杜文佳 何良志 劉眾成 詹紅偉 姜金

蘭州大學第二醫(yī)院（甘肅省骨科臨床醫(yī)學研究中心），甘肅 蘭州 730030

伴隨人口老齡化加劇，骨質疏松引起的相關問題逐漸成為社會的重大負擔，已演變?yōu)閲乐氐墓残l(wèi)生事件[1，2］。目前研究表明，維持骨量由骨形成、骨重塑等生理進程共同維系動態(tài)平衡[3］。當骨穩(wěn)態(tài)的動態(tài)平衡被打破，隨之會出現骨量下降、骨骼過度礦化等病理過程[4］。然而，骨質疏松的發(fā)生、發(fā)展機制目前仍不明確。流體剪切應力（fluid shear stress，FSS）在對抗骨質疏松的發(fā)生及進程中起著不容忽視的重要作用[5，6］。骨骼的機械負荷可以通過間質液流動產生的FSS傳遞至成骨細胞和骨細胞，這種流體特性在骨細胞和襯在小梁周圍的成骨細胞表面產生剪切應力，剪切應力傳遞各種生化信號至細胞內，最終發(fā)揮生物學效能[7］。2010年Coste B等[8］作者首先在小鼠神經母細胞瘤細胞系中發(fā)現一種快速適應的機械敏感性陽離子通道，并將其命名Piezo1（Fam38A）。當前研究認為Piezo1在調控并參與骨質疏松進程中起著重要作用[9-11］。2017年Sugimoto A等[9］作者發(fā)現Piezo1對骨骼內環(huán)境穩(wěn)態(tài)維持及成骨分化具有重要作用。最近研究發(fā)現Piezo1機械敏感性陽離子通道或許在骨質疏松及骨性關節(jié)炎的發(fā)生及發(fā)展過程中起關鍵作用[10］。Wang L等[11］發(fā)現Piezo1主要通過在成骨細胞中的信號傳遞作用影響破骨細胞活性而在骨組織中發(fā)揮作用。Song T等[12］發(fā)現Piezo1介導的成骨細胞促進成骨細胞分化，利于骨形成。然而，Piezo1是否參與成骨細胞的增殖過程以及其相關的分子機制仍然需要進一步研究。

細胞骨架是真核細胞中的蛋白纖維網架系統(tǒng)，其在維持正常細胞形態(tài)中起重要作用[13］。在成骨細胞中，細胞骨架肌動蛋白在對機械刺激的感知中發(fā)揮重要作用[14］。Suzuki H等[15］發(fā)現成骨細胞中的細胞骨架的功能對受機械應力調控的骨形成過程十分關鍵。然而，迄今為止，關于FSS如何介導細胞促進成骨細胞增殖的機制仍不明確，仍缺乏相關研究證實Piezo1通道蛋白是否會對細胞骨架產生影響。本實驗中，我們使用課題組自行研發(fā)的FSS加載裝置（專利號：ZL201520-637211.6）該FSS加載裝置由6通道平行小室構成，通過計算機監(jiān)控實時加載的FSS大小，由計算機監(jiān)控系統(tǒng)、儲液系統(tǒng)、加載系統(tǒng)以及脈管系統(tǒng)構成[16，17］。在體外對MC3T3-E1小鼠成骨細胞作用，探究Piezo1介導的FSS對成骨細胞增殖的具體機制。我們提出如下假設：Piezo1通道蛋白介導的FSS通過增強細胞骨架重組上調成骨細胞增殖。本研究擬使用FSS加載裝置探究FSS與Piezo1的具體作用關系，并探討Piezo1與成骨細胞的細胞骨架蛋白之間的上下游關系及具體作用機制。

1 實驗與方法

1.1 器材與儀器 研究所需MC3T3-E1成骨細胞系購自中國北京協(xié)和細胞技術資源中心。試劑：α-MEM培養(yǎng)基（Hyclone，美國），胎牛血清（FBS）（Gibco，美國），胰蛋白酶（Gibco，美國），青霉素-鏈霉素溶液100×、磷酸鹽緩沖液（PBS）、4%多聚甲醛、Triton-×100（Beyotime，中國），DAPI染色液（Biosharp，中國），Piezo1一抗、PCNA一抗、MCM2一抗、Cyclin D1一抗、山羊抗兔二抗、山羊抗鼠二抗、山羊抗兔熒光二抗-488（Proteintech，中國），EdU染色試劑盒（Rebobio，中國），CytochalasinD（Topscience，中國），Yoda1、GsMTx4（Tocris，英國）。

