楊星瑩 朱威巍 江麗 爨向丹 盛軍 黃艷蘋1,

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)/普洱茶學(xué)教育部重點實驗室 云南昆明 650201；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院 云南昆明 650201；3.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院 云南昆明 650201；4.云南省高原特色農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)研究院 云南昆明 650201）

肺癌是目前惡性腫瘤死亡的首要原因[1]，在腫瘤治療中備受關(guān)注。肺癌又被分為小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌，其中非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）約占肺癌總數(shù)的85%以上[2]。非小細(xì)胞肺癌分為肺腺癌、鱗狀細(xì)胞癌（SCC）和大細(xì)胞肺癌（LCC）的組織學(xué)亞型，以上病癥每年造成150 多萬人死亡[3-4]。表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）屬于人表皮受體酪氨酸激酶家族的一員，該家族還包括人表皮生長因子受體 2、3、4[HER2/neu（ERBB2），HER3（ERBB3）和HER4（ERBB4）]3 個成員[5-6]。EGFR 參與調(diào)節(jié)多種細(xì)胞生命過程，如增殖、分化、存活等[7]。EGFR主要包括4 個部分：胞外配體結(jié)合域、跨膜域、酪氨酸激酶域和C 端尾[8]。當(dāng)EGFR 與配體（EGF）結(jié)合后，胞內(nèi)的酪氨酸激酶域會發(fā)生動態(tài)構(gòu)象變化，通過首尾相連的方式形成不對稱二聚體，使胞內(nèi)C 端酪氨酸激酶殘基發(fā)生磷酸化[9]。肺癌患者具有極低的存活率[10]，科學(xué)家們在這些患者的肺癌腫瘤中發(fā)現(xiàn)EGFR 的表達(dá)量明顯高于常人[11]。因此靶向EGFR 治療非小細(xì)胞肺癌具有重要意義。

本實驗所用化合物L(fēng)upalbigenin（LG）是一種類黃酮天然化合物。已有文獻(xiàn)報道，從Derrisscandens中分離出的LG 可以誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞系發(fā)生死亡[12]。Ausawasamrit 等[13]發(fā)現(xiàn)，LG可以通過影響蛋白激酶B（AKT）和細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（Erk）的磷酸化來誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞發(fā)生凋亡。還有研究報道，LG 通過下調(diào)炎癥基因和蛋白表達(dá)來抑制NF-κB 信號的傳導(dǎo)[14]。根據(jù)前人LG在癌癥和炎癥治療方面的相關(guān)研究，本研究對LG抑制EGFR 野生型肺癌細(xì)胞增殖作用機(jī)制進(jìn)行研究。構(gòu)建Ba/F3 EGFR WT 細(xì)胞并經(jīng)過單克隆、流式細(xì)胞術(shù)、Western blot 檢測EGFR 表達(dá)量，通過MTS 法篩選出化合物L(fēng)G，使用LG 處理細(xì)胞，從細(xì)胞存活率、細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞凋亡情況、周期阻滯情況、信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)變化方面闡述LG 抑制Ba/F3 EGFR WT 肺癌細(xì)胞增殖作用機(jī)制。驗證LG是否能抑制Ba/F3 EGFR WT 細(xì)胞增殖，并且在EGF 存在時依舊能抑制細(xì)胞存活，以期為治療EGFR 野生型非小細(xì)胞肺癌患者提供新的基礎(chǔ)研究理論，同時為天然化合物治療人類疾病提供相關(guān)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗所用化合物L(fēng)G，分子式C25H26O5，純度99%，購于云南西力生物技術(shù)股份有限公司，其結(jié)構(gòu)式如圖1 所示。實驗用細(xì)胞Ba/F3 購于美國典型培養(yǎng)物保藏中心（Manassas，VA，USA），并在含有10% FBS、1% P/S 和5%白介素3（IL3）的1640 培養(yǎng)基中于37℃下在含5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)（BINDER；Tuttlingen，Ger-many）。實驗用抗體購于Cell Signaling Technology 公司。

