秦華珍 黃煥迪 陳俊其 戴慶玲 何瑞坤 鐘 貴 黃燕瓊 柳俊輝

(1 廣西中醫(yī)藥大學，南寧，530200；2 廣西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，南寧，530023)

高良姜、大高良姜、紅豆蔻3味中藥同屬于山姜屬中藥，它們的藥性與功效具有相似性，都是性味辛溫，歸脾胃經(jīng)，具有溫中散寒、溫胃止痛等功效，臨床常用于脘腹冷痛、傷食吐瀉等癥[1]。現(xiàn)代研究表明高良姜、大高良姜、紅豆蔻3味中藥具有鎮(zhèn)痛、抗炎、抗癌等藥理活性，其中以高良姜素、小豆蔻明、山姜素等構(gòu)成的黃酮類成分為其主要活性成分之一[2-5]。

本課題前期研究表明，山姜屬中藥有抗胃潰瘍寒證的藥效，其中主要活性成分黃酮類在體外有良好的抗氧化作用[6-7]。為了觀察黃酮類成分在體內(nèi)的藥效，本研究提取3味山姜屬中藥黃酮類成分，以大鼠復制胃潰瘍寒證模型，觀察大鼠行為體征變化，測定血清中一氧化氮(Nitric Oxide,NO)、內(nèi)皮肽(Endothelin，ET)、血小板活化因子(Platelet-activating Factor,PAF)、血栓素B2(Thromboxane B2,TXB2)、血清皮質(zhì)素(Cortisone,COR)含量，探討3味山姜屬中藥黃酮類成分溫中散寒的藥效及作用機制，為闡釋中藥“親緣關系-活性成分-效用”的相互關系提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 無特定病原體(Specific Pathogen Free，SPF)級SD雄性大鼠，體質(zhì)量180～220 g，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，許可證號：SCXK(湘)2016-0002。在屏障系統(tǒng)SPF級環(huán)境下飼養(yǎng)，室內(nèi)溫度為(20±2)℃，相對濕度為40%～70%。動物倫理委員會審批號：DW20210311-021。

1.1.2 藥物 高良姜、大高良姜、紅豆蔻、知母均購自安國市冷背藥材有限公司，批號：20181018，經(jīng)我校中藥鑒定學教研室田慧教授鑒定，高良姜為姜科植物高良姜(AlpiniaofficinarumHance)的干燥根；大高良姜為姜科植物大高良姜(AlpiniagalangalL.)的干燥根；紅豆蔻為姜科植物大高良姜(AlpiniagalangalL.)的果實。知母為百合科植物知母(AnemarrhenaasphodeloidesBge.)的干燥根莖。

1.1.3 試劑與儀器 干姜姜辣素(西安寶益豐生物科技有限公司，批號：20190912)；95%乙醇(AR，西隴化工股份有限公司，批號：20190316)；氫氧化鈉(AR，上海麥克林生化科技有限公司，批號：C10492126)；鹽酸(AR，西隴化工股份有限公司，批號：20190507)；冰乙酸(AR，西隴化工股份有限公司，批號：20190507)；羧甲基纖維素鈉(AR，國藥集團化學試劑有限公司，批號：20180110)。NO試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號：20190716)；ET、PAF、TXB2、COR試劑盒(Bioswamp武漢貝茵萊生物科技有限公司，批號：201908)。

粉碎機(上海頂佳工貿(mào)，型號：DJ-1500)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠，型號：RE-6000A)；低速離心機(上海安亭科學儀器廠，型號：TDL-5-A)；冰箱(青島海爾股份股份有限公司，型號：BCD-210DCM)；酶標儀(上?？迫A實驗系統(tǒng)有限公司，型號：ST-360)。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 取SPF級SD大鼠90只，隨機取10只為空白組，其余大鼠進行胃潰瘍寒證造模，每天早上灌服冰知母(4 ℃)水煎液(劑量10.44 g/kg，生藥量0.5 g/mL，給藥量2 mL/100 g)，下午灌服15%冰乙酸水溶液1 mL，1次/d，連續(xù)4 d[5]。末次造模結(jié)束后隨機分為模型組、陽性組、高良姜高低劑量組、大高良姜高低劑量組、紅豆蔻高低劑量組，共9組。

1.2.2 給藥方法 造模藥物制備：取知母8 kg，加10倍量的純水浸泡1 h，煮沸后保持微沸1 h，過濾，再加8倍量水煎40 min，過濾，合并2次濾液，加熱濃縮至0.5 g/mL生藥濃度，靜置冷卻，保存于4 ℃冰箱備用。冰乙酸溶液制備：取99.5%冰乙酸適量，加純水稀釋成15%冰乙酸溶液。

