程紅，田銳（.華中科技大學(xué)分析測(cè)試中心，武漢 430074；.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院，武漢 430030）

膠原蛋白是哺乳動(dòng)物體內(nèi)最豐富的蛋白質(zhì)，是細(xì)胞外基質(zhì)中的主要結(jié)構(gòu)蛋白，廣泛存在于皮膚、骨骼、肌腱、韌帶和其他結(jié)締組織中，主要用于止血海綿、軟組織增強(qiáng)注射物、細(xì)胞產(chǎn)品基質(zhì)以及藥物輸送的載體。其中，膠原蛋白海綿具有吸收組織滲出物、透氣性好、促進(jìn)上皮細(xì)胞生長(zhǎng)和肉芽組織生成等優(yōu)良特性，可應(yīng)用于止血和創(chuàng)面愈合。手術(shù)創(chuàng)傷引起不同程度的出血和滲血直接影響手術(shù)的治療效果。手術(shù)中采用物理、機(jī)械或化學(xué)的止血方法均存在一定的局限性和不良反應(yīng)，而膠原蛋白類(lèi)的止血敷料則是一種有益的補(bǔ)充，如在膽囊切除手術(shù)、T 管引流手術(shù)、闌尾切除手術(shù)、胃大部切除手術(shù)、肝葉切除手術(shù)、胰十二指腸切除術(shù)、左半或右半結(jié)腸切除手術(shù)（切除后端-端吻合）、脾臟切除等相關(guān)手術(shù)中均能獲得穩(wěn)定而滿(mǎn)意的止血效果。在大多數(shù)的手術(shù)操作中，在切除的斷端或出血的局部，應(yīng)用1 ～2 片膠原蛋白海綿短暫壓迫即可達(dá)到止血的目的。

膠原蛋白和膠原蛋白海綿的共同特點(diǎn)是三螺旋結(jié)構(gòu)：三條

α

多肽鏈形成超螺旋構(gòu)象，出現(xiàn)頻率最高的氨基酸序列是-Gly-Y-Z，其中甘氨酸（Gly）代表每隔兩個(gè)氨基酸就出現(xiàn)的重復(fù)殘基，Y 和Z 是脯氨酸（Pro）和羥脯氨酸（Pro-OH）。由三條相同大小的多肽鏈組成的三螺旋結(jié)構(gòu)是膠原的基本結(jié)構(gòu)單元，其分子量約為285 kDa。使用質(zhì)譜直接測(cè)定天然膠原蛋白的分子量仍然具有挑戰(zhàn)性，電噴霧電離質(zhì)譜適合分析相對(duì)分子質(zhì)量在20 萬(wàn)以下的極性化合物，對(duì)于膠原蛋白來(lái)說(shuō)，通常是在一定轉(zhuǎn)變溫度內(nèi)，當(dāng)三螺旋結(jié)構(gòu)由三股膠原轉(zhuǎn)變?yōu)閱捂湑r(shí)測(cè)定。使用熱裂解氣質(zhì)聯(lián)用儀（Py-GCMS）測(cè)試膠原蛋白可以通過(guò)裂解產(chǎn)物分析天然蛋白的分子結(jié)構(gòu)，為分析蛋白質(zhì)中的氨基酸組成提供了另一種思路。同時(shí)，新一代商用拉曼儀器促進(jìn)了拉曼（Raman）光譜在生物科技和食品工業(yè)中的諸多應(yīng)用，Raman 光譜已成為蛋白質(zhì)科學(xué)的一種通用工具。圓二色（CD）光譜則可以分析膠原蛋白的三螺旋構(gòu)象是否得以保留。目前，膠原蛋白海綿應(yīng)用最廣泛的滅菌方法是

γ

-射線(xiàn)輻照。該方法被認(rèn)為是最簡(jiǎn)單和有效的滅菌方法，不會(huì)產(chǎn)生有毒物質(zhì)，不會(huì)破壞化學(xué)鍵，不會(huì)降低拉伸強(qiáng)度和模量，從而不會(huì)從根本上影響到被輻照的材料。但是

