梅澍 荊曉 何貴山

甘肅省腫瘤醫(yī)院，甘肅 蘭州 730050

PCR實(shí)驗(yàn)又稱基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)，通過體外模擬DNA復(fù)制過程對(duì)病毒體內(nèi)的基因進(jìn)行擴(kuò)增，能夠檢測(cè)出含量不高的病毒，PCR靈敏度和特異性高，臨床上常用來檢驗(yàn)病毒感染性疾病，如艾滋病、乙型肝炎、高致病性呼吸道病毒等的一種重要檢測(cè)方法，也逐漸廣泛應(yīng)用于腫瘤靶向、生殖遺傳等領(lǐng)域[1-2］。隨著近年來高致病性呼吸道病毒的暴發(fā)，檢測(cè)的需求大幅增加，國(guó)家加大PCR實(shí)驗(yàn)室的建設(shè)。PCR實(shí)驗(yàn)室屬于醫(yī)學(xué)生物安全二級(jí)實(shí)驗(yàn)室（BSL-2），目前PCR實(shí)驗(yàn)室大多數(shù)按加強(qiáng)型醫(yī)學(xué)BSL-2實(shí)驗(yàn)室建設(shè)，對(duì)于實(shí)驗(yàn)室建設(shè)標(biāo)準(zhǔn)相關(guān)部門和組織設(shè)置了技術(shù)要求和指標(biāo)[3］，從2020年4月至2021年8月，僅甘肅省的PCR檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室從46家增至288家。實(shí)驗(yàn)室大規(guī)模的建設(shè)，雖然大大提高了檢測(cè)能力，但在運(yùn)行過程中諸多因素會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)室造成影響。部分實(shí)驗(yàn)室受空間及建筑格局限制，普遍存在人流、物流、標(biāo)本不能完全實(shí)現(xiàn)分流或單一流向的問題[4］。實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)人員對(duì)實(shí)驗(yàn)室負(fù)壓的運(yùn)行原理及可能產(chǎn)生的危險(xiǎn)因素認(rèn)識(shí)不足、培訓(xùn)不到位等，都可能帶來生物安全隱患。

1 PCR實(shí)驗(yàn)室在運(yùn)行過程中存在的隱患對(duì)實(shí)驗(yàn)室的影響

1.1 新風(fēng)過濾系統(tǒng)對(duì)實(shí)驗(yàn)室的影響 氣流控制是生物安全實(shí)驗(yàn)室控制的核心，主要包括對(duì)氣體流速、流量、壓力的檢測(cè)和控制。特別是加強(qiáng)型醫(yī)學(xué)BSL-2實(shí)驗(yàn)室，是在普通型醫(yī)學(xué)BSL-2實(shí)驗(yàn)室的基礎(chǔ)之上增加了負(fù)壓，有明確的壓力梯度要求，設(shè)置機(jī)械通風(fēng)系統(tǒng)、高效排風(fēng)過濾系統(tǒng)等，該系統(tǒng)要控制送排風(fēng)比例，維持各房間的負(fù)壓要求，以保證實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的氣流由清潔區(qū)流向污染區(qū)的定向流動(dòng)[5］。實(shí)驗(yàn)室內(nèi)空氣需經(jīng)過高效過濾后排出，防止實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的生物污染外泄，以保證實(shí)驗(yàn)室周圍環(huán)境的安全[3，6］。

目前PCR實(shí)驗(yàn)室大部分采用機(jī)械通風(fēng)裝置，新風(fēng)通過初效、中效、高效三級(jí)過濾送入實(shí)驗(yàn)室，其中初效和中效過濾器可以起到預(yù)過濾的作用，進(jìn)而能夠延長(zhǎng)高效過濾器的使用壽命。初、中效過濾器一般3至6個(gè)月更換一次，高效過濾器的更換頻率根據(jù)具體使用情況而定[7］。而在西北地區(qū)，容易出現(xiàn)浮塵甚至是沙塵暴天氣，導(dǎo)致送風(fēng)系統(tǒng)或排風(fēng)系統(tǒng)初級(jí)過濾器被堵塞。當(dāng)進(jìn)風(fēng)系統(tǒng)壓力降低時(shí)，導(dǎo)致氣流不能定向流動(dòng)，樣品制備間的生物污染因子進(jìn)入緩沖間后，進(jìn)而向清潔區(qū)擴(kuò)散，當(dāng)排風(fēng)系統(tǒng)過濾器被堵塞后，生物污染因子不能被有效地過濾，會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)室污染風(fēng)險(xiǎn)。

