康巍，張戈，張京家，段思蒙，王瞳，李進(jìn)，皇甫芷如，徐英春，張麗

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院檢驗(yàn)科，侵襲性真菌病機(jī)制研究與精準(zhǔn)診斷北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100730

兩性霉素 Ba（amphotericin B ，AmB）是一種大環(huán)多烯類抗菌藥物，因其能特異地與真菌細(xì)胞膜上麥角固醇結(jié)合而用于抗真菌治療[1]。AmB對大多數(shù)侵襲性真菌，包括酵母菌和絲狀真菌均具有良好的體外活性。AmB自 1959 年上市以來，在侵襲性真菌感染臨床治療中發(fā)揮著重要作用[2]。

AmB普通制劑，即AmB脫氧膽酸鹽（amphotericin B deoxycholate，AmBD），因其具有治療劑量依賴性、腎毒性和輸注相關(guān)的不良反應(yīng)，大大地限制了其臨床應(yīng)用?；贏mB所研制的商業(yè)配方AmB的脂質(zhì)體制劑，已被證明可以降低AmB的不良反應(yīng)，同時(shí)保持藥物的活性[3]。目前，市面上廣泛應(yīng)用的AmB脂質(zhì)體制劑有以AmBisome為代表的AmB脂質(zhì)體（liposomal amphotericin B，L～AmB）、以Abelcet為代表的AmB脂質(zhì)復(fù)合物（amphotericin B lipid complex，ABLC）和以Amphocil/Amphotec為代表的AmB膠體分散體（amphotericin B colloidal dispersion，ABCD）3種劑型。3種AmB脂質(zhì)體制劑均含有AmB，但在脂質(zhì)組成、形狀、大小、穩(wěn)定性、藥動(dòng)學(xué)和毒性方面存在差異，這些差異可能會(huì)影響各種制劑的治療用途[4]。

本研究所用注射用AmB脂質(zhì)體均為L～AmB劑型。通過對比分析國產(chǎn)、進(jìn)口注射用L～AmB制劑、注射用AmBD制劑與AmB標(biāo)準(zhǔn)品對常見念珠菌以及絲狀真菌的體外藥物敏感性；評估4種AmB制劑體外抗真菌活性的差異；觀察4種AmB制劑對侵襲性真菌的體外藥物敏感性，為臨床抗真菌治療提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

本研究選取中國醫(yī)院侵襲性真菌病監(jiān)測網(wǎng)（CHIF～NET）2018年收集的菌株，均分離自患者血液、組織、引流液、導(dǎo)管等無菌部位。納入15種酵母菌（317株），其中白念珠菌 44 株、熱帶念珠菌 43 株、光滑念珠菌 43 株、近平滑念珠菌43 株、克柔念珠菌 29 株、隱球菌37株、希木龍念珠菌9株、葡萄牙念珠菌19株，及其他臨床少見酵母菌50株。此外，納入6 種絲狀真菌（76 株），其中煙曲霉 20 株、黃曲霉 12 株、土曲霉 12 株、黑曲霉 10 株、鐮刀菌12 株、構(gòu)巢曲霉 10 株。質(zhì)量控制菌株為近平滑念珠菌 ATCC22019，克柔念珠菌 ATCC6258[5]。

1.2 藥品與試劑

國產(chǎn)注射用L～AmB制劑（注射用兩性霉素B脂質(zhì)體，石藥集團(tuán)中諾藥業(yè)，批號830190703）；進(jìn)口注射用L～AmB制劑（注射用兩性霉素B脂質(zhì)體，Ambisome，Gilead Science， Inc.，批號 15750）；注射用AmBD制劑（注射用兩性霉素B，商品名：歐泊，華北制藥股份有限公司，國藥準(zhǔn)字H13020285，批號FFLD190701）；AmB 標(biāo)準(zhǔn)品（歐洲藥品質(zhì)量管理局，批號Y0000005）。

