張盼，王鈺瑩，王婷，史永恒，2，劉繼平，2，徐倉寶，胡銳，2*，王川，2*（.陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，陜西 咸陽 72046；2.陜西省中醫(yī)藥管理局中藥藥效機(jī)制與物質(zhì)基礎(chǔ)重點(diǎn)研究室，陜西 咸陽 72046；.西安醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)與轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究所/陜西省缺血性心血管疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西安 7002）

吸煙是危害人類健康的主要因素之一。吸煙不僅對人類呼吸系統(tǒng)產(chǎn)生嚴(yán)重的損害，導(dǎo)致哮喘、慢性阻塞性肺病、肺癌等多種肺部疾病，而且也是冠心病、高血壓、中風(fēng)等多種疾病的危險(xiǎn)因子。煙草煙霧中有4000 多種化學(xué)物質(zhì)，其中尼古丁、一氧化碳、多環(huán)芳香烴和氧自由基等與心血管的損害直接相關(guān)。大量的臨床研究和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均證實(shí)，吸煙可以顯著增加心血管系統(tǒng)疾病的患病風(fēng)險(xiǎn)。據(jù)《中國心血管健康與疾病報(bào)告》報(bào)道，全球每年約190 萬人因煙草使用或二手煙暴露引發(fā)的冠心病而失去生命，約占全球因冠心病死亡的20%。內(nèi)皮素（endothelin，ET）是一種強(qiáng)烈且持久收縮血管的多肽，主要由血管中的內(nèi)皮細(xì)胞合成及分泌。內(nèi)皮素受體（endothelin receptor）有兩種亞型，分別為A 亞型（ETA）和B 亞型（ETB），在生理?xiàng)l件下，ETA 受體主要存在于血管平滑肌細(xì)胞中，介導(dǎo)血管收縮，而ETB 受體主要在血管內(nèi)皮細(xì)胞上表達(dá)，促進(jìn)一氧化氮和前列環(huán)素的產(chǎn)生，誘導(dǎo)血管舒張；然而，在病理?xiàng)l件下，ETB 受體在平滑肌細(xì)胞中大量表達(dá)，并且介導(dǎo)血管收縮。內(nèi)皮素及其受體與多種心血管疾病的發(fā)病相關(guān)，在高血壓和冠心病患者中，血管平滑肌上ETA 和ETB 受體上調(diào)。越來越多的證據(jù)表明，吸煙和血管痙攣可能與血管平滑肌細(xì)胞中內(nèi)皮素受體的上調(diào)有關(guān)。絲裂原活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase，MAPK） 信號通路主要包括胞外信號調(diào)節(jié)激酶1 和2（extracellular signal-regulated protein kinase 1 and 2，ERK1/2）、c-Jun N 端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）和P38 蛋白激酶通路，調(diào)控細(xì)胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，在心血管疾病中具有重要的作用。核因子

κ

B（nuclear factor-kappa B，NF-

κ

B） 是MAPK 下游的重要轉(zhuǎn)錄因子之一，調(diào)控基因的表達(dá)。MAPK/NF-

κ

B 信號通路的激活與動(dòng)脈血管收縮密切相關(guān)，大量的研究表明，低密度脂蛋白、細(xì)顆粒物PM和香煙煙霧顆粒（DSP）等均可以損傷動(dòng)脈血管，激活MAPK/NF-

κ

B 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄和翻譯，合成新的收縮性受體（如血栓素受體、腎上腺素受體和內(nèi)皮素受體等），導(dǎo)致血管平滑肌收縮，甚至引起血管痙攣。本課題組前期的研究也表明，DSP 通過ERK1/2 信號通路上調(diào)腎上腺素

α

受體誘導(dǎo)血管平滑肌收縮。內(nèi)皮素受體在血管收縮中起重要作用，但DSP 對ETA 和ETB 受體的作用機(jī)制還不十分清楚。為了進(jìn)一步研究其作用機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)采用SD 大鼠離體腸系膜動(dòng)脈培養(yǎng)模型，將分離的大鼠腸系膜動(dòng)脈，制成血管環(huán)進(jìn)行器官培養(yǎng)，將特異性的細(xì)胞內(nèi)信號通路抑制劑加到培養(yǎng)基中，以檢驗(yàn)不同信號通路的參與情況；并通過肌張力描記技術(shù)記錄血管環(huán)的張力變化，依次在血管環(huán)浴槽中加入選擇性受體激動(dòng)劑，觀察內(nèi)皮素受體介導(dǎo)的血管收縮；Western blot 法檢測相關(guān)蛋白的表達(dá)，通過研究DSP 調(diào)節(jié)ETA 和ETB 受體的作用及機(jī)制，為預(yù)防和治療與吸煙有關(guān)的心血管疾病提供新的思路。

