陳 浩，鞠永政，王文文，尹明榮，李 陽，王一新

（1.山東農(nóng)業(yè)工程學(xué)院農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，山東濟南 250100；2.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，山東泰安 271018；3.中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032）

豬流行性腹瀉病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）是一種有囊膜的冠狀病毒，其基因組為單股正鏈RNA。PEDV 可引起豬的水樣腹瀉、急性嘔吐和脫水。盡管各年齡段豬均可被感染，但仔豬尤其易感，其感染后的發(fā)病率及病死率可達100%。PEDV 逐漸呈全世界流行[1]，2010 年，G1b亞型PEDV 變異株在我國大面積流行，給我國養(yǎng)殖業(yè)造成嚴重經(jīng)濟損失[2-5]。豬傳染性胃腸炎病毒（transmissible gastroenteritis virus，TGEV）、豬δ 冠狀病毒（porcine deltacoronavirus，PDCoV）及豬輪狀病毒（porcine rotavirus，PoRV）等胃腸道病毒均能引起與PEDV 感染相似的臨床癥狀，因此開發(fā)一種可以快速準確檢測PEDV 的方法至關(guān)重要。

目前，多種實驗室診斷技術(shù)已應(yīng)用于PEDV檢測，如病毒分離鑒定、酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）、膠體金檢測試紙條、PCR 技術(shù)、核酸等溫擴增技術(shù)等[6-8]。其中，實時熒光定量PCR 技術(shù)因其靈敏度高、操作簡便且可以實現(xiàn)病毒核酸定量，已被廣泛應(yīng)用于動物病原檢測[9]。本研究以PEDVN基因保守序列為靶位點，設(shè)計1 對特異性引物，建立了PEDV SYBR Green I 熒光定量RT-PCR 檢測方法，并利用該方法對2018—2019年從山東省4 個地區(qū)采集的161 份臨床樣品進行了檢測，以期為PEDV 感染的快速鑒別診斷及防控提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 毒株

PEDV、TGEV、PDCoV、PoRV、豬瘟病毒（classical swine fever virus，CSFV）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV），均由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動物檢疫研究室分離并保存。

1.2 主要試劑與儀器

PrimeScript? One Step RT-PCR Kit、One Step TB Green PrimeScript RT-PCR 熒光定量試劑盒，購自寶生物工程（大連）有限公司；病毒RNA 提取試劑盒、凝膠純化試劑盒、質(zhì)粒小量提取試劑盒，購自北京諾貝萊生物科技有限公司；高保真DNA聚合酶、pEASY-T3 載體試劑盒、T7 體外轉(zhuǎn)錄試劑盒、DNA Marker，購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；DH5α 感受態(tài)細胞，購自天根生化科技（北京）有限公司；熒光定量PCR 儀Light Cycler 96，Roche 公司產(chǎn)品。

1.3 引物設(shè)計與合成

使用MegAlign 軟件對PEDVN基因保守序列進行分析，運用Primer 5.0 軟件設(shè)計2 對特異性引物（表1）。其中，P1/P2 用于PEDVN基因部分序列擴增并構(gòu)建標準質(zhì)粒，F(xiàn)/R 用于熒光定量PCR擴增。引物送至生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 引物序列

1.4 標準質(zhì)粒構(gòu)建

提取病毒RNA，以引物對P1/P2 進行RT-PCR擴增，回收純化擴增產(chǎn)物，將pEASY-T3 載體與擴增片段連接，轉(zhuǎn)化DH5α 感受態(tài)細胞。通過菌液PCR 篩選陽性克隆，并將陽性克隆子送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。擴大培養(yǎng)測序正確的克隆子，提取質(zhì)粒，作為PEDVN基因標準質(zhì)粒。

1.5 標準品制備

使用EcoR I 限制性內(nèi)切酶處理PEDVN基因標準質(zhì)粒，使其線性化。按照T7 啟動子體外轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書配置反應(yīng)體系，反應(yīng)體系于37 ℃孵育1 h，加入1 μL DNase，振蕩混勻后，37 ℃孵育15 min。將體外轉(zhuǎn)錄得到的RNA 通過乙醇沉淀純化，并使用分光光度計定量，作為標準品。