二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO，Sigma公司）；聚山梨酯 20（Solarbio公司）；0.9%氯化鈉溶液（華潤雙鶴藥業(yè)股份有限公司）；科馬嘉顯色培養(yǎng)基（法國科馬嘉公司）；沙保弱培養(yǎng)基（英國 Oxoid 公司）；RPMI1640 培養(yǎng)基（德國Sigma～Aldrich 公司），含谷氨酰胺不含碳酸氫鹽并以酚紅為指示劑，使用 0.165 mol/L MOPS 緩沖液（MOPS Buffer）調(diào) pH（ 7.0±0.1)。

1.3 儀器

無菌U型96孔板（江蘇省海門盛泰實(shí)驗(yàn)器材廠）； Sentititre AIM全自動(dòng)加樣儀（賽默飛世爾科技公司）；VITEK MS基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI～TOF～MS，法國生物梅里埃公司）；恒溫培養(yǎng)箱（賽默飛世爾科技公司）；比濁儀（法國生物梅里埃公司）。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 微量肉湯稀釋法藥敏試驗(yàn)

按照美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）M27～ED4 與 M38～ED3 文件嚴(yán)格操作[6～7]。測試藥物包括 AmB 標(biāo)準(zhǔn)品（0.03～16μg/ml）、進(jìn)口注射用 L～AmB 制劑（0.03～16μg/ml）、國產(chǎn)注射用L～AmB制劑（0.03～16μg/ml）、注射用AmBD制劑（0.03～16μg/ml）。按照溶解性分別采用DMSO或純化水溶解抗真菌藥物，獲得相應(yīng)濃度的儲(chǔ)存液。使用RPMI1640培養(yǎng)基將儲(chǔ)存液依次對比稀釋至相應(yīng)濃度并加入96孔板中，每孔100μl。

多數(shù)絲狀真菌在沙堡弱培養(yǎng)基中于 35℃條件下孵育48h，直至形成良好的孢子；鐮刀菌屬在 35℃條件下孵育48～72h后，在 25℃條件下孵育至第7天；所有的酵母菌均在沙堡弱培養(yǎng)基中傳代2次，均在35℃條件下孵育48h以確保菌株純度和存活率。入組菌株均使用MALDI～TOF～MS進(jìn)行細(xì)菌鑒定。

酵母菌用無菌0.9%氯化鈉溶液洗脫，使用比濁儀調(diào)制成0.5麥?zhǔn)蠞岫?，加?RPMI 1640 培養(yǎng)基繼續(xù)稀釋 1000倍，使接種終濃度達(dá)到 0.5×103～ 2.5×103菌落形成單位（CFU）/ml。使用含 0.1%聚山梨酯20的0.9%氯化鈉溶液將絲狀真菌調(diào)制成較濃的懸濁液，待菌絲靜置沉降后，吸取上清液調(diào)制成 0.5 麥?zhǔn)蠞岫?，加?RPMI 1640培養(yǎng)基進(jìn)一步稀釋 50 倍，使接種終濃度達(dá)到 0.4×104～5×104CFU/ml。

按照濃度由高到低將上述真菌的 RPMI1640 培養(yǎng)基依次加入藥敏板（96孔板）中，置于35℃條件下培養(yǎng)。待念珠菌孵育24h，毛孢子菌與絲狀真菌孵育48h，隱球菌孵育72h后，讀取藥敏試驗(yàn)結(jié)果。與生長對照孔相比，各AmB制劑及標(biāo)準(zhǔn)品讀取100%抑制的最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）值。

每批測試中，均使用質(zhì)量控制菌株近平滑念珠菌 ATCC22019，克柔念珠菌 ATCC6258監(jiān)控實(shí)驗(yàn)質(zhì)量，保證測試MIC的準(zhǔn)確性。