1 材料

1.1 動(dòng)物

雄性SD 大鼠，SPF 級，6 ～8 周齡，體質(zhì)量200 ～250 g [成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號：SCXK（川）2020-030]，動(dòng)物飼養(yǎng)于陜西中醫(yī)藥大學(xué)中藥藥理實(shí)驗(yàn)室，飼養(yǎng)期間動(dòng)物自由飲水進(jìn)食。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 試藥

角蝰毒素6C（S6C，ETB 受體激動(dòng)劑，Sigma-Aldrich，批號：097M4843V）、ET-1（Sigma-Aldrich，批號：088M4849V）、U0126（ERK1/2 通路抑制劑，批號：19826）、SP600125（JNK 通路抑制劑，批號：13775）、SB203580（P38 通路抑制劑，批號：10206）和Bay-117082（NF-

κ

B 通路抑制劑，批號：17893）（MedChemExpress 公司）；ETA 受體抗體（Abcam，批號：ab117521），ETB 受體抗體（GeneTex，批號：39603），p-ERK1/2（批號：4370S）、ERK1/2（批號：4695S）、p-P38（批號：4511S）、P38（批號：8690S）、p-NF-

κ

B P65（批號：3039S）和NF-

κ

B P65（批號：8242S）抗體（CST 公司）；

β

-actin 抗體（武漢博士德，批號：17353873）；青霉素/鏈霉素溶液-雙抗（HyClone 公司，批號：J190033）。

1.3 儀器

DMT 630M 離體微血管張力測定系統(tǒng)（丹麥DMT 公司）；CO培養(yǎng)箱（美國Thermo Scientific公司）；Powerlab 生物信號采集處理系統(tǒng)（澳大利亞ADI 公司）；電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀及化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)（美國Bio-rad 公司）。

2 方法

2.1 DSP 的制備

將點(diǎn)燃的3 支萬寶路香煙通過負(fù)壓經(jīng)過脫脂棉球，將脫脂棉球浸入1 mL DMSO 中使其附著物充分溶解，過濾除菌即得DSP。

2.2 腸系膜動(dòng)脈環(huán)培養(yǎng)及分組、給藥

SD 大鼠斷頸處死，體視顯微鏡下分離出腸系膜動(dòng)脈，使用Triton X-100 去除內(nèi)皮，腸系膜動(dòng)脈剪成約2 mm 的血管環(huán)，每段血管環(huán)加入DMEM 高糖培養(yǎng)基1 mL，按不同實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行分組與給藥：在培養(yǎng)基中加入DSP 或溶劑對照（DMSO）或MAPK 信號通路抑制劑（U0126、SP600125、SB203580） 或NF-

κ

B 通路抑制劑（Bay-117082），培養(yǎng)板置于CO培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

2.3 離體肌張力描記

將培養(yǎng)的動(dòng)脈環(huán)穿入兩根直徑為40 μm 的金屬絲，一根金屬絲與可調(diào)節(jié)預(yù)張力的張力微調(diào)裝置相連，另一根連接張力換能器。恒溫離體浴槽內(nèi)加入5 mL Na-PSS 溶液（Na-PSS 液組成為NaCl 119 mmol·L，NaHCO15 mmol·L，KCl 4.6 mmol·L，MgCl1.2 mmol·L，NaHPO1.2 mmol·L，CaCl1.5 mmol·L和葡萄糖 5.5 mmol·L）。固定好的動(dòng)脈環(huán)平衡40 min 后，施加2 mN 的預(yù)張力，加入5 mL 60 mmol·LK-PSS 液（K-PSS 液組成為NaCl 63.6 mmol·L，NaHCO15 mmol·L，KCl 60 mmol·L，MgCl1.2 mmol·L，NaHPO1.2 mmol·L，CaCl1.5 mmol·L和 葡 萄糖 5.5 mmol·L）檢驗(yàn)動(dòng)脈環(huán)收縮活性，使用乙酰膽堿檢測內(nèi)皮功能，若乙酰膽堿引起的舒張率＜10%，認(rèn)為內(nèi)皮已被去除。采用梯度累加法加入特異性ETB 受體激動(dòng)劑S6C 和ETA 受體激動(dòng)劑ET-1，觀察濃度-收縮曲線。