1.2 細胞培養(yǎng) MC3T3-E1成骨細胞培養(yǎng)于含有1%青霉素-鏈霉素的完全培養(yǎng)基（α-MEM∶FBS=9∶1）中，細胞培養(yǎng)瓶中加入4mL完全培養(yǎng)基，將細胞置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內，每日觀察一次，細胞增長至90%密度進行1∶2傳代。

1.3 細胞干預 按課題組既往操作將細胞置于FSS加載裝置中，調整加載參數，待加載完成后取出玻片進行下一步操作[18］。Piezo1激動劑Yoda1溶解于DMSO，并配置成100μmol/L濃度，將其加入需要進行干預的細胞培養(yǎng)瓶并使最終濃度為10μmol/L，作用2h。Piezo1抑制劑GsMTx4溶解于PBS并配置成10μmol/L濃度，將其加入需要進行干預的細胞培養(yǎng)瓶，并使最終濃度為4μmol/L，作用0.5h。

1.4 免疫熒光及鬼筆環(huán)肽染色 使用4%多聚甲醛進行固定30min（室溫），PBS清洗三遍，將細胞置于1%Triton-×100中通透30min（室溫），PBS清洗三遍，然后將細胞置于10%山羊封閉血清封閉30min（37℃），PBS清洗三遍，將細胞置于Piezo1一抗（1∶300）中過夜（4℃），PBS清洗五遍，然后將細胞置于熒光二抗（-488）中染色1h（37℃），PBS清洗五遍，將細胞置于DAPI染色液中15min（37℃），在熒光顯微鏡下觀察細胞。

1.5 EdU染色 將干預后的MC3T3-E1細胞種植在直徑12mm的蓋玻片，分別置于24孔板內，每孔滴加200μLEdU染液，37℃水浴鍋內放置1h。吸棄EdU染液，PBS洗2次，3min/次，每孔加0.5mL 4%多聚甲醛固定細胞，室溫靜置30min。吸棄甲醛，每孔加入0.5mL 1g/L甘氨酸中和醛基，室溫搖床搖洗5min。吸棄甘氨酸溶液，PBS洗2次，3min/次，每孔滴加0.5mL 0.5%Triton×-100，室溫搖床放置10min。PBS搖洗2次，3min/次，每孔加入200μL染液，避光室溫搖床放置30min。吸棄反應液，再次滴加0.5mL 0.5%Triton×-100通透液，清洗2次，10min/次，滴加0.5mL甲醇洗1次，5min，PBS洗1次，5min。每孔加入200μL Hoechst染液，室溫、避光搖床放置30min，棄反應液，PBS洗2次，3min/次，隨后將蓋玻片取出，熒光顯微鏡下觀察。

1.6 Western Blot使用RIPA細胞裂解液與PMSF以100∶1比例配置裂解液，向干預完成的細胞中加入1.0mL裂解液，冰上裂解30min，12 000rpm離心20min后棄去沉淀。向剩余裂解液中加入1/3的4×蛋白質上樣緩沖液。蛋白在10%SDS-PAGE膠中120V電泳，待電泳完成后350 mA恒流轉印30min，封閉1h后將轉印膜置于相應一抗中4℃過夜，取出轉印膜并置于相應二抗中作用1h。拭干轉印膜后滴加ECL發(fā)光液并曝光。

1.7 統(tǒng)計學分析 定量分析實驗重復至少3次。所有數據以“均值±標準差”（M±SD）呈現。其次使用雙尾t-檢驗或單因素方差分析計算是否具有統(tǒng)計學意義并繪制統(tǒng)計圖；P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。Image-J用于計算Western blot條帶灰度值。Adobe Illustrator（2019版本，美國）進行圖像組裝及成圖。

2 結果

2.1 不同強度循環(huán)FSS對成骨細胞Piezo1表達的影響 Western Blot結果表明未加力時成骨細胞內Piezo1蛋白處于低表達狀態(tài)，隨著施加不同強度FSS，細胞內Piezo1蛋白表達呈先增后減的趨勢，6dyne/cm2時表達量最高，與未加力組相比差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001），后文加載FSS強度設定為6dyne/cm2。加載9dyne/cm2、12dyne/cm2FSS時，與未加力組相比仍有明顯統(tǒng)計學差異（P＜0.001），但較加載6dyne/cm2力時有所下降。而當FSS加載到15dyne/cm2、18dyne/cm2時，Piezo1蛋白表達量下降，這可能與強FSS致細胞膜破壞有關。見圖1。