1.4.2 數(shù)據(jù)分析方法

采用WHONET 5.6軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。根據(jù)MIC 值統(tǒng)計(jì)MIC范圍、MIC50、MIC90和幾何平均數(shù)（geometric mean，GM），比較4種AmB制劑體外藥敏差異。計(jì)算國產(chǎn)與進(jìn)口L～AmB制劑之間的基本一致性（essential agreement， EA）。EA指被待測藥物檢測 MIC 值與參考藥物相差不超過 1 個(gè)稀釋倍數(shù)。

2 結(jié)果

每批測試中，質(zhì)量控制菌株的MIC值均在質(zhì)控范圍內(nèi)。

表1總結(jié)了不同AmB制劑及標(biāo)準(zhǔn)品對 317 株酵母菌的MIC范圍、MIC50、MIC90、GM以及脂質(zhì)體制劑間的EA。結(jié)果提示，4種AmB制劑對多數(shù)臨床常見念珠菌和隱球菌的MIC50和MIC90值均≤2μg/ml；2種注射用L～AmB 制劑對希木龍念珠菌的MIC50和MIC90值分別為8μg/ml和16μg/ml；AmB標(biāo)準(zhǔn)品和進(jìn)口注射用L～AmB制劑對部分臨床少見念珠菌的MIC50和MIC90值為4μg/ml；商品制劑（注射用AmBD制劑以及2種注射用L～AmB制劑）對所測試的多數(shù)念珠菌活性均比AmB標(biāo)準(zhǔn)品的MIC低；但4種AmB制劑對隱球菌以及部分臨床少見念珠菌的MIC分布相近。

表1 4種AmB制劑對酵母菌的體外敏感性差異 n=317

續(xù)表

續(xù)表

表2總結(jié)了不同AmB制劑及標(biāo)準(zhǔn)品對76株絲狀真菌的MIC 范圍、MIC50、MIC90、GM以及L～AmB制劑之間的EA。結(jié)果提示，4種AmB制劑對煙曲霉、黃曲霉和黑曲霉的MIC50和MIC90值均≤1μg/ml。與酵母菌相似的是，商品制劑（注射用AmBD制劑以及2種注射用L～AmB制劑）對所測試的多數(shù)菌種活性均比AmB標(biāo)準(zhǔn)品MIC低。但在部分土曲霉、鐮刀菌和構(gòu)巢曲霉中，L～AmB制劑的活性比標(biāo)準(zhǔn)品及AmBD制劑高出3～4個(gè)稀釋倍數(shù)。2種L～AmB制劑對土曲霉、鐮刀菌和構(gòu)巢曲霉的MIC90值均為16μg/ml。

表2 4種AmB制劑對絲狀真菌的體外藥物敏感性差異 n=76

續(xù)表

在測試的4種AmB制劑中，多數(shù)情況下國產(chǎn)注射用L～AmB制劑MIC較低，而AmB標(biāo)準(zhǔn)品MIC偏高。2種非脂質(zhì)體制劑MIC分布相近，2種L～AmB制劑對于大多數(shù)菌種的EA均為100%，僅有 1 株熱帶念珠菌與 2 株近平滑念珠菌的國產(chǎn)L～AmB制劑比進(jìn)口L～AmB制劑MIC 值低 2 個(gè)稀釋倍數(shù)，2種L～AmB制劑對于熱帶念珠菌和近平滑念珠菌的EA分別為98%和95%。