γ

-射線(xiàn)輻照對(duì)于膠原蛋白三螺旋結(jié)構(gòu)的影響尚不明確。本文使用Py-GCMS 對(duì)滅菌前后的膠原蛋白海綿的三螺旋結(jié)構(gòu)進(jìn)行測(cè)試，研究其輻照前后的結(jié)構(gòu)變化，并使用Raman 光譜觀察輻照對(duì)膠原蛋白海綿三螺旋結(jié)構(gòu)的影響，進(jìn)一步通過(guò)對(duì)其CD 光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算來(lái)分析判斷輻照前后膠原蛋白海綿三螺旋結(jié)構(gòu)的完整性是否發(fā)生改變。該工作可為膠原蛋白相關(guān)科研工作提供實(shí)驗(yàn)參考，并可為膠原蛋白海綿的生產(chǎn)企業(yè)在研究輻照滅菌的劑量和時(shí)長(zhǎng)方面的測(cè)試提供技術(shù)支撐。

1 材料

1.1 儀器

Agilent 7890A/5975C 氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國(guó)Agilent 公司，配有美國(guó)CDS 公司 Pyroprobe 6150型熱裂解儀）；HR-800 型激光共焦Raman 光譜儀（Horiba Jobin Yvon 公司）；J-810 型圓二色光譜儀（日本Jasco 公司）。

所有試劑均為分析純；實(shí)驗(yàn)用水為超純水（電阻率為18 MΩ·cm）。

1.2 樣品

未輻照膠原蛋白海綿：由武漢某生物材料有限公司提供，經(jīng)由采用酸酶聯(lián)合法提取自牛跟腱的膠原蛋白原液（批號(hào)為YF19070001）冷凍干燥得到，使用前未做任何處理。輻照后膠原蛋白海綿：由同一生物材料有限公司提供，系同批號(hào)的未輻照膠原蛋白海綿經(jīng)過(guò)

γ

-射線(xiàn)輻照后的樣品。

2 方法與結(jié)果

2.1 Py-GCMS

熱裂解參數(shù)：熱裂解溫度500℃；裂解時(shí)間6 s；閥溫325℃；傳輸線(xiàn)溫度350℃。色譜條件：色譜柱HP-5ms 彈性石英毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm，美國(guó)Agilent 公司）；載氣高純氦；柱流速1 mL·min；采用分流進(jìn)樣，分流比20∶1；進(jìn)樣口溫度280℃；柱溫40℃保持1 min，6℃·min升至300 ℃，保持10 min。

質(zhì)譜條件：離子源EI；離子源溫度230℃；四極桿溫度150℃；質(zhì)量掃描范圍30 ～600

m/z

。準(zhǔn)確稱(chēng)取輻照前后的膠原蛋白海綿各1 mg，分別填入石英管，經(jīng)熱裂解后進(jìn)行GC-MS 全掃描分析，得到的總離子流圖見(jiàn)圖1。輻照前后的總離子流圖使用相同的積分參數(shù)進(jìn)行處理，經(jīng)NIST14 譜庫(kù)檢索得到譜峰對(duì)應(yīng)的化合物，選取匹配度大于60%的產(chǎn)物列于表1，采用峰面積歸一化法計(jì)算面積百分比含量。表1 中產(chǎn)物主要分為乙腈類(lèi)、吡咯環(huán)及衍生物類(lèi)、酰胺類(lèi)、芳烴和烷烴幾種，其中含吡咯環(huán)化合物占總裂解產(chǎn)物的比例分別為28%和23%，較好地說(shuō)明了膠原蛋白海綿的結(jié)構(gòu)組成。

表1 輻照前后膠原蛋白海綿裂解產(chǎn)物
Tab 1 Collagen sponge pyrolysis products before and after the irradiation