圖1 Western Blot檢測不同強度FSS對Piezo1蛋白表達的影響

2.2 Yoda1和GsMTx4對成骨細胞Piezo1蛋白的影響早期研究發(fā)現，Piezo1蛋白激活劑Yoda1和抑制劑GsMTx4對細胞的最適作用時間分別為3h和2h。對成骨細胞干預不同濃度Yoda1和GsMTx4、免疫熒光染色檢測成骨細胞內Piezo1蛋白表達結果如圖2示，Yoda1可以促進成骨細胞內Piezo1蛋白表達，而20μM組相比于其他各濃度組Piezo1蛋白表達更高。同樣，GsMTx4則抑制細胞內Piezo1表達，相比之下，0.5μM組內Piezo1蛋白抑制最明顯。

圖2 免疫熒光檢測不同濃度Yoda1和GsMTx4對成骨細胞內Piezo1蛋白影響

2.3 Piezo1上調成骨細胞增殖 如圖3所示，對成骨細胞分別以Yoda1（Piezo1特異性激活劑，20μM，3h）、DMSO（Piezo1溶劑）、GsMTx4（Piezo1特異性抑制劑，0.5μM，2h）干預，Western Blot檢測Piezo1、PCNA、MCM2、Cyclin D1的表達。結果顯示，Yoda1可促進成骨細胞內Piezo1蛋白表達上調（P＜0.001，圖3B），GsMTx4則明顯下調Piezo1蛋白（P＜0.001，圖3B）表達，上調Piezo1蛋白后成骨細胞增殖相關蛋白明顯上調（PCNA∶P＜0.01、MCM2∶P＜0.01、Cyclin D1∶P＜0.001，圖3C-E），而沉默Piezo1蛋白則抑制成骨細胞增殖相關蛋白的表達（PCNA∶P＜0.01、MCM2∶P＜0.05、Cyclin D1∶P＜0.001，圖3C-E），溶劑DMSO則不會影響Piezo1蛋白及增殖相關蛋白表達（圖3B-E）。

圖3 Western Blot檢測Piezo1蛋白對成骨細胞增殖的影響

EdU染色觀察成骨細胞增殖，如圖4所示，Yoda1組成骨細胞增殖率明顯高于空白組，與空白組相比具有統(tǒng)計學意義（P＜0.001，圖4B）。GsMTx4組細胞增殖率則低于空白組（P＜0.05，圖4B）。

圖4 EdU染色觀察Piezo1蛋白對成骨細胞增殖的影響

2.4 FSS及Piezo1蛋白對成骨細胞細胞骨架的影響相比于空白組，FSS組細胞內應力絲陽性率明顯增高（P<0.001）。給予GsMTx4干預后，與FSS組相比，FSS+GsMTx4組內成骨細胞應力絲陽性率明顯降低（P<0.001）。證明FSS促進成骨細胞內細胞骨架重組，而抑制Piezo1蛋白則抑制成骨細胞內細胞骨架重組。見圖5。

圖5 鬼筆環(huán)肽染色觀察FSS與Piezo1對成骨細胞內細胞骨架的影響

2.5 FSS通過細胞骨架上調成骨細胞增殖 如圖6所示，EdU染色顯示空白組、FSS組以及FSS+骨架蛋白F-actin特異性抑制劑細胞松弛素D（CytoD）組中成骨細胞增殖表現，與空白組相比，FSS組增殖率明顯升高（P<0.001，圖6B），使用CytoD進行干預后，相較于FSS組細胞增殖率出現顯著下調（P<0.001，圖6B）。證明抑制骨架蛋白后抑制成骨細胞增殖。

圖6 FSS通過細胞骨架上調成骨細胞增殖的EdU染色

3 討論

本研究主要發(fā)現Piezo1介導的FSS上調小鼠MC3T3-E1成骨細胞增殖相關蛋白以及增殖率。進一步研究發(fā)現細胞骨架在Piezo1介導的FSS上調成骨細胞中發(fā)揮重要作用，抑制骨架蛋白表達可以顯著降低生物力學信號對成骨細胞增殖的影響。