受試藥物制備：取適量高良姜、大高良姜、紅豆蔻飲片分別粉碎成粗粉，加入適量石油醚浸泡脫脂12 h，過濾，揮干石油醚，脫脂后粗粉依次加入40倍量95%、60%乙醇回流提取，每次提取時間4 h，提取液過濾，合并所得濾液，減壓濃縮，回收乙醇至無醇味。將粗提物加適量的水混勻，煮沸，加入1 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至10～11，煮沸1 h，過濾，重復2次，合并濾液，濾液加入1 mol/L鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH至1～2，水浴保溫30 min，放置24 h，析出沉淀，離心，棄去上清液，沉淀用蒸餾水抽洗2～3次，40 ℃真空干燥，得到3味山姜屬中藥黃酮提取物[8-9]，備用，用時以0.5%羧甲基纖維素鈉溶液配成相應濃度。

陽性藥物制備：以0.5%羧甲基纖維素鈉水溶液將干姜姜辣素配置成濃度4.5 mg/mL，備用。造模結(jié)束后第2天開始給藥，空白組和模型組灌服0.5%羧甲基纖維素鈉水溶液，陽性組灌服干姜姜辣素溶液，受試藥物給藥劑量參考前期研究，以黃酮得率為依據(jù)(高良姜、大高良姜、紅豆蔻黃酮得率分別為124.1 g/kg、98.1 g/kg、118.5 g/kg)確定[6]。高低劑量分別為臨床用量的4倍與16倍，給藥體積均為1 mL/100 g，每隔12 h給藥1次，共給藥4次。

1.2.3 檢測指標與方法 大鼠行為體征觀察：造模及給藥期間，觀察大鼠毛發(fā)、精神狀態(tài)，按表1評分并計算平均值；采用電子天平對大鼠體質(zhì)量、進食量進行稱量統(tǒng)計；采用量筒測量統(tǒng)計各組大鼠飲水量；采用電子體溫計測定大鼠肛溫3次，取3次平均值作為最終測量值。

表1 大鼠毛發(fā)及精神狀態(tài)評分

大鼠血清NO、ET、PAF、TXB2、COR含量測定：末次給藥后禁食不禁水12 h，麻醉大鼠，腹主動脈取血，常溫放置析出血清，3 000 r/min，離心15 min，分離血清，放入-20 ℃冰箱儲存，備用。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗法按試劑盒說明測定血清NO、ET、PAF、TXB2、COR含量。

2 結(jié)果

2.1 對胃潰瘍寒證大鼠行為體征指標的影響 模型組大鼠毛發(fā)臟亂，精神狀態(tài)較差，體質(zhì)量顯著減輕，肛溫顯著降低，日均進食量、飲水量顯著減少，與正常組大鼠比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。高良姜、大高良姜、紅豆蔻高劑量組能顯著改善大鼠的毛發(fā)與精神狀態(tài)，升高肛溫，與模型組大鼠比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；低劑量組作用不顯著。見表2。高良姜、大高良姜高劑量組大鼠體質(zhì)量顯著增加，與模型組大鼠比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，低劑量組體質(zhì)量變化不明顯。大高良姜高劑量組、紅豆蔻高低劑量組進食量顯著增加，與模型組大鼠比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01或P<0.05)；高良姜高低劑量組對進食量無明顯影響。各給藥組之間比較，高良姜低劑量組日均進食量與大高良姜組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；大高良姜高劑量組、紅豆蔻高劑量組大鼠日均飲水量與高良姜高劑量組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3。

表2 3味山姜屬中藥黃酮類成分對大鼠毛發(fā)及精神狀態(tài)、肛溫的影響

表3 3味山姜屬中藥黃酮類成分對大鼠體質(zhì)量、進食、飲水的影響

2.2 對胃潰瘍寒證大鼠血清NO、ET、PAF、TXB2、COR含量的影響 與空白組比較，模型組大鼠血清NO含量顯著減少，ET、PAF、TXB2、COR含量顯著增加，差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.01)。與模型組比較，高良姜高低劑量組、大高良姜與紅豆蔻高劑量組大鼠血清NO含量顯著升高，差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.01或P<0.05)，大高良姜、紅豆蔻低劑量組作用不明顯；各給藥組大鼠血清ET含量均顯著降低，與模型組比較差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.01或P<0.05)；高良姜與紅豆蔻高劑量組、大高良姜高低劑量組大鼠PAF、TXB2含量顯著降低，與模型組比較差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.01或P<0.05)，高良姜、紅豆蔻低劑量組作用不明顯；高良姜高低劑量組、大高良與紅豆蔻高劑量組血清COR含量顯著降低，與模型組比較差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.01或P<0.05)，高良姜與紅豆蔻低劑量組作用不明顯。各給藥組之間比較，高良姜、大高良姜與紅豆蔻高劑量組NO含量升高明顯，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；高良姜高劑量組、大高良姜與紅豆蔻低劑量組降低ET含量作用顯著，與其他給藥組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；大高良姜與紅豆蔻高劑量組降低COR含量作用明顯，與其他給藥組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見表4、表5。