編號(hào)保留時(shí)間/min裂解產(chǎn)物結(jié)構(gòu)式可能的來(lái)源峰面積百分比/%輻照前 輻照后11.763 乙腈脯氨酸1.381.21 22.539 乙酸images/BZ_74_1304_490_1412_512.pngimages/BZ_74_1304_531_1412_603.png提取使用的溶劑3.024.47 33.535 二甲基二硫images/BZ_74_1293_622_1423_662.png二硫鍵0.550.51 43.774 吡咯images/BZ_74_1318_681_1398_752.png脯氨酸3.113.52 53.910 甲苯images/BZ_74_1297_770_1419_838.png其他蛋白1.201.29 64.602 乙酰胺images/BZ_74_1307_856_1410_933.png脯氨酸和羥脯氨酸0.540.63 74.725 1-乙基-1H-吡咯images/BZ_74_1296_952_1421_1008.png脯氨酸和羥脯氨酸0.460.48 84.880 2-甲基吡啶images/BZ_74_1302_1027_1414_1099.png不明0.140.12 95.275 3-甲基-1H-吡咯images/BZ_74_1292_1118_1425_1177.png脯氨酸和羥脯氨酸0.770.80 105.450 2-甲基-1H-吡咯images/BZ_74_1304_1196_1412_1269.png脯氨酸和羥脯氨酸0.180.19 115.605 糠醇images/BZ_74_1293_1288_1424_1338.png不明0.070.09 125.696 間二甲苯images/BZ_74_1295_1357_1421_1426.png其他蛋白0.070.07 135.883 4-甲基吡啶images/BZ_74_1298_1445_1418_1512.png不明0.060.09 146.239 丙酰胺images/BZ_74_1293_1531_1423_1595.png脯氨酸和羥脯氨酸0.080.09 156.342 苯乙烯images/BZ_74_1301_1614_1415_1682.png其他蛋白0.120.13 167.209 3-乙基-1H-吡咯images/BZ_74_1280_1701_1436_1761.png脯氨酸和羥脯氨酸0.360.51 177.254 2，3-二甲基-1H-吡咯images/BZ_74_1297_1780_1419_1872.png脯氨酸和羥脯氨酸0.14/187.474 2，5-二甲基-1H-吡咯images/BZ_74_1304_1890_1413_1961.png脯氨酸和羥脯氨酸0.170.17 197.675 3-乙基-1H-吡咯images/BZ_74_1279_1980_1438_2037.png脯氨酸和羥脯氨酸0.140.15 207.798 2，3-二甲基-1H-吡咯images/BZ_74_1300_2056_1416_2134.png脯氨酸和羥脯氨酸0.060.06 218.225 二甲基三硫images/BZ_74_1292_2153_1425_2200.png二硫鍵0.220.27 228.328 2-乙基-4-甲基-1H-吡咯images/BZ_74_1278_2219_1439_2288.png脯氨酸和羥脯氨酸0.060.05 238.464 苯胺images/BZ_74_1289_2307_1428_2369.png不明0.05/248.949 3-乙?；?1-甲基吡咯images/BZ_74_1284_2388_1432_2454.png脯氨酸和羥脯氨酸0.05/259.137 2-乙基-4-甲基-1H-吡咯images/BZ_74_1269_2473_1447_2566.png脯氨酸和羥脯氨酸0.050.05 269.24 2-乙基-4-甲基-1H-吡咯279.305 乙酰胺images/BZ_74_1272_2585_1445_2657.pngimages/BZ_74_1235_2676_1482_2749.png脯氨酸和羥脯氨酸0.180.25不明0.05/289.363 2-氨基吡啶images/BZ_74_1275_2768_1441_2834.png不明0.490.68 299.590 2-乙基-4-甲基-1H-吡咯images/BZ_74_1279_2853_1438_2923.png脯氨酸和羥脯氨酸0.180.18 309.700 2-乙基吡啶images/BZ_74_1290_2942_1426_3003.png不明0.170.17 31 10.165 4-乙基-3，5-二甲基-1H-吡咯images/BZ_74_1281_3022_1436_3129.png脯氨酸和羥脯氨酸0.040.07