2.4 Western blot 檢測相關(guān)蛋白的表達(dá)

培養(yǎng)的大鼠腸系膜動(dòng)脈使用RIPA 裂解液提取總蛋白，采用BCA 法檢測蛋白含量，蛋白樣品經(jīng)10%聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉(zhuǎn)印至PVDF膜，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，一抗4 ℃孵育過夜，二抗室溫孵育1 h，ECL 發(fā)光試劑顯影，使用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照，檢測目標(biāo)條帶的光密度值，分析相關(guān)蛋白表達(dá)。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。激動(dòng)劑在血管環(huán)上引起的收縮用K-PSS 溶液引起的收縮的百分?jǐn)?shù)表示，

E

是激動(dòng)劑產(chǎn)生的最大收縮。使用SPSS 25.0 軟件采用單因素方差分析（ANOVA）進(jìn)行多組數(shù)據(jù)間的比較，

P

＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 DSP 對ETA 和ETB 受體介導(dǎo)的收縮反應(yīng)的影響

離體動(dòng)脈血管在含DSP（0.1、0.2 和0.4 μL·mL）的培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h，梯度累加法加入S6C（1×10～1×10mol·L）， 圖1B 結(jié)果顯示，與DMSO 對照組相比，DSP 0.2 μL·mL對S6C 引起的收縮增強(qiáng)，量效曲線顯著左移（

P

＜0.01）。ETB 受體激動(dòng)劑S6C 加入浴槽60 min 后，收縮曲線回到基線，使ETB 受體脫敏，再按梯度累加法加入ET-1（1×10～1×10mol·L），激動(dòng)ETA 受體，結(jié)果表明，DSP 0.2 μL·mL和DSP 0.4 μL·mL可以明顯地增強(qiáng)ET-1 的收縮作用，濃度-收縮曲線明顯左移（

P

＜0.05 或

P

＜0.01），因此DSP 的使用濃度選擇為DSP 0.2 μL·mL。

圖1 DSP 對S6C 和ET-1 誘導(dǎo)的濃度-收縮曲線的影響Fig 1 Effect of DSP on concentration-contractile curves induced by S6C and ET-1 in a concentration-dependent manner

3.2 MAPK 通路抑制劑對DSP 誘導(dǎo)ETA 和ETB受體介導(dǎo)的收縮反應(yīng)的影響

為了考察MAPK 通路是否參與了內(nèi)皮素受體介導(dǎo)的動(dòng)脈收縮，采用0.2 μL·mL的DSP與U0126、SP600125 或SB203580（濃度均為10 μmol·L）共同培養(yǎng)24 h。結(jié)果如圖2 所示，與DSP 組相比，U0126 可以抑制ETB 受體激動(dòng)劑S6C 和ETA 受體激動(dòng)劑ET-1 誘導(dǎo)的收縮反應(yīng)，S6C 誘導(dǎo)收縮的

E

從（204.3±29.5）%降低為（2.56±1.17）%（

P

＜0.01），ET-1 誘導(dǎo)收縮的

E

從（372.5±60.3）%降低為（123.1±26.7）%（

P

＜0.01）；SP600125 對S6C 和ET-1 誘導(dǎo)的收縮反應(yīng)沒有顯著影響；SB203580 可以顯著抑制ETB受體激動(dòng)劑S6C 和ETA 受體激動(dòng)劑ET-1 誘導(dǎo)的收縮反應(yīng)，S6C 誘導(dǎo)收縮的

E

從（200.6±26.9）%降低為（38.9±9.8）%（

P

＜0.01），ET-1 誘導(dǎo)收縮的

E

從（343.8±33.2）%降低為（239.3±42.4）%（

P

＜0.05）。

圖2 MAPK 抑制劑對S6C 和ET-1 介導(dǎo)收縮的影響Fig 2 Effect of MAPK inhibitors on S6C and ET-1 induced contraction

Western blot 檢測結(jié)果表明，DSP 組ETB 和ETA 受體蛋白表達(dá)升高，DSP ＋U0126 組ETB 和ETA 受體蛋白表達(dá)降低，DSP 組p-ERK1/2 蛋白的表達(dá)升高，DSP ＋U0126 組p-ERK1/2 蛋白的表達(dá)降低；DSP ＋SB203580 組ETB、ETA 受體蛋白和p-P38 蛋白的表達(dá)均降低（