1.6 反應(yīng)體系優(yōu)化

參考一步法SYBR Green I 熒光定量RT-PCR試劑盒說明書，以RNA 標準品為模板配制反應(yīng)體系（20.0 μL）：RT-PCR Buffer 10.0 μL，RT enzyme Mix II 0.4 μL，ExTaq聚合酶0.4 μL，F(xiàn)/R各0.4 μL，RNA 模板2.0 μL，DEPC 水6.4 μL。將配好的反應(yīng)體系置于熒光定量PCR儀中進行擴增。使用棋盤法對10、25、50 nmol/mL 3 個引物濃度進行優(yōu)化，以確定最佳反應(yīng)體系。

1.7 標準曲線繪制

將RNA 標準品進行10 倍倍比稀釋，使其終拷貝濃度依次為106～ 101copies/μL。以倍比稀釋的RNA 標準品為模板進行SYBR Green I 熒光定量RT-PCR 擴增，每個稀釋度做3 次重復(fù)，以獲得的數(shù)據(jù)繪制標準曲線。

1.8 靈敏度、特異性和重復(fù)性檢測

以倍比稀釋的RNA 標準品為模板，同時用本研究建立的SYBR Green I 熒光定量RT-PCR 方法和常規(guī)RT-PCR 方法進行擴增，評價方法的靈敏度；提取TGEV、PDCoV、PoRV、CSFV、PRRSV 等病毒RNA，以建立的SYBR Green I 熒光定量RT-PCR 方法進行檢測，評價方法的特異性；取3 份PEDV 陽性臨床樣品進行SYBR Green I 熒光定量RT-PCR 擴增，評價該方法的批內(nèi)和批間重復(fù)性。批內(nèi)重復(fù)：將上述RNA 樣品分別設(shè)立3 次重復(fù)，在同一反應(yīng)條件下同時檢測，計算批內(nèi)變異系數(shù)（標準偏差/重復(fù)值平均數(shù)）；批間重復(fù)：將上述RNA 樣品分別進行3 次獨立的熒光定量RT-PCR 檢測，計算批間變異系數(shù)。

1.9 臨床樣品檢測

2018—2019 年，采集山東泰安、濱州、濰坊和臨沂4 個地區(qū)出現(xiàn)腹瀉癥狀病豬的161 份臨床樣品，其中64 份為腸道組織，97 份為糞便樣品。使用病毒RNA 提取試劑盒抽提腸道組織和糞便樣品RNA，運用本試驗建立的SYBR Green I 熒光定量RT-PCR 方法和RT-PCR 方法進行平行檢測。

2 結(jié)果

2.1 標準品制備

提取PEDV RNA，通過常規(guī)RT-PCR 擴增病毒N基因部分序列（圖1）?；厥漳康臈l帶，連接至pEASY-T3 載體，構(gòu)建標準質(zhì)粒pEASY-N。通過EcoR I 酶切質(zhì)粒使其線性化，使用T7 體外轉(zhuǎn)錄試劑盒制備RNA 標準品。經(jīng)分光光度計測定，所制備的RNA 標準品質(zhì)量濃度為235 ng/μL，置于-70 ℃?zhèn)溆谩?/p>

2.2 反應(yīng)體系優(yōu)化

通過棋盤法對引物濃度進行優(yōu)化，確定最佳引物濃度為10 nmol/mL。最終確定的反應(yīng)體系：One Step TB Green RT-PCR Buffer 10.0 μL，RT enzyme Mix II 0.4 μL，ExTaq聚合酶 0.4 μL，F(xiàn)/R（10 nmol/mL）各0.4 μL，病毒RNA 2.0 μL，DEPC 水6.4 μL，總體系為20.0 μL。擴增條件為：42 ℃ 5 min，95 ℃ 10 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，40個循環(huán)。

2.3 標準曲線建立

以倍比稀釋的RNA 標準品為模板進行SYBR Green I 熒光定量RT-PCR 擴增。擴增曲線（圖2-A）和標準曲線（圖2-B）顯示，當RNA 標準品拷貝濃度在106～101copies/μL 時，拷貝數(shù)對數(shù)值（x軸）與Ct 值（y軸）線性方程為y=-3.112 4x+30.68，R2=0.998，表明該方法具有較好的線性關(guān)系。