續(xù)表1

編號(hào)保留時(shí)間/min裂解產(chǎn)物結(jié)構(gòu)式可能的來(lái)源峰面積百分比/%輻照前 輻照后32 10.444 1-戊基-1H-吡咯33 10.663 2-乙?；量﹊mages/BZ_75_1269_454_1447_542.pngimages/BZ_75_1305_558_1404_636.png脯氨酸和羥脯氨酸0.070.11脯氨酸和羥脯氨酸0.070.17 34 10.78 1，3-辛二烯images/BZ_75_1202_662_1515_704.png脂肪0.130.17 35 11.013 對(duì)甲酚images/BZ_75_1281_723_1431_778.png其他蛋白0.170.40 36 11.052 間甲酚images/BZ_75_1291_798_1419_870.png其他蛋白0.20/37 11.543 3-乙基-2，5-二甲基-1H-吡咯38 11.601 2-氨基-3-甲基吡啶39 11.685 3-乙基-2，5-二甲基-1H-吡咯40 11.88 2，3-環(huán)戊烯并吡啶images/BZ_75_1276_893_1432_967.pngimages/BZ_75_1292_990_1421_1065.pngimages/BZ_75_1294_1086_1411_1194.pngimages/BZ_75_1299_1223_1411_1295.png脯氨酸和羥脯氨酸0.09/不明0.10/脯氨酸和羥脯氨酸0.130.11不明0.190.40 41 11.944 2，3，4，5-四氫吡啶images/BZ_75_1318_1318_1399_1385.png不明0.12/42 12.242 對(duì)氨基苯甲醚images/BZ_75_1270_1404_1446_1461.png其他蛋白0.09/43 12.332 吲哚images/BZ_75_1293_1480_1410_1550.png其他蛋白0.12/44 12.501 苯乙腈images/BZ_75_1285_1576_1421_1636.png其他蛋白0.650.78 45 13.057 3-氰基吡咯images/BZ_75_1270_1659_1446_1709.png脯氨酸和羥脯氨酸1.722.31 46 14.952 苯代丙腈images/BZ_75_1281_1728_1436_1820.png其他蛋白0.290.35 47 15.502 2-吡啶甲酰胺48 16.233 吲嗪49 16.576 2-哌啶基乙酸50 17.481 1H-吡咯-2-甲酰胺51 17.663 2-吡咯甲酸甲酯52 18.206 2-乙?；?5-甲基咪唑53 24.552 2-isopropylidene-5，6，7，8-tetrahydro-2H-imidazo[1，2-a]pyridin-3-oneimages/BZ_75_1275_1839_1440_1912.pngimages/BZ_75_1290_1931_1427_2016.pngimages/BZ_75_1269_2035_1442_2108.pngimages/BZ_75_1285_2133_1432_2228.pngimages/BZ_75_1297_2247_1419_2330.pngimages/BZ_75_1284_2349_1432_2428.pngimages/BZ_75_1281_2447_1433_2534.png不明0.800.97脯氨酸和羥脯氨酸0.260.30不明0.32/脯氨酸和羥脯氨酸2.492.52脯氨酸和羥脯氨酸2.44/脯氨酸和羥脯氨酸0.240.33脯氨酸和羥脯氨酸0.760.77 54 24.739*O N N兩分子羥脯氨酸縮合脫去兩分子水和四個(gè)氫4.014.31 O 55 25.198 2H-naphtho[1，8-bc]thiophene，2-methyl-56 25.425 5-苯基-1，4-二甲基咪唑images/BZ_75_1298_2708_1412_2817.pngimages/BZ_75_1282_2838_1428_2927.png不明0.450.33不明1.111.78 57 25.651 cyclopropane，1-pentyl-2-propyl-images/BZ_75_1199_2952_1518_2997.png脂肪1.23/58 26.136 pyrrolo[1，2-a]pyrazine-1，4-dione，hexahydro-images/BZ_75_1284_3022_1432_3128.png脯氨酸和甘氨酸縮合脫去兩分子水4.834.15