實(shí)驗(yàn)室核心工作間沒有獨(dú)立排風(fēng)口，僅利用生物安全柜等其他負(fù)壓排風(fēng)裝置代替室內(nèi)排風(fēng)口，一旦設(shè)備操作不當(dāng)或發(fā)生故障，可能導(dǎo)致室內(nèi)氣壓或氣流逆轉(zhuǎn)。核心工作間送風(fēng)口、排風(fēng)口的位置也可以影響氣流流動(dòng)的方向，風(fēng)口設(shè)置可采用對(duì)側(cè)上送下排的方式。另外，實(shí)驗(yàn)室內(nèi)設(shè)備的擺放位置也可能成為氣流流動(dòng)過程中的障礙。

1.2 壓力梯度設(shè)置對(duì)實(shí)驗(yàn)室的影響 負(fù)壓實(shí)驗(yàn)室的生物安全防護(hù)性能高于常壓狀態(tài)實(shí)驗(yàn)室[8］，臨床上PCR實(shí)驗(yàn)室常用來檢測(cè)致病性病毒，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)為負(fù)壓以確保生物安全。PCR實(shí)驗(yàn)室存在兩類壓差控制：一類是各個(gè)實(shí)驗(yàn)區(qū)之間的壓差，保證氣流的單向流動(dòng)，避免因不慎同時(shí)開啟兩扇門時(shí)的氣流逆轉(zhuǎn)；另一類是每個(gè)實(shí)驗(yàn)區(qū)、緩沖間、專用走廊之間的壓差，保證每個(gè)實(shí)驗(yàn)區(qū)域各自氣流的獨(dú)立性，避免受到共用通道的影響。

根據(jù)生物安全實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)的要求，實(shí)驗(yàn)室間的壓差應(yīng)在10pa，因此設(shè)計(jì)與運(yùn)行時(shí)應(yīng)按>15Pa設(shè)置，才能保證負(fù)壓實(shí)驗(yàn)室的壓力自清潔區(qū)至污染區(qū)逐區(qū)降低。雖然部分實(shí)驗(yàn)室將壓差設(shè)計(jì)成了10pa，而壓強(qiáng)的正常漂移可為±5Pa，因此，標(biāo)本處理間和擴(kuò)增間壓差可能會(huì)低于10Pa甚至為5Pa，壓差太小，標(biāo)本處理間和擴(kuò)增間未形成壓力梯度，甚至各緩沖間沒有壓差，實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的氣流不能由清潔區(qū)向污染區(qū)定向流動(dòng)，具有較大的生物擴(kuò)散隱患[9］。

1.3 實(shí)驗(yàn)分區(qū)設(shè)置對(duì)實(shí)驗(yàn)室的影響 由于目前很多實(shí)驗(yàn)室是在原有房屋基礎(chǔ)上改建的實(shí)驗(yàn)室，新改建的實(shí)驗(yàn)室因場(chǎng)地限制，沒有達(dá)到真正意義的三分區(qū)，缺少緩沖區(qū)，采用內(nèi)部公用走廊與實(shí)驗(yàn)區(qū)直接連接，當(dāng)實(shí)驗(yàn)室門開啟時(shí)，由于溫差、門的卷吸和人的裹帶作用，必然會(huì)產(chǎn)生實(shí)驗(yàn)室內(nèi)空氣外泄，會(huì)引起短時(shí)間、大風(fēng)量的室內(nèi)外空氣交換，產(chǎn)生交叉污染[5］。

1.4 生物安全柜選擇使用不當(dāng)對(duì)實(shí)驗(yàn)室影響 生物安全柜作為一級(jí)屏障，是PCR實(shí)驗(yàn)室的核心設(shè)備。PCR實(shí)驗(yàn)室需要配備二級(jí)生物安全柜，并有獨(dú)立的通風(fēng)系統(tǒng)[10］。生物安全柜的操作窗口吸入氣流的方向應(yīng)與房間氣流方向一致。送風(fēng)口位置不應(yīng)設(shè)置在操作人員的正上方和有氣溶膠產(chǎn)生的上方，防止含有病原微生物的氣溶膠擴(kuò)散造成污染。通風(fēng)系統(tǒng)能有效地保證生物安全柜與實(shí)驗(yàn)室的壓力平衡。生物安全柜的工作原理是保持安全柜內(nèi)的負(fù)壓，讓氣流從外部進(jìn)入安全柜，同時(shí)其循環(huán)風(fēng)和排風(fēng)經(jīng)過高效過濾器過濾，既阻止柜內(nèi)的病原微生物溢出，又能保護(hù)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境和實(shí)驗(yàn)操作者。當(dāng)送風(fēng)系統(tǒng)故障時(shí)，壓力平衡被破壞，生物安全柜所在的樣品制備室的負(fù)壓，加上生物柜內(nèi)的負(fù)壓，會(huì)造成壓力疊加，讓樣品制備間成為高負(fù)壓狀態(tài)。這種情況在使用全排式B2型生物安全柜的實(shí)驗(yàn)室更加突出。這時(shí)樣品制備室的壓力小于PCR擴(kuò)增室，致使污染因子倒灌入制備間，在室內(nèi)聚集漂浮，不能及時(shí)排除室外，引起嚴(yán)重的安全隱患。