P

＜0.05 或

P

＜0.01）。以上結(jié)果表明ERK1/2 和P38 可能參與了DSP 上調(diào)ETA 和ETB 受體引起的血管收縮（見圖3）。

圖3 腸系膜動(dòng)脈ETA、ETB 受體和MAPK 通路蛋白的表達(dá)Fig 3 Protein expression of ETA，ETB receptor and MAPK pathways in mesenteric arteries

3.3 NF-κB 通路抑制劑對DSP 誘導(dǎo)ETA 和ETB受體介導(dǎo)的收縮反應(yīng)的影響

為了研究NF-

κ

B 信號通路是否參與了DSP誘導(dǎo)的收縮，采用NF-

κ

B 通路抑制劑Bay-117082（10 μmol·L）與0.2 μL·mLDSP 共培養(yǎng)24 h。圖4A 結(jié)果顯示，與DSP 組相比，Bay-117082 可以顯著抑制S6C 誘導(dǎo)的收縮反應(yīng)，DSP 組的

E

為（214.6±56.2）%，DSP ＋Bay-117082 組 的

E

為（165.9±30.2）%（

P

＜0.05）；與DSP 組相比，Bay-117082 對ET-1 誘導(dǎo)的收縮反應(yīng)沒有明顯影響。Western blot 結(jié)果表明，Bay-117082 可以顯著抑制ETB 受體的表達(dá)，而對ETA 受體的表達(dá)沒有明顯影響。與DMSO 組相比，DSP 顯著增加了p-P65 蛋白表達(dá)；與DSP 組相比，DSP ＋Bay-117082 組p-P65 蛋白表達(dá)降低。以上結(jié)果表明NF-

κ

B 信號通路可能參與了DSP 上調(diào)ETB 受體介導(dǎo)的血管收縮（見圖5）。

圖4 NF-кB 抑制劑Bay-117082 對S6C（A）和ET-1（B）介導(dǎo)收縮的影響Fig 4 Effect of NF-кB pathway inhibitor Bay-117082 on S6C（A）and ET-1（B）induced contraction

圖5 腸系膜動(dòng)脈ETA、ETB 受體和p-P65 蛋白的表達(dá)Fig 5 Protein expression of ETA，ETB receptor and p-P65 in mesenteric arteries

4 討論

吸煙與心血管疾病的發(fā)病密切相關(guān)，然而，吸煙導(dǎo)致血管痙攣的分子機(jī)制尚不清楚。內(nèi)皮素與多種心血管疾病的發(fā)病機(jī)制有關(guān)，ET-1 是目前作用最強(qiáng)的內(nèi)源性血管收縮劑，引起血管強(qiáng)烈且持久的收縮，ET-1 通過與血管平滑肌表面特異性內(nèi)皮素受體（ETA 和ETB）結(jié)合，產(chǎn)生收縮血管的作用，刺激血管平滑肌細(xì)胞增殖、遷移，引起動(dòng)脈血管重塑以及細(xì)胞外基質(zhì)合成等多種生物學(xué)效應(yīng)，使動(dòng)脈血管的血管壁增厚和順應(yīng)性降低，導(dǎo)致血管阻力增加。內(nèi)皮素還參與了原發(fā)性高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化、冠心病、充血性心力衰竭、肺動(dòng)脈高壓、腦血管疾病急性腎衰竭、多囊腎病和慢性腎臟疾病。大量的實(shí)驗(yàn)證明，在高血壓患者的動(dòng)脈、心肌梗死患者缺血區(qū)的動(dòng)脈和自發(fā)性高血壓大鼠動(dòng)脈等中內(nèi)皮素受體的表達(dá)上調(diào)，內(nèi)皮素受體介導(dǎo)的動(dòng)脈收縮參與了心血管疾病的發(fā)生與發(fā)展。

本研究通過離體血管培養(yǎng)技術(shù)，從大鼠腸系膜動(dòng)脈平滑肌收縮功能和相關(guān)蛋白表達(dá)方面研究了DSP 對內(nèi)皮素受體作用及其相關(guān)信號通路。研究結(jié)果表明，DSP 可以使腸系膜動(dòng)脈環(huán)對S6C（ETB 受體激動(dòng)劑）的收縮作用呈濃度依賴性，收縮量效曲線左移，與DMSO 相比，0.2 μL·mLDSP 使血管的收縮反應(yīng)明顯增強(qiáng)。在ETB 受體脫敏后按累加濃度法加入ET-1，激動(dòng)ETA 受體，DSP 對ETA 受體介導(dǎo)的收縮反應(yīng)也明顯增強(qiáng)。MAPK 信號通路在血管痙攣和動(dòng)脈高反應(yīng)性中發(fā)揮著重要的作用，部分心血管危險(xiǎn)因子刺激動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞上的G 蛋白偶聯(lián)受體而激活MAPK 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與平滑肌收縮反應(yīng)，如5-羥色胺、血管緊張素Ⅱ、血栓素、腎上腺素