1.2 方法

1.2.1 試驗設(shè)計將EGFR WT 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌中擴(kuò)大培養(yǎng)，使用無內(nèi)毒素大提質(zhì)粒試劑盒提取質(zhì)粒測定濃度后，使用電轉(zhuǎn)染將質(zhì)粒導(dǎo)入Ba/F3 細(xì)胞。經(jīng)過轉(zhuǎn)化實驗、抗生素篩選、單克隆實驗得到高表達(dá)EGFR 的Ba/F3 EGFR WT 野生型肺癌細(xì)胞。使用MTS 法篩選化合物L(fēng)G，再確定有效濃度，選取2 個有效濃度分別聯(lián)合EGF 處理Ba/F3 EGFR WT 細(xì)胞。試驗設(shè)6 個處理組：對照組，Control；EGF 組：EGF；5 μmol/L 的LG組，LG 5 μmol/L；5 μmol/L 的LG 聯(lián)合應(yīng)用EGF組，LG 5 μmol/L+EGF；10 μmol/L 的LG 組，LG 10 μmol/L；10 μmol/L 的LG 聯(lián)合應(yīng)用EGF 組，LG 10 μmol/L+EGF。依次檢測6 個處理組細(xì)胞存活率、細(xì)胞狀態(tài)、EGFR 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)變化、凋亡水平和周期阻滯情況。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)與傳代當(dāng)細(xì)胞單層布滿細(xì)胞培養(yǎng)瓶時，在超凈工作臺中，用移液器吹勻細(xì)胞后取出轉(zhuǎn)移至離心管中1 000 r/min 離心3 min，棄上清。加入無菌、預(yù)熱的PBS 吹勻洗滌，1 000 r/min 離心3 min，棄上清后加入完全培養(yǎng)基輕吹混勻細(xì)胞，分別移入兩個T25 細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)充適量相應(yīng)的完全培養(yǎng)基觀察狀態(tài)后置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.3 質(zhì)粒提取將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌；添加適量抗生素培養(yǎng)篩選并擴(kuò)大培養(yǎng)目的菌種，收集離心后，使用無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒提取目的質(zhì)粒，使用分光光度計測定質(zhì)粒濃度，保存質(zhì)粒備用。

1.2.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染收集狀態(tài)良好的Ba/F3 細(xì)胞，經(jīng)過計數(shù)計算使用轉(zhuǎn)染試劑盒中的T Buffer 將細(xì)胞Ba/F3 密度調(diào)整為5×107個/mL，并按照比例與質(zhì)?；旌?，電轉(zhuǎn)槍取一槍細(xì)胞密度為 5×106或2×106個/100 μL。在電轉(zhuǎn)杯內(nèi)加入3 mL E Buffer。通過NeonTM電轉(zhuǎn)染系統(tǒng)選擇合適程序?qū)①|(zhì)粒導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)。轉(zhuǎn)染完成的細(xì)胞用新鮮1640 培養(yǎng)基（含有10% FBS）混勻，細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h 后加入篩選抗生素擴(kuò)大培養(yǎng)。

1.2.5 細(xì)胞篩選細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h 之后，將細(xì)胞培養(yǎng)基替換為完全培養(yǎng)基（含有10% FBS，1% P/S）。48 h 后加入嘌呤霉素，正常進(jìn)行細(xì)胞傳代與換液。

1.2.6 細(xì)胞單克隆取狀態(tài)穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染細(xì)胞離心后，重懸、計數(shù)，96 孔板接單克隆，保證每個孔0.5 個細(xì)胞。混勻含有細(xì)胞的混合液，用排槍將細(xì)胞液轉(zhuǎn)移到96 孔板中，每孔200 μL，周圍用無菌PBS 填充。置于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)10 d，在顯微鏡下逐孔觀察，將單一細(xì)胞團(tuán)轉(zhuǎn)移到小皿中，根據(jù)細(xì)胞生長狀態(tài)及密度逐步擴(kuò)大培養(yǎng)。

1.2.7 MTS 檢測細(xì)胞增殖將細(xì)胞密度調(diào)整為每100 μL 5×104個細(xì)胞，用無酚紅1 640 培養(yǎng)基混勻，接種于96 孔板中，恒溫培養(yǎng)箱靜置4 h；再加入含有藥物的培養(yǎng)基 100 μL/孔，總體積200 μL/孔，置于37℃培養(yǎng)箱處理48 h；加入MTS溶液，20 μL/孔，避光孵育3～4 h，震蕩5～10 min充分溶解結(jié)晶物。將96 孔板放于酶標(biāo)儀中，在492 nm 處讀取細(xì)胞的吸光值。