3 討論

AmB自上市以來，一直以良好的抗真菌活性應(yīng)用于臨床的抗真菌治療中。一項(xiàng)體外藥物敏感性研究發(fā)現(xiàn)[8]，AmB對該研究納入的毛霉、根霉等26株毛霉菌目真菌的MIC值均＜2μg/ml，伏立康唑的MIC值均＞4μg/ml，提示目前AmB仍具有良好的抗真菌活性。但AmB的腎毒性和輸注相關(guān)反應(yīng)同樣限制了其在臨床治療中的應(yīng)用，而AmB脂質(zhì)體相較于普通AmB注射制劑，可大大降低腎毒性等不良反應(yīng)。多項(xiàng)臨床研究表明[9～11]，應(yīng)用AmB脂質(zhì)體對患者進(jìn)行抗真菌治療，其腎毒性和輸注相關(guān)反應(yīng)等的不良事件發(fā)生率低于普通注射劑型，可使真菌感染患者獲得更好的臨床治療效果。自20世紀(jì)90年代AmB脂質(zhì)體制劑被研制出并成功上市，AmBisome等脂質(zhì)體制劑在臨床實(shí)踐中廣泛應(yīng)用，但其治療費(fèi)用較高。目前，國產(chǎn)AmB脂質(zhì)體的陸續(xù)上市將給患者帶來更多臨床獲益。

本研究中AmB標(biāo)準(zhǔn)品在多數(shù)菌種中抗菌活性較3種商品試劑MIC偏高，其原因可能為AmB容易受到光照、溫度等環(huán)境因素影響。通過添加脫氧膽酸鈉（增溶劑）或抗氧化劑以及使用脂質(zhì)體包裹等方式，使商品制劑中的AmB較標(biāo)準(zhǔn)品在相同的環(huán)境下可以更好地保持藥物穩(wěn)定性以及抗菌活性[12]。

在既往研究中[13～16]，使用不同的AmB脂質(zhì)體制劑進(jìn)行體外抗真菌活性研究，發(fā)現(xiàn)部分菌株中其體外藥物活性弱于非脂質(zhì)體制劑，其可能與受到體外環(huán)境下脂質(zhì)體制劑釋放AmB限制有關(guān)。既往研究表明ABLC制劑釋放活性AmB受到所接觸細(xì)胞釋放的磷脂酶的影響[14]。Swenson 等[14]研究證實(shí)了某些酵母菌可產(chǎn)生足夠的磷脂酶可幫助ABLC制劑釋放AmB，以達(dá)到殺菌目的。由于部分真菌自身分泌不足，導(dǎo)致其體外藥物敏感性較低。在培養(yǎng)基中添加磷脂酶可以恢復(fù)ABLC制劑的抗真菌活性。研究還指出，某些在體外對 ABLC制劑耐藥而對AmB敏感的曲霉屬分離株在小鼠體內(nèi)模型中仍表現(xiàn)敏感[14]。

ABLC與L～AmB同為兩性霉素B的脂質(zhì)體制劑，其中ABLC為由二聚糖基磷脂酰膽堿和二聚糖基磷脂酰甘油混合物構(gòu)成的帶狀結(jié)構(gòu)，其粒徑在1600～11 000nm之間。而 L～AmB由氫化大豆磷脂酰膽堿、膽固醇、二硬脂?；字８视秃虯mB組成的球形單層脂質(zhì)體，其平均直徑＜100nm。二者雖然在脂質(zhì)組成、形狀、大小等方面有所不同，但抗真菌活性成份AmB均被脂質(zhì)體完全包裹，以此減少其在人體內(nèi)的不良反應(yīng)[17]。因此，提示將AmB完全包裹的方式可能導(dǎo)致體外AmB釋放速率不足，進(jìn)而導(dǎo)致體外抗真菌活性減弱。目前，尚未見明確L～AmB制劑是否與ABLC制劑同樣依賴于磷脂酶釋放的報(bào)道，未來仍有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究中國產(chǎn)注射用L～AmB制劑與進(jìn)口注射用L～AmB制劑的體外活性較為一致。此外，國產(chǎn)注射用L～AmB制劑體外藥物敏感性較好，具有良好的抗真菌活性。但由于體外未知因素可能會(huì)影響其內(nèi)部AmB藥物的釋放，導(dǎo)致體外實(shí)驗(yàn)不能準(zhǔn)確地反映其對不同真菌菌種的藥物活性情況，未來還需開展動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床對照試驗(yàn)等研究，以進(jìn)一步評估國產(chǎn)注射用L～AmB制劑的臨床治療價(jià)值。