α

1 和內(nèi)皮素等G 蛋白偶聯(lián)受體引發(fā)的收縮機(jī)制中均有MAPK 通路參與。本課題組前期的研究也表明，DSP 激活ERK1/2-MAPK 信號通路，上調(diào)腎上腺素

α

受體的表達(dá)，使血管收縮作用增強(qiáng)。本研究使用MAPK 信號通路抑制劑與DSP 共培養(yǎng)研究MAPK 通路對DSP 刺激引起的ETA 和ETB 受體上調(diào)的影響，發(fā)現(xiàn)U0126（ERK1/2 通路抑制劑）和SB203580（P38 通路抑制劑）可以顯著抑制S6C 和ET-1 誘導(dǎo)的收縮反應(yīng)；DSP 上調(diào)ETA 和ETB 受體的表達(dá)，活化ERK1/2 和P38 通路， 而U0126 和SB203580 抑制了ETA 和ETB 受體的表達(dá)，降低了p-EKR1/2或p-P38 的蛋白表達(dá)，表明ERK1/2 和P38 通路可能參與了DSP 上調(diào)ETA 和ETB 受體介導(dǎo)的血管收縮，而JNK 抑制劑SP600125 對S6C 和ET-1誘導(dǎo)的收縮反應(yīng)沒有顯著影響，提示DSP 誘導(dǎo)內(nèi)皮素受體的上調(diào)可能與JNK 信號通路無關(guān)。DSP激活MAPK 信號通路中的ERK1/2 和P38 通路，而不激活JNK 通路，介導(dǎo)動(dòng)脈平滑肌ETA 和ETB 受體上調(diào)，導(dǎo)致血管平滑肌呈高反應(yīng)性，增強(qiáng)血管收縮，甚至引起血管痙攣。NF-

κ

B 是MAPK 下游的重要轉(zhuǎn)錄因子之一，Bay-117082（NF-

κ

B 抑制劑）可以顯著的抑制S6C 誘導(dǎo)的收縮反應(yīng)，而對ET-1 誘導(dǎo)的收縮反應(yīng)沒有明顯的影響。Western blot 結(jié)果也表明，Bay-117082 可以抑制ETB 受體的表達(dá)，而對ETA 受體沒有明顯的影響。P-65 蛋白是NF-

κ

B家族中的代表蛋白，DSP 激活使p-P65 蛋白的表達(dá)增加，而Bay-117082 可以降低p-P65 蛋白的表達(dá)，表明NF-

κ

B 可能參與了DSP 上調(diào)ETB 受體介導(dǎo)的血管收縮，而ETA 受體上調(diào)可能與NF-

κ

B信號通路無關(guān)，提示ETA 受體的上調(diào)可能與轉(zhuǎn)錄后機(jī)制有關(guān)，后續(xù)將進(jìn)一步深入研究。

本研究也存在一定局限性，香煙煙霧中有4000 多種成分，我們無法得知香煙中的哪些成分刺激血管平滑肌導(dǎo)致內(nèi)皮素受體上調(diào)；其次，血管內(nèi)皮被去除，主要目的在于排除內(nèi)皮功能的影響，針對性地研究DSP 引起平滑肌內(nèi)皮素受體介導(dǎo)的收縮反應(yīng)，但內(nèi)皮細(xì)胞與平滑肌細(xì)胞的相互作用無法體現(xiàn)。

綜上所述，DSP 通過激活MAPK/NF-

κ

B 通路，激活轉(zhuǎn)錄及翻譯，合成新的內(nèi)皮素受體，使血管平滑肌內(nèi)皮素受體表達(dá)上調(diào)，從而增強(qiáng)血管收縮。因此，阻斷MAPK 和NF-

κ

B 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，抑制內(nèi)皮素受體上調(diào)，改善血管平滑肌高反應(yīng)性，有望成為治療血管痙攣等心血管疾病的新思路和藥物開發(fā)的新靶點(diǎn)。