1.2.8 細(xì)胞蛋白表達(dá)檢測

（1）細(xì)胞蛋白提取 取經(jīng)過藥物處理的細(xì)胞1 000 r/min，離心3 min，棄上清；冰PBS 清洗一遍離心后棄上清，加入高效裂解液（PMSF:RIPA高效裂解液=1∶100），冰上裂解30 min，放入4℃離心機(jī)，15 000 g，離心20 min，吸出上清，放于冰上備用。

（2）蛋白濃度測定 37℃恒溫孵育30 min，使用多通道酶標(biāo)儀測定吸光度，測定波長分別為560 和630 nm，測定數(shù)值均扣除空白孔吸光值，代入計算公式得到樣品蛋白濃度。

（3）蛋白電泳與轉(zhuǎn)膜 將蛋白樣品按順序依次加入凝膠泳道，電泳第一階段電壓為50 V，待蛋白跑出濃縮膠后增加電壓至120 V，根據(jù)目的蛋白分子量調(diào)節(jié)第二階段時間。將分離膠與甲醇激活的PVDF 膜帖在一起，放入轉(zhuǎn)膜夾中卡入轉(zhuǎn)膜槽，設(shè)置電流為200 mA，轉(zhuǎn)膜時間為60 min。

（4）化學(xué)發(fā)光 配制化學(xué)發(fā)光液（A∶B=1∶1），混勻，將膜與發(fā)光液充分接觸，點擊“Expose”開始曝光。曝光時間根據(jù)出現(xiàn)條帶的曝光程度自動選擇曝光停止時間，曝光停止后選擇合適的圖片拷貝。

1.2.9 數(shù)據(jù)分析與統(tǒng)計采用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行顯著性分析[（mean+SEM），one-way ANOVA]，*p<0.05 為差異顯著，**p<0.01 為差異有明顯顯著，***p<0.001 為差異極顯著。使用GraphPad Prism8 作圖軟件，對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行作圖。細(xì)胞存活率=[（As–Ab）]/[(Ac–Ab)]×100%，As：驗孔吸光度；Ac：對照孔吸光度；Ab：空白孔吸光度。細(xì)胞抑制率=1–細(xì)胞存活率。

2 結(jié)果與分析

2.1 穩(wěn)定表達(dá)EGFR 細(xì)胞株構(gòu)建

通過電穿孔轉(zhuǎn)染法成功構(gòu)建 Ba/F3 EGFR WT 細(xì)胞，該細(xì)胞可脫離IL3 獨(dú)立生長。通過流式細(xì)胞技術(shù)對單克隆細(xì)胞EGFR 表達(dá)水平進(jìn)行檢測，如圖2-a 所示，EGFR 表達(dá)量為98.04%。同時利用Western blot 檢測Ba/F3 細(xì)胞和Ba/F3 EGFR WT 細(xì)胞的EGFR 蛋白表達(dá)水平。結(jié)果如圖2-b 所示，Ba/F3 EGFR WT 細(xì)胞高表達(dá)EGFR蛋白，因此細(xì)胞系構(gòu)建成功，可以進(jìn)行后續(xù)實驗。

2.2 MTS 法篩選化合物并確定有效濃度

基于云南農(nóng)業(yè)大學(xué)普洱茶教育部重點實驗室化合物庫中的天然化合物選擇5 種化合物見表1，濃度5 μmol/L，在Ba/F3 EGFR WT 細(xì)胞上使用MTS 法進(jìn)行篩選。其中Lupalbigenin（LG）能夠抑制Ba/F3 EGFR WT 細(xì)胞增殖，如圖3-a 所示，LG 將Ba/F3 EGFR WT 細(xì)胞存活降低至50%以下，如圖3-b 所示，并且隨著LG 濃度的升高細(xì)胞存活逐漸降低。

表1 化合物信息

2.3 LG 改變Ba/F3 EGFR WT 細(xì)胞形態(tài)

LG 處理Ba/F3 EGFR WT 細(xì)胞15 h 后其細(xì)胞形態(tài)如圖4 所示?？梢钥闯觯珺a/F3 EGFR WT 細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化。對照組的Ba/F3 EGFR WT細(xì)胞形態(tài)圓潤透亮有光澤，在培養(yǎng)液中下層且生長密集。處理組（LG 10 μmol/L+EGF）細(xì)胞狀態(tài)明顯改變，體積明顯縮小、細(xì)胞膜破裂呈碎片、呈不透亮的狀態(tài)。