Piezo1機械敏感性離子通道是促進胚胎發(fā)育和成人骨環(huán)境穩(wěn)態(tài)的重要機械傳感器?！蹲匀弧冯s志最新列出的2021年值得關注的7種技術中指出，除了生長因子和其他分子，細胞還可以感知物理力，這種力可以調節(jié)基因表達、細胞增殖以及癌癥發(fā)生，在感受力學刺激的諸多分子中，Piezo1離子通道被提到首位[19］。之前我們的研究發(fā)現，成骨細胞細胞膜上Piezo1通道可以感受FSS并對FSS刺激做出反應[10，16，20］。雖然后續(xù)有多項研究發(fā)現Piezo1蛋白調節(jié)成骨細胞增殖及在小鼠骨骼發(fā)育中的關鍵作用，這些研究分別從不同層面闡明了Piezo1在成骨細胞中的作用，但是關于流體剪切力介導Piezo1調控成骨細胞增殖的機制知之甚少，而且流體剪切力作用后，細胞內信號傳遞的方式也不十分不明確[11，12，21，22］。

關于其他細胞的研究中已發(fā)現流體剪切力對Piezo1通道的影響，如Wang S等[23］發(fā)現，流體剪切力誘導的血管內皮細胞內ATP釋放和P2Y2/Gq/G11介導的信號傳遞中，Piezo1參與了下游磷酸化過程和內皮NOS的激活，促進Piezo1表達誘發(fā)血管舒張，這為高血壓治療提供了新見解。后續(xù)研究發(fā)現Piezo1可以調節(jié)內皮細胞中TRPV4通道的激活，并且Piezo1介導的TRPV4通道打開與FSS強度和作用時間相關[24］。本研究證明了流體剪切力可以介導Piezo1通道促進成骨細胞增殖。對成骨細胞分別以Yoda1和GsMTx4干預后，成骨細胞內Piezo1蛋白表達分別上調和下調，這與之前報道的結論相一致[25-27］。隨后我們進一步檢測Piezo1蛋白上下調后對成骨細胞增殖的變化，發(fā)現Piezo1蛋白表達與成骨細胞增殖呈正相關，說明Piezo1通道打開后釋放Ca2+入胞，而這些遞質具有促成骨作用。這是繼前期關于流體剪切力介導Piezo1促進成骨細胞遷移后的進一步研究，也進一步豐富了流體力學對成骨細胞的作用機理。

細胞骨架重組指骨架蛋白重新排列形成應力絲的過程，應力絲的形成愛表細胞骨架重組良好、細胞形態(tài)正常[28，29］。通過鬼筆環(huán)肽染色可以觀察到成骨細胞內的應力絲表現[30］。我們進一步探究了FSS及Piezo1對成骨細胞細胞骨架的影響。首先對成骨細胞加載流體剪切力顯示相比未加力時細胞內應力絲陽性率明顯升高，但使用Piezo1抑制劑GsMTx4后細胞內應力絲陽性率明顯降低。這證明FSS促進成骨細胞細胞骨架重組，而抑制Piezo1表達則減弱這一作用，證明FSS可能介導Piezo1調控成骨細胞骨架重組。隨后的研究中，我們發(fā)現，使用細胞骨架抑制劑細胞松弛素D（CytoD）后，成骨細胞內應力絲重組率明顯降低，而對成骨細胞干預CytoD后，減弱了FSS促成骨細胞增殖的作用，表明細胞骨架重組與成骨細胞增殖呈正相關。但是，細胞骨架是通過何種途徑調控成骨細胞增殖的機制仍不明確，這就有待后續(xù)更進一步的研究加以驗證，若能完全解析外界刺激—離子通道—細胞骨架—信號通路之間的單向或相互作用機制，將對骨形成機制的完善填補空缺。

本研究未開展動物體內實驗，對Piezo1介導的FSS通過細胞骨架對哺乳動物骨表型的影響未進行系統(tǒng)的研究，因此，存在一定的局限性，后續(xù)研究應將研究中心傾向于進行動物在體實驗，并對Piezo1在動物體內的具體功能及作用機制進行深入研究。

綜上所述，我們的研究完善了FSS對成骨細胞內Piezo1蛋白表達的最適作用條件，論證了Piezo1介導的Piezo1通過增強細胞骨架重排進而上調成骨細胞增殖，探究了機械應力對治療骨質疏松的具體機制，闡釋了Piezo1及細胞骨架可能會成為治療骨質疏松的新靶點。