續(xù)表1

注（Note）：結(jié)構(gòu)式為推導(dǎo)得到（The structural formula was derived）。

編號(hào)保留時(shí)間/min裂解產(chǎn)物結(jié)構(gòu)式可能的來(lái)源峰面積百分比/%輻照前 輻照后59 26.964 thiazolo[4，5-f]quinoline，7-methyl images/BZ_76_1254_444_1462_528.png不明0.170.30 60 27.126 exo-2-Methyl-endo-2-(acetylamino)norbornane images/BZ_76_1287_547_1429_613.png不明0.17/61 28.692*images/BZ_76_1291_631_1425_769.png兩分子脯氨酸縮合脫去兩分子水1.270.82images/BZ_76_1180_788_1536_849.png62 29.067 棕櫚酸脂肪3.562.04 63 29.468 2H-pyrrol-2-one，1，5-dihydro-4-(1-pyrrolidinyl)-images/BZ_76_1272_868_1444_952.png脯氨酸和羥脯氨酸0.37/64 30.47 1H-indolizino[8，7-b]indole-1-propanol，.beta.-ethyl-2，3，5，6，11，11b-h exahydro-images/BZ_76_1225_974_1492_1080.png脯氨酸和羥脯氨酸0.220.11 65 31.667 油酸images/BZ_76_1226_1099_1490_1220.png脂肪0.450.34 66 32.107 硬脂酸images/BZ_76_1198_1238_1518_1290.png脂肪3.92.01 67 32.767*images/BZ_76_1194_1309_1346_1438.pngimages/BZ_76_1383_1317_1522_1438.png羥脯氨酸和甘氨酸縮合脫去兩分子水；羥脯氨酸和脯氨酸縮合脫去兩分子水2.910.42 68 37.838 正二十六烷脂肪0.140.03 69 39.054 正二十七烷脂肪0.160.04 70 40.238 正二十八烷images/BZ_76_1180_1477_1536_1503.png脂肪0.220.05 71 40.626 角鯊烯images/BZ_76_1143_1594_1574_1617.pngimages/BZ_76_1170_1641_1546_1731.png脂肪0.16/72 41.377 正二十九烷脂肪0.250.06 73 43.912 膽固醇images/BZ_76_1121_1758_1596_1783.pngimages/BZ_76_1204_1807_1513_2002.png提取物0.210.27

圖1 γ-射線(xiàn)輻照前后膠原蛋白海綿的Py-GCMS 總離子流圖Fig 1 Total ion chromatogram of Py-GCMS collagen sponge before and after the gamma irradiation

膠原蛋白三螺旋是由三條相同或不同的膠原蛋白肽相互纏繞得到特征的右手三螺旋，其中每一條多肽鏈各自采取左手螺旋的聚脯氨酸Ⅱ型（polyproline type Ⅱ，PPⅡ）螺旋結(jié)構(gòu)，見(jiàn)圖2，通過(guò)熱裂解質(zhì)譜可以觀察到膠原蛋白組成中的三種氨基酸兩兩通過(guò)肽鍵縮合形成的哌嗪二酮（diketopiperazine，DKP）特征結(jié)構(gòu)，在裂解產(chǎn)物列表中可見(jiàn)5 個(gè)DKP 結(jié)構(gòu)，對(duì)應(yīng)峰編號(hào)為54、58、61、67（含兩個(gè)峰），其質(zhì)譜圖分別見(jiàn)圖3，對(duì)應(yīng)的產(chǎn)物分析見(jiàn)圖4。從圖4 中可以看出，兩分子氨基酸之間的縮合以羧酸和氨基反應(yīng)脫去兩分子水為主，而當(dāng)羥脯氨酸自身縮合時(shí)，由于結(jié)構(gòu)中還存在羥基，脫去了四分子水和四分子氫。這些DKP產(chǎn)物印證了膠原蛋白海綿的分子結(jié)構(gòu)。在總離子流圖中，輻照后的樣品第67 號(hào)峰高出現(xiàn)明顯下降，說(shuō)明輻照對(duì)于膠原蛋白海綿的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了一定影響，證實(shí)輻照導(dǎo)致了膠原蛋白三螺旋結(jié)構(gòu)中局部羥脯氨酸與甘氨酸和脯氨酸的連接丟失，自身的共價(jià)交聯(lián)度變低。值得注意的是，當(dāng)裂解溫度不變而裂解時(shí)長(zhǎng)加長(zhǎng)至1 min 時(shí)或樣品風(fēng)干后，結(jié)果類(lèi)似，即第67 號(hào)峰出現(xiàn)明顯下降或消失，這說(shuō)明輻照、溫度、失水等因素對(duì)羥脯氨酸與甘氨酸和脯氨酸的影響一致，而且羥脯氨酸與甘氨酸和脯氨酸的連接相較其他連接而言對(duì)這些因素更為敏感。

圖2 膠原蛋白三螺旋結(jié)構(gòu)片段的平面圖（a）和球-棒圖（b）Fig 2 Plane graph （a） and ball-and-stick graph（b） of segments of triple-helix collagen