部分實(shí)驗(yàn)室操作人員對(duì)生物安全柜的使用不當(dāng)，實(shí)驗(yàn)操作過程動(dòng)作幅度太大引起壓力波動(dòng)，如當(dāng)壓力未達(dá)到穩(wěn)定要求時(shí)開始實(shí)驗(yàn)操作，快速拉起或關(guān)閉窗口玻璃而引起瞬時(shí)的風(fēng)量巨變，會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)人員造成嚴(yán)重的生物安全隱患。

1.5 實(shí)驗(yàn)室洗手設(shè)備不合理對(duì)實(shí)驗(yàn)室影響 部分實(shí)驗(yàn)室洗手池排水沒有獨(dú)立的排水系統(tǒng)，并且采用直排方式，沒有防回流設(shè)計(jì)。負(fù)壓實(shí)驗(yàn)室壓力小于排水管壓力，會(huì)造成污水倒吸，管道內(nèi)的污染因子也會(huì)因倒灌漂浮在室內(nèi)，造成安全隱患。

1.6 消毒不及時(shí)對(duì)實(shí)驗(yàn)室影響 由于PCR實(shí)驗(yàn)強(qiáng)大的擴(kuò)增能力和極高的敏感性，極微量的污染都會(huì)出現(xiàn)假陽性，所以防止污染的發(fā)生是一個(gè)不容忽視的問題[11］。近來，檢測(cè)需求量大，檢測(cè)任務(wù)重，實(shí)驗(yàn)室常常處于超負(fù)荷運(yùn)行狀態(tài)，甚至是24小時(shí)運(yùn)轉(zhuǎn)，無法停止實(shí)驗(yàn)進(jìn)行及時(shí)嚴(yán)格消毒，大大增加了實(shí)驗(yàn)室污染的機(jī)會(huì)。

2 PCR實(shí)驗(yàn)室生物安全問題的解決措施

2.1 對(duì)實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)、維護(hù)工程師規(guī)范化培訓(xùn) 在進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室前應(yīng)有建筑設(shè)計(jì)及暖通工程師對(duì)實(shí)驗(yàn)室的運(yùn)行原理做培訓(xùn)，一定要模擬在不同的通風(fēng)及排風(fēng)狀況時(shí)出現(xiàn)的壓力變化對(duì)實(shí)驗(yàn)室造成的影響，避免因壓力變化可能產(chǎn)生的生物危險(xiǎn)因素。如果因沙塵天氣導(dǎo)致濾膜堵塞，應(yīng)及時(shí)更換初級(jí)濾膜。

排風(fēng)管道是負(fù)壓狀態(tài)，也有可能被致病因子污染，要定期進(jìn)行消毒處理[3］。實(shí)驗(yàn)室內(nèi)設(shè)備的擺放應(yīng)注意是否影響氣流流動(dòng)，應(yīng)利于氣流由清潔區(qū)向污染區(qū)的流動(dòng)，最大限度減少室內(nèi)渦流與回流。

2.2 對(duì)實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)人員規(guī)范化培訓(xùn) 增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)人員的生物安全意識(shí)和基本操作技能是實(shí)驗(yàn)室生物安全管理中的一項(xiàng)重要內(nèi)容，尤其針對(duì)高致病性病毒的檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)室更應(yīng)該具備完善的操作規(guī)程、儀器設(shè)備使用章程、生物安全培訓(xùn)、應(yīng)急處置流程等方面的培訓(xùn)。另外，還應(yīng)該對(duì)實(shí)驗(yàn)室的設(shè)置及運(yùn)行原理、負(fù)壓實(shí)驗(yàn)室的概念、壓力差的設(shè)置、壓力表的應(yīng)用等方面進(jìn)行規(guī)范化培訓(xùn)，使實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)人員對(duì)整個(gè)實(shí)驗(yàn)室的情況都能熟練掌握。

