.183.680.0965 C2182.221182.227.610.0282殘差167.68723.35失擬項110.49336.832.580.1915誤差57.19414.30總和1847.1116

該模型顯著性檢驗

P

＝0.0065 ＜0.05，模型表現(xiàn)為顯著，二次多項式回歸模型具有顯著性意義；模型的失擬項

P

＝0.1915 ＞0.05，提示模型與實測數(shù)據(jù)擬合度好，模型值的運算可替代實際試驗值對結(jié)果進行預(yù)測分析；提取工藝考察的3個因素通過分析相應(yīng)

P

值可知，各因素影響大小依次為：C ＞B ＞A，即對三金排石合劑中所含的各項指標(biāo)及綜合評分影響最大的是提取次數(shù)，其次是提取時間和加水量。另外，模型的決定性系數(shù)

R

＝0.9092，表明該模型可解釋3 個因素90.92%的變異性，校正決定系數(shù)

R

A＝0.7925，說明該模型擬合程度良好，且能解釋79.25%響應(yīng)值的變化，即模型可用于對三金排石合劑的綜合評分及各項指標(biāo)的預(yù)測。

根據(jù)分析結(jié)果繪制響應(yīng)面3D 圖，對加水量、提取時間、提取次數(shù)這三個因素每兩兩之間的交互作用強弱進行比較，結(jié)果見圖2。

圖2 加水量（A）、提取時間（B）和提取次數(shù)（C）交互作用的三維響應(yīng)面圖Fig 2 3D response surface of water adding amount（A），extraction time（B）and extraction times（C）

從三個交互因素形成的曲面陡峭程度可以看出，提取次數(shù)與加水量的交互影響最大，影響綜合評分的主次順序為提取次數(shù)＞加水量＞提取時間，以上分析與表5 中方差分析的結(jié)果吻合。

采用Design Expert 8.0.6 預(yù)測最佳提取工藝參數(shù)：加水量為10.09、提取時間為0.5 h、提取次數(shù)為2.92 次。綜合實際操作的便利性，調(diào)整為：加水量為10 倍量、提取時間為0.5 h、提取次數(shù)為3 次，在此條件下模型預(yù)測的綜合評分為97.05。

2.9 驗證試驗

按照優(yōu)化條件進行3 次平行試驗，實際測得綜合評分均值為97.50，與預(yù)測值相比相對誤差小于5%，表明，本試驗建立的回歸模型適用于三金排石合劑中各種指標(biāo)的綜合評分的預(yù)測，與實際測定數(shù)值擬合度較好，優(yōu)化得到的提取工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠，結(jié)果見表6。

表6 驗證結(jié)果
Tab 6 Verification test

編號槲皮素/（mg·g－1）山柰酚/（mg·g－1）干膏得率/%綜合評分10.041 150.070 1720.772299.3521 20.039 960.068 3621.450196.6734 30.041 010.067 2920.754396.4611

3 討論

3.1 鹽酸加入量對槲皮素、山柰酚含量的影響

對供試品溶液制備方法中鹽酸加入量（5、6、7、8、9、10、11 mL）進行考察，結(jié)果顯示，槲皮素、山柰酚的含量呈現(xiàn)先增加再遞減的趨勢，當(dāng)鹽酸加入量為6 mL 時兩者含量達到最大，因此，最終確定其加入量為6 mL。

3.2 權(quán)重方法的選取

本試驗采用CRITIC-AHP 復(fù)合加權(quán)法計算權(quán)重。CRITIC 法是從實際數(shù)據(jù)出發(fā)，利用指標(biāo)值所反映的客觀信息確定權(quán)重的一種方法，此法容易忽視指標(biāo)間的輕重關(guān)系。AHP 法是基于研究者的經(jīng)驗，人為確定各項指標(biāo)的重要性進行比較而賦權(quán)的方法，能切合實際考慮試驗中各指標(biāo)的優(yōu)選順序，但主觀性較強，易受影響，結(jié)果不具有普遍性。AHP-CRITIC 法復(fù)合加權(quán)法共具兩種方法的優(yōu)點，主客觀并重，其結(jié)果具有穩(wěn)定性和可靠性，且能區(qū)分?jǐn)?shù)據(jù)信息。

3.3 Box-Behnken 響應(yīng)面法

本研究采用Box-Behnken 響應(yīng)面法對三金排石合劑的提取工藝進行了研究，通過多元二次回歸方程來擬合因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，能夠準(zhǔn)確表示試驗設(shè)計與優(yōu)化結(jié)果，與正交試驗相比準(zhǔn)確度更高、可預(yù)測性更強。該模型預(yù)測最佳工藝為加入加水量為10倍量水、提取時間為0.5 h、提取次數(shù)為3 次。驗證試驗結(jié)果與預(yù)測值相比，誤差小于5%，說明利用Box-Behnken 響應(yīng)面法結(jié)合AHP 法優(yōu)化三金排石合劑的提取工藝，方法科學(xué)、合理可行、穩(wěn)定可靠，為進一步開發(fā)中藥治療泌尿系結(jié)石提供參考依據(jù)。