2.4 LG 對Ba/F3 EGFR WT 細(xì)胞EGFR 信號通路的影響

經(jīng)過1 h 的處理后，LG 10 μmol/L+EGF 組顯著抑制Ba/F3 EGFR WT 細(xì)胞EGFR 相關(guān)蛋白磷酸化表達(dá)，降低了P-EGFR、P-Erk、P-Gsk-3β和P-S6蛋白表達(dá)水平（圖5）。表明10 μmol/L 的LG 可以抑制EGFR 下游信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)，并且在EGF 存在時也有抑制效果。

2.5 LG對Ba/F3 EGFR WT細(xì)胞凋亡率的影響

經(jīng)過15 h 的處理后，EGF 組凋亡率低于對照（Control），LG 10 μmol/L 凋亡率最高。LG 10 μmol/L+EGF 組凋亡率有所回升，但也高于對照組（Control）、EGF 組和兩個低濃度組（LG 5 μmol/L 和LG 5 μmol/L+EGF）（圖6）。表明10 μmol/L 的LG 可以增加Ba/F3 EGFR WT 細(xì)胞凋亡率。

2.6 LG 對Ba/F3 E GFR WT 細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響

經(jīng)過15 h 處理后，LG 10 μmol/L+EGF 組與其他組相比，可以上調(diào)Bax 和下調(diào)Bcl-2 蛋白的表達(dá)，誘導(dǎo)Cytochrome-C 釋放，激活Caspase-3、Caspase-6、Caspase-7，使得Cleaved-Caspase-3、Cleaved-Caspase-6、Cleaved-Caspase-7 的表達(dá)上調(diào)（圖7）。這表明LG 通過激活Bcl-2 家族、釋放 Cytochrome-C 來激活 Caspase 家族，通過Caspase-3、Caspase-6 和 Caspase-7 執(zhí)行Ba/F3 EGFR WT 細(xì)胞凋亡，且在EGF 存在時細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)增加。

2.7 LG 對Ba/F3 E GFR WT 細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響

經(jīng)過15 h 處理后，LG 10 μmol/L+EGF 組與其他組相比，上調(diào)細(xì)胞內(nèi)P27 蛋白表達(dá)（圖8），阻抑細(xì)胞周期由G1/S 期向下一時期轉(zhuǎn)移，從而抑制CDK6 蛋白的表達(dá)，進(jìn)而抑制Cyclin D1 的表達(dá)，將Ba/F3 EGFR WT 細(xì)胞的周期阻滯在G1/S期，同時對 Cyclin A2 的表達(dá)也有抑制作用，Cyclin A2 蛋白的調(diào)控周期是S 期。表明LG 能夠?qū)a/F3 EGFR WT 細(xì)胞的周期阻滯在G1/S 期，且在EGF 存在時對細(xì)胞周期相關(guān)蛋白阻滯效果更加明顯。

3 討論與結(jié)論

3.1 討論

本實驗用的轉(zhuǎn)染方法是電穿孔轉(zhuǎn)染法[15]，使用NeonTM電轉(zhuǎn)染系統(tǒng)。利用Ba/F3 細(xì)胞自身不表達(dá)EGFR、依賴于白介素3（IL3）且生長迅速易于轉(zhuǎn)染等特點，以Ba/F3 為模式細(xì)胞使用電轉(zhuǎn)染的方法將EGFR WT 質(zhì)粒導(dǎo)入Ba/F3 細(xì)胞，構(gòu)建了Ba/F3 EGFR WT 細(xì)胞。根據(jù)普洱茶學(xué)教育部重點實驗室前期的實驗基礎(chǔ)，EGFR WT 轉(zhuǎn)染條件為1 400 V，20 ms，2 pulse。已有文獻(xiàn)報道，用Ba/F3 細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)EGFR 的Ba/F3 細(xì)胞[16]。Xie 等[17]通過使用IL3 剝奪法成功構(gòu)建表達(dá) EGFR-insH 突變的 Ba/F3 細(xì)胞系（Ba/F3-insH 細(xì)胞系）。Yuza 等[18]通過抗生素篩選和IL3 獨(dú)立篩選構(gòu)建了表達(dá)3 個EGFR 20 號外顯子突變的Ba/F3 細(xì)胞。為了獲得單一來源且穩(wěn)定表達(dá)EGFR 的細(xì)胞株，在培養(yǎng)基中添加篩選抗生素對Ba/F3 EGFR WT 細(xì)胞進(jìn)行單克隆培養(yǎng)。證明Ba/F3 EGFR WT 細(xì)胞能夠脫離IL3 獨(dú)立生長，且通過流式細(xì)胞術(shù)和Western blot 實驗證明是高表達(dá)EGFR 的野生型肺癌細(xì)胞。因此本實驗采用的細(xì)胞系構(gòu)建方法是成功的，可以為質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和細(xì)胞系構(gòu)建提供新的方法和思路。