要求實(shí)驗(yàn)操作人員認(rèn)真觀察記錄壓力變化，將被動(dòng)的記錄實(shí)驗(yàn)室壓力變?yōu)橹鲃?dòng)的觀察壓力，及時(shí)發(fā)現(xiàn)壓力表的異常變化，在實(shí)驗(yàn)室壓差不夠的情況下能熟練調(diào)節(jié)壓力表，使每間實(shí)驗(yàn)室的壓差保持在合理的范圍內(nèi)。實(shí)驗(yàn)室人員要充分意識(shí)到壓力表裝錯(cuò)、不調(diào)零、壓力差不達(dá)標(biāo)等問題所造成嚴(yán)重后果。當(dāng)壓力發(fā)生變化時(shí)應(yīng)停止實(shí)驗(yàn)，查找原因，排除故障，避免因此造成的生物安全隱患。

2.3 加強(qiáng)人員個(gè)人防護(hù)，規(guī)范工作流程 根據(jù)不同病毒的生物安全危害要求，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)建立不同等級(jí)的個(gè)人防護(hù)用品使用和管理規(guī)范，使用符合相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的個(gè)人防護(hù)用品。實(shí)驗(yàn)室管理人員應(yīng)定期對(duì)防護(hù)用品的儲(chǔ)備、有效期等進(jìn)行檢查和監(jiān)督管理。

對(duì)缺少緩沖間的實(shí)驗(yàn)室，人員進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室要嚴(yán)格執(zhí)行三級(jí)實(shí)驗(yàn)室防護(hù)制度。待氣壓穩(wěn)定后再進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室，進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室后應(yīng)在5分鐘后等氣壓穩(wěn)定時(shí)再開始實(shí)驗(yàn)。在實(shí)驗(yàn)過程中絕對(duì)不允許擅自開門。操作結(jié)束后，應(yīng)讓生物安全柜繼續(xù)運(yùn)行至少3min來完成柜內(nèi)空氣凈化過程[12］，再打開實(shí)驗(yàn)室門。

2.4 正確選擇和規(guī)范使用生物安全柜 在實(shí)驗(yàn)過程不涉及有機(jī)溶劑或無特殊氣體需要全排情況下，建議PCR實(shí)驗(yàn)室優(yōu)先選擇A2型生物安全柜[5］。在實(shí)際操作過程中，生物安全柜應(yīng)當(dāng)始終保持一定的排風(fēng)量，保證生物安全柜系統(tǒng)的穩(wěn)定性。實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)人員應(yīng)熟練掌握生物安全柜的原理、操作規(guī)范、操作技能，物品擺放原則，操作過程中做到操作緩慢，移動(dòng)物品時(shí)避免交叉污染，避免震動(dòng)引起的壓力波動(dòng)。

在生物安全柜整個(gè)啟閉過程中，每一項(xiàng)操作保證相對(duì)緩慢、平穩(wěn)地進(jìn)行，使壓力波動(dòng)適當(dāng)?shù)乜刂圃谝粋€(gè)可接受的范圍內(nèi)。如果啟閉時(shí)間足夠長(zhǎng)，波動(dòng)風(fēng)量帶來的壓差影響會(huì)慢慢被抵消，則系統(tǒng)穩(wěn)定性將大大提高。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)當(dāng)制定嚴(yán)格的操作規(guī)程，盡量避免由于快速拉起或關(guān)閉窗口而引起瞬時(shí)的風(fēng)量巨變。

2.5 實(shí)驗(yàn)室洗手設(shè)備的改進(jìn) 負(fù)壓實(shí)驗(yàn)室洗手池龍頭應(yīng)是免接觸型的，防護(hù)區(qū)的給水管道應(yīng)設(shè)置倒流防止器或其他有效地防止回流污染的裝置，并且應(yīng)設(shè)在輔助工作區(qū)；給排水系統(tǒng)應(yīng)不滲漏，下水應(yīng)有防回流設(shè)計(jì)，所有圍護(hù)結(jié)構(gòu)表面除同BSL-2外，縫隙均應(yīng)密封。實(shí)驗(yàn)室的工作區(qū)還應(yīng)配備洗眼裝置。

2.6 實(shí)驗(yàn)室嚴(yán)格消毒 實(shí)驗(yàn)室必須做好嚴(yán)格的清潔消毒工作。對(duì)生物安全柜應(yīng)當(dāng)定期進(jìn)行檢測(cè)、清潔消毒與保養(yǎng)。每日實(shí)驗(yàn)前、實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，按照要求對(duì)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行嚴(yán)格徹底的清潔消毒，防止實(shí)驗(yàn)室污染的發(fā)生。