2.4 靈敏度試驗

以梯度稀釋的RNA 標準品為模板，同時進行SYBR Green I 熒光定量RT-PCR 和常規(guī)RT-PCR 擴增。結(jié)果顯示，本研究所建立的方法最低檢測限為10 copies/μL，而常規(guī)RT-PCR 為103copies/μL，表明SYBR Green I 熒光定量RT-PCR 方法的靈敏度是常規(guī)RT-PCR 的100 倍。

2.5 特異性試驗

分別以PEDV、TGEV、PDCoV、PoRV、CSFV 和PRRSV 為模板，用本試驗建立的SYBR Green I 熒光定量RT-PCR 方法進行檢測。結(jié)果（圖3）顯示，該方法僅對PEDV 有特異性擴增，而對上述常見胃腸道病毒均無擴增，表明該方法具有較強的特異性。

2.6 重復(fù)性試驗

提取3 份臨床PEDV 陽性樣品RNA，用本試驗建立的SYBR Green I 熒光定量RT-PCR 方法進行批內(nèi)、批間重復(fù)性測試。結(jié)果（表2）顯示，該方法的批內(nèi)變異系數(shù)為0.24%～0.51%，批間變異系數(shù)為1.05%～1.52%，表明該方法重復(fù)性較好。

2.7 臨床樣品檢測

同時用本研究建立的SYBR Green I 熒光定量RT-PCR 方法和RT-PCR 方法對采集的161 份臨床樣品進行檢測。結(jié)果顯示，兩種方法的檢測結(jié)果完全一致，符合率為100%，說明本研究建立的方法可信度高，可用于臨床樣品中PEDV 檢測。

3 討論

豬流行性腹瀉（PED）是由PEDV 引起的，以急性水樣腹瀉、嘔吐及脫水為主要特征的常見豬胃腸道傳染病。該病對仔豬威脅較大，可導(dǎo)致新生仔豬接近100%的死亡率。2010 年之前，PED 在我國以散發(fā)為主，2010 年之后，在我國多個省份暴發(fā)，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大經(jīng)濟損失。因此，及時對發(fā)病豬進行準確的早期診斷，對于PED 的防控和治療尤為重要。分子生物學(xué)方法具有操作簡便、反應(yīng)迅速、結(jié)果可靠等優(yōu)點，但是常規(guī)RT-PCR 靈敏度和特異性有限，LAMP 等溫擴增技術(shù)易出現(xiàn)氣溶膠污染，TaqMan 探針法熒光定量PCR 技術(shù)存在成本較高等問題，相較而言，SYBR Green I 染料法熒光定量PCR 技術(shù)不需要探針，兼具靈敏度和成本優(yōu)勢，更適合在基層推廣。

PEDV 基因組為不分節(jié)段的單股正鏈RNA，長約28 kb，編碼7 個主要蛋白（ORF1a、ORF1b、S、ORF3、E、M 和N）。其中，N基因編碼的病毒核衣殼蛋白在不同PEDV 毒株之間保守程度較高[10]。因此，本試驗針對N基因保守序列設(shè)計引物，建立了PEDV 檢測方法。為制備SYBR Green I 熒光定量RT-PCR 方法標準品，本試驗首先構(gòu)建了PEDVN基因重組質(zhì)粒，利用其攜帶的T7 啟動子，體外轉(zhuǎn)錄獲得RNA 模板，作為標準品。本試驗選擇定量的RNA 作為標準品而非質(zhì)?；騝DNA[11-12]，是因為這樣可以有效避免臨床樣品檢測時，不同待測樣品之間反轉(zhuǎn)錄效率的差異，從而使結(jié)果更加可靠、準確。靈敏性、特異性和重復(fù)性試驗結(jié)果表明：本研究所建立的SYBR Green I 熒光定量RT-PCR方法靈敏度高，最低檢測限為10 個RNA 核酸拷貝；特異性強，僅特異性擴增PEDV，對其他常見胃腸道病毒均無非特異擴增；重復(fù)性較好，批內(nèi)及批間Ct 值的變異系數(shù)均小于2%。利用該方法和國標推薦的RT-PCR方法對161份臨床樣本進行平行檢測，符合率為100%，說明本方法可信度高，可用于臨床樣品中PEDV 檢測。