已有研究表明，EGFR 信號的異?；罨捌鋵?dǎo)致的下游信號激活與癌癥的驅(qū)動因素（標(biāo)志特征）密切相關(guān)[19]，使用靶向藥物特異性地封閉EGFR 信號，將對癌癥的治療產(chǎn)生重要影響。目前關(guān)于EGFR 的靶向藥物主要包括單抗類藥物和小分子酪氨酸激酶抑制劑[20]。2004 年6 月，美國科學(xué)家Lynch 等[21]和Paez 等[22]發(fā)現(xiàn)，具有EGFR突變的肺癌患者使用靶向藥物治療可以有更好的治療效果。研究結(jié)果顯示，吉非替尼（Gefitinib）在治療具有EGFR 突變的腫瘤患者有效率高達(dá)80%以上，而這種藥物在治療無突變的野生型（Wild-Type）腫瘤患者基本無效[23]，隨后這一觀點，在一年內(nèi)相繼被Mu 等[24]、Mitsudomi 等[25]、Han 等[26]和Huang 等[27]各國科學(xué)家證實。因此為野生型EGFR 肺癌患者尋找新的治療方案和藥物成為科學(xué)家研究的難題。

由于癌癥機(jī)制復(fù)雜性，不同藥物的敏感性和耐藥性、缺乏標(biāo)志物以及藥物監(jiān)管測試都給靶向藥物的上市帶來巨大挑戰(zhàn)[28]。不乏患者在接受靶向藥物治療時產(chǎn)生許多副作用，如皮疹、腹瀉和血壓等問題[29]，因此人們將目光轉(zhuǎn)向來源廣泛、毒副作用小的天然化合物。天然化合物種類繁多，許多天然化合物的抗癌潛力已被開發(fā)[30]。90 年代中期，有2 種喜樹堿類拓?fù)涮婵岛鸵亮⑻婵礫31-32]獲得FDA 批準(zhǔn)用于治療各種類型的癌癥。2005年紫杉醇獲批用于治療轉(zhuǎn)移性乳腺癌、胰腺癌和非小細(xì)胞肺癌[33]。目前大部分抗癌藥物是天然產(chǎn)物來源[34]，已有文獻(xiàn)報道，天然化合物L(fēng)G 能夠誘導(dǎo)人大細(xì)胞肺癌細(xì)胞死亡[13]，但并未明確靶點。對于非小細(xì)胞肺癌，LG 可以抑制EGFR 相關(guān)蛋白磷酸化，因此以EGFR 為作用靶點進(jìn)行一系列驗證。由于此實驗未開展動物實驗，LG 在體內(nèi)表現(xiàn)還不明確，其與EGFR 具體結(jié)合位點還有待進(jìn)一步確認(rèn)。

3.2 結(jié)論

經(jīng)實驗結(jié)果證明，LG 在調(diào)控EGFR 野生型肺癌細(xì)胞增殖方面起到重要作用，其機(jī)制主要是通過抑制Ba/F3 EGFR WT 細(xì)胞EGFR 及下游相關(guān)蛋白磷酸化水平表達(dá)，進(jìn)而靶向細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期，從而通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來抑制野生型EGFR肺癌細(xì)胞Ba/F3 EGFR WT 的存活。本研究有望為調(diào)控野生型EGFR 肺癌腫瘤提供藥物開發(fā)的新思路。