在實(shí)驗(yàn)室滿負(fù)荷運(yùn)行的情況下，更應(yīng)該按要求對(duì)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行嚴(yán)格消毒。PCR實(shí)驗(yàn)前應(yīng)用75%乙醇對(duì)試劑準(zhǔn)備區(qū)及標(biāo)本制備區(qū)生物安全柜和臺(tái)面進(jìn)行消毒后再用紫外線照射30min，然后打開生物安全柜風(fēng)機(jī)運(yùn)行15~30min，等生物安全柜內(nèi)形成穩(wěn)定且潔凈的氣流循環(huán)后開始實(shí)驗(yàn)。

3 小結(jié)

呼吸道病毒暴發(fā)以后，對(duì)實(shí)驗(yàn)室的生物安全的重視程度有了很大的提高[13］。近兩年，實(shí)驗(yàn)室的生物安全又提到了新的高度。疫情防控常態(tài)化階段，PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)工作是疫情防控重要的技術(shù)支撐。健全的實(shí)驗(yàn)室生物安全體系是確保PCR實(shí)驗(yàn)室穩(wěn)定、高效、安全運(yùn)行的前提條件和重要保障。針對(duì)目前各個(gè)實(shí)驗(yàn)室存在的問題，實(shí)驗(yàn)室在設(shè)計(jì)設(shè)置、人員培訓(xùn)、管理監(jiān)督等方面還需要進(jìn)一步的完善和加強(qiáng)，各實(shí)驗(yàn)室對(duì)人員、設(shè)備和物資儲(chǔ)備方案仍需進(jìn)一步細(xì)化，應(yīng)急預(yù)案還有待進(jìn)一步完善。

目前根據(jù)疫情防控需求，國(guó)內(nèi)大量PCR實(shí)驗(yàn)室投入使用，許多醫(yī)院是改建的PCR實(shí)驗(yàn)室，部分實(shí)驗(yàn)室分區(qū)設(shè)置不合理，實(shí)驗(yàn)室存在人流、氣流、標(biāo)本流不能實(shí)現(xiàn)單向流動(dòng)，壓力梯度不合格，實(shí)驗(yàn)室分散，監(jiān)管困難等現(xiàn)況。其次，人員培訓(xùn)管理不到位，操作不規(guī)范，尤其是新建實(shí)驗(yàn)室底子薄，新入崗的實(shí)驗(yàn)人員生物安全意識(shí)薄弱，專業(yè)知識(shí)技能還有待提高。為保證實(shí)驗(yàn)室環(huán)境及檢測(cè)人員的安全，建議將實(shí)驗(yàn)室的運(yùn)行安全納入生物安全管理手冊(cè)，并對(duì)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行不定期檢查及監(jiān)管。各地區(qū)應(yīng)高度重視PCR實(shí)驗(yàn)室的建設(shè)和管理，保證實(shí)驗(yàn)室設(shè)備儀器的配備和專業(yè)檢測(cè)人員的儲(chǔ)備，確保人員安全和實(shí)驗(yàn)室安全，為疫情防控做好保障。

面對(duì)PCR實(shí)驗(yàn)室地域上分散，監(jiān)管難度大，建議各地區(qū)將PCR實(shí)驗(yàn)室聯(lián)網(wǎng)并納入統(tǒng)一管理，創(chuàng)建智能化、信息化管理的監(jiān)管平臺(tái)。通過監(jiān)管平臺(tái)對(duì)實(shí)驗(yàn)室工作環(huán)境、區(qū)域、工作流程、人員防護(hù)、實(shí)驗(yàn)檢測(cè)等各個(gè)環(huán)節(jié)及風(fēng)險(xiǎn)點(diǎn)進(jìn)行全方位管理和監(jiān)控，尤其對(duì)實(shí)驗(yàn)室的壓力、人員、標(biāo)本流動(dòng)的重要環(huán)節(jié)等納入統(tǒng)一監(jiān)管，提升PCR實(shí)驗(yàn)室的監(jiān)管水平，對(duì)可能帶來生物安全隱患的各個(gè)風(fēng)險(xiǎn)點(diǎn)進(jìn)行預(yù)警，及時(shí)發(fā)現(xiàn)生物安全隱患并排除隱患，減少或杜絕實(shí)驗(yàn)室污染和人員感染，保證實(shí)驗(yàn)室的生物安全，同時(shí)也保證了實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量控制。