表4 3味山姜屬中藥黃酮類成分對胃潰瘍寒證大鼠血清NO、ET、PAF含量的影響

表5 3味山姜屬中藥黃酮類成分對胃潰瘍寒證大鼠血清TXB2、COR含量的影響

3 討論

胃潰瘍屬于中醫(yī)學“胃痛”“胃脘痛”范疇，寒邪客胃型胃脘痛為臨床常見證型，需用溫中散寒藥治療[10-11]。高良姜、大高良姜、紅豆蔻3味山姜屬中藥藥性辛溫，歸脾胃經(jīng)，具有溫胃散寒的功效，臨床常用于治療寒性胃痛。本研究根據(jù)中醫(yī)藥理論、結(jié)合臨床表現(xiàn)復制胃潰瘍寒證模型，以此模型為基礎，對3味山姜屬中藥黃酮類成分的藥效與機制進行研究，符合中醫(yī)“辨證論治”的用藥規(guī)律及“寒者熱之”的治療原則。胃潰瘍臨床表現(xiàn)多為上腹部疼痛，患者常見明顯的體質(zhì)量下降，其原因主要為患者為避免進食疼痛，減少進食及飲水[12-13]。寒性胃痛常兼有惡寒蜷臥、食欲不振、飲水少、大便稀溏等癥狀。本研究根據(jù)疾病證候特點，觀察大鼠毛發(fā)及精神狀態(tài)，進食、體質(zhì)量、飲水、體溫情況，實驗結(jié)果表明：給藥后大鼠毛發(fā)及精神狀態(tài)改善，進食量、飲水量增加，體質(zhì)量與體溫回升，表明3味山姜屬黃酮類成分具有改善胃潰瘍寒證大鼠病理狀態(tài)，恢復正常功能的作用。NO是一種血管活性物質(zhì)，具有促進胃黏膜血管舒張，增加胃血流量，舒張平滑肌，調(diào)節(jié)胃黏液分泌及阻止血小板凝集等作用。ET是由血管內(nèi)皮細胞分泌的斷裂多肽，具有血管收縮，緊張平滑肌等作用[14-15]。NO與ET共同調(diào)節(jié)胃黏膜表皮組織血管緊張性和內(nèi)皮細胞連續(xù)性，有效維持黏膜完整性和黏膜防御功能。NO分泌的降低與ET的升高會直接導致胃黏膜血管通透性降低，胃黏膜血流量減少，增加黏膜損傷，加重潰瘍面的生成。PAF主要由體內(nèi)多種免疫細胞分泌，其受體在胃腸道黏膜及周邊血管組織中多有分布，具有降低微血管通透性，減少胃黏膜血流量的作用，PAF的大量分泌會促使胃黏膜細胞代謝發(fā)生紊亂，產(chǎn)生胃黏膜損傷[16-17]。TXB2由生成血栓素A2(TXA2)代謝而成，TXA2能夠增加血栓形成，導致潰瘍面加重。TXA2在人體內(nèi)代謝極快，不易測定，通過測定TXB2含量可獲知TXA2在體內(nèi)的分泌[18]。COR是由腎上腺分泌的一種腎上腺糖皮質(zhì)激素，在機體受到刺激后，COR會大量生成，以促進蛋白質(zhì)分解，加強機體對外界刺激的抵抗力，同時炎癥介質(zhì)表達增加，導致潰瘍面愈合緩慢[19-21]。

本研究結(jié)果顯示，3味山姜屬中藥黃酮類成分能夠增加病證大鼠血清NO含量，降低ET含量，從而降低胃黏膜血管緊張性，增加胃黏膜血流量，維持胃黏膜血管緊張性和通透性，促進潰瘍面愈合。通過減少PAF、TXB2、COR的分泌，增加微血管通透性，減少血栓形成，減少炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，維持微血管循環(huán)及胃黏膜細胞組織的正常的代謝，促進胃黏膜血流量，增加胃黏膜愈合。本研究結(jié)果表明：3味山姜屬中藥黃酮類成分具有抗胃潰瘍寒證作用，其主要通過增加NO含量，降低ET、PAF、TXB2、COR分泌，促進胃黏膜血流量及胃黏膜血循環(huán)，改善胃黏膜細胞環(huán)境，發(fā)揮治療胃潰瘍寒證的作用。3味山姜屬中藥黃酮類成分的溫中散寒藥效具有一定的相關性和差異性，表明具有親緣關系的藥物之間活性成分有相似的藥效，但作用強弱不同。