圖3 Hyp-Hyp（a），Pro-Gly（b），Pro-Pro（c），Gly-Hyp（d），Pro-Hyp（e）的DKP 質(zhì)譜圖Fig 3 DKP mass spectra of Hyp-Hyp（a），Pro-Gly（b），Pro-Pro（c），Gly-Hyp（d），and Pro-Hyp（e）

圖4 裂解產(chǎn)物中DKP 的分析Fig 4 DKP in pyrolysis products

2.2 Raman

將輻照前后的膠原蛋白海綿放在樣品臺(tái)上進(jìn)行常溫Raman 光譜測(cè)試。激發(fā)源為Nd-YAG：532 nm，采用600 gr/mm 光柵，×50LWD 物鏡，200 μm 針孔，60 s 曝光時(shí)間，為避免激光高溫灼傷樣品，在樣品表面覆蓋一片薄的石英片。測(cè)試前，使用單晶硅對(duì)峰位進(jìn)行校準(zhǔn)。測(cè)試得到Raman 光譜圖，見(jiàn)圖5。

圖5 γ-射線(xiàn)輻照前后膠原蛋白海綿的拉曼光譜圖Fig 5 Raman spectra of collagen sponge before and after the gamma irradiation

對(duì)Raman 光譜圖進(jìn)行基線(xiàn)校正和歸一化處理，基線(xiàn)校正采用Labspec5 軟件（Labspec；Horiba Jobin Yvon，Japan）。在光譜分析中沒(méi)有使用去噪或平滑處理。脯氨酸和羥脯氨酸吡咯烷環(huán)上亞甲基的反對(duì)稱(chēng)和對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng)峰，以及酰胺A 帶、Ⅰ帶和Ⅲ帶是Raman 光譜的主要組成部分。酰胺Ⅱ帶在紅外光譜中很強(qiáng)，但在Raman 光譜中很弱。主要譜峰的歸屬見(jiàn)表2。獲得的Raman光譜數(shù)據(jù)在

γ

-射線(xiàn)輻照前后幾乎相同，但當(dāng)用最高峰歸一化時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)輻照后的譜峰強(qiáng)度普遍得到了增強(qiáng)，說(shuō)明輻照對(duì)膠原的交聯(lián)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了一定影響。根據(jù)Born-vonkamann 周期性條件，Raman 頻率滿(mǎn)足

λ

＝

π/

N，式中，

π

為常數(shù)，N 是碳原子數(shù)目，由于膠原蛋白中N 值超過(guò)10 000，所以少量碳原子數(shù)目變化不會(huì)影響Raman 位移。因此，在本實(shí)驗(yàn)中，輻照前后樣品的Raman 頻移變化不大。但強(qiáng)度有變化，是由于Raman 光譜對(duì)氫鍵網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)和酰胺附近的條件很敏感，共價(jià)交聯(lián)鏈局部斷裂后氫鍵作用力減弱，使得分子鍵的振動(dòng)加劇，從而強(qiáng)度得以增強(qiáng)。

表2 膠原蛋白海綿拉曼光譜數(shù)據(jù)解析
Tab 2 Raman spectra data of collagen sponge

輻照前輻照后波數(shù)/cm－1 強(qiáng)度/%波數(shù) /cm－1 強(qiáng)度 /%歸屬3321 233313 25 ν 對(duì)稱(chēng)（N-H），酰胺A 帶29411002941100 ν 反對(duì)稱(chēng)（CH2）2883 452883 48 ν 對(duì)稱(chēng)（CH2）1664 231664 32 ν 反對(duì)稱(chēng)（C ＝O），酰胺Ⅰ帶1448 281449 36 δ（CH2），亞甲基的剪式振動(dòng)1265 251265 32 ν（C-N），δ（N-H），酰胺Ⅲ帶1243 281243 35 ν（C-N），δ（N-H），酰胺Ⅲ帶936 28 936 33 ν（C-C），脯氨酸和羥脯氨酸中與羰基相連的碳碳鍵伸縮振動(dòng)854 25 854 30 ν（C-C），脯氨酸和羥脯氨酸中的吡咯烷環(huán)骨架振動(dòng)

2.3 CD 光譜

準(zhǔn)確稱(chēng)取輻照前后的膠原蛋白海綿，使用0.01 mol·L乙酸水溶液溶解稀釋為0.1 mg·mL的溶液，于4 ℃冰箱放置過(guò)夜，測(cè)試前于室溫下放置1 h，注入1 mm 光程的圓形比色皿中（型號(hào)：31/B/Q/1，Starna Scientific Ltd.Hainault，Essex IG6 3UT，United Kingdom）。設(shè)置帶寬為1 nm，響應(yīng)時(shí)間0.5 s，標(biāo)準(zhǔn)靈敏度，掃描范圍為190 ～260 nm。為了防止CD 光譜變形，掃描速度（nm·s）和響應(yīng)時(shí)間（s）的乘積應(yīng)小于半高寬的10%（蛋白質(zhì)光譜的半高寬通常約為15 nm）。本實(shí)驗(yàn)設(shè)置響應(yīng)時(shí)間為0.5 s，掃描速度為100 nm·min，再通過(guò)數(shù)據(jù)平滑處理降低噪聲，得到高質(zhì)量的CD 光譜圖，見(jiàn)圖6。

圖6 室溫下γ-射線(xiàn)輻照前（a）和輻照后（b）膠原蛋白海綿溶液的CD 光譜圖Fig 6 CD spectra of collagen solution before（a）and after（b）the gamma irradiation at room temperature

對(duì)于天然膠原蛋白，理想的CD 光譜是出現(xiàn)221 nm 處的明顯正峰和198 nm 處的負(fù)峰。在本研究中，醫(yī)用膠原海綿樣品的三螺旋構(gòu)象由圖6 中的CD 光譜證實(shí)。CD 光譜圖中顯示負(fù)峰和正峰，這表明膠原海綿在

γ

-射線(xiàn)輻照前后呈正常的三螺旋結(jié)構(gòu)。此外，可以使用兩個(gè)峰（221 nm 處的正峰，198 nm 附近的負(fù)峰）的強(qiáng)度比值計(jì)算的正負(fù)峰強(qiáng)度比（ratio of positive to negative peak intensity，Rpn）用于估計(jì)溶液中的三螺旋構(gòu)象。在本實(shí)驗(yàn)中，兩個(gè)膠原海綿樣品顯示出良好的Rpn，輻照前Rpn 為0.15，輻照后Rpn 為0.11，表明輻照滅菌后保留了三螺旋結(jié)構(gòu)。

3 結(jié)論

對(duì)于膠原蛋白產(chǎn)品來(lái)說(shuō)，完整的三螺旋結(jié)構(gòu)是保持其穩(wěn)定性、機(jī)械性能和生物活性的重要保證，對(duì)膠原蛋白三螺旋結(jié)構(gòu)的理解也將有利于指導(dǎo)用于生物醫(yī)學(xué)和納米技術(shù)的人工膠原材料的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)，因此有必要對(duì)其三螺旋結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。本文聯(lián)合Py-GCMS 質(zhì)譜法和兩種光譜方法（Raman 及CD）對(duì)輻照前后膠原蛋白海綿的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了討論，詳細(xì)分析了熱裂解產(chǎn)物，并對(duì)組成膠原蛋白的3 種氨基酸兩兩通過(guò)肽鍵縮合形成的DKP 結(jié)構(gòu)進(jìn)行了推導(dǎo)，證實(shí)了膠原蛋白的三螺旋結(jié)構(gòu)在輻照后發(fā)生了肽鏈的變化。Raman 光譜數(shù)據(jù)進(jìn)一步佐證了這一變化，局部肽鏈斷裂導(dǎo)致交聯(lián)度降低。通過(guò)對(duì)CD 光譜的計(jì)算和分析，結(jié)果表明，輻照前后醫(yī)用膠原蛋白海綿的三螺旋結(jié)構(gòu)得以保持。聯(lián)合質(zhì)譜法和光譜法對(duì)膠原蛋白進(jìn)行分析，有助于更好地理解其三螺旋結(jié)構(gòu)，為膠原蛋白相關(guān)科研和膠原蛋白海綿生產(chǎn)企業(yè)提供參考依據(jù)。