焉 鑫，劉蒙達(dá)，張 力，李 巖，孫淑芳，樊曉旭

（1.中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032；2.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)畜牧獸醫(yī)工作總站，新疆烏魯木齊 830000）

近十幾年來(lái)，H7N9流感、寨卡病毒病、登革熱、“非典”等新發(fā)、突發(fā)傳染病暴發(fā)逐漸增多，與此同時(shí)結(jié)核病、布魯氏菌病等傳統(tǒng)重要的人獸共患病也有逐漸抬頭的趨勢(shì)。特別是2019 年底暴發(fā)的新冠肺炎疫情，目前已經(jīng)發(fā)展到全球大流行階段[1]。在全球一體化大背景下，快速識(shí)別感知病原微生物，對(duì)于動(dòng)物健康、公共衛(wèi)生安全、食品安全具有重要意義。

病原微生物檢測(cè)技術(shù)主要包括病原分離培養(yǎng)、免疫學(xué)檢測(cè)和核酸檢測(cè)。其中，核酸檢測(cè)技術(shù)具有敏感性高、限制因素少、易于操作等優(yōu)點(diǎn)，目前已得到廣泛使用。自20 世紀(jì)中葉聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）發(fā)明以來(lái)，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷革新，實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)（real-time fluorescent quantitative PCR，RT-qPCR）[2]、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）[3]、重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)（recombinase polymerase amplification，RPA）[4]和重組酶介導(dǎo)擴(kuò)增技術(shù)（recombinase-aided isothermal Amplification，RAA）[5]等基于微生物核酸特異性擴(kuò)增的檢測(cè)技術(shù)發(fā)展迅速。2015 年，Liu等[6]以PCR 和LAMP 檢測(cè)技術(shù)為基礎(chǔ)，建立了聚合酶螺旋反應(yīng)（polymerase spiral reaction，PSR）檢測(cè)方法。該方法不僅保留了傳統(tǒng)PCR 引物設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單的優(yōu)勢(shì)，還具有全部反應(yīng)只需一種酶，無(wú)需反復(fù)加樣，在恒溫條件下即可完成反應(yīng)，不易出現(xiàn)污染的特點(diǎn)，具有良好的特異性、敏感性和易操作性。本文擬從PSR 技術(shù)的原理以及在病原微生物快速檢測(cè)中的應(yīng)用方面作綜述。

1 原理

1.1 擴(kuò)增原理

F 段和R 段特異性引物序列結(jié)合靶基因上的Fc 和Rc 段，在BstDNA 聚合酶作用下向3'端延伸，形成DNA 雙鏈結(jié)構(gòu)。該雙鏈在甜菜堿的作用下，再次解鏈為游離的DNA 單鏈。此時(shí)單鏈上的Nc段與N 段是反向互補(bǔ)的，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，Nc 段會(huì)旋轉(zhuǎn)并與N 段結(jié)合形成勾型結(jié)構(gòu)，形成的3'端缺口會(huì)被BstDNA 聚合酶用堿基填補(bǔ)，繼續(xù)向3'端延伸。之后反復(fù)重復(fù)引物結(jié)合、延伸、解鏈、單鏈旋轉(zhuǎn)、延伸的循環(huán)，最終形成一系列相對(duì)分子質(zhì)量大小不一的復(fù)雜結(jié)構(gòu)，達(dá)到等溫條件下核酸擴(kuò)增的目的[6]。常規(guī)PSR 反應(yīng)最佳溫度一般為65 ℃，在只采用兩條主引物的前提下，大約在60 min 內(nèi)完成擴(kuò)增。若在體系內(nèi)引入加速引物IF 和IB，則在30 min 內(nèi)即可完成擴(kuò)增反應(yīng)。若引入逆轉(zhuǎn)錄酶建立RT-PSR 方法，也適用于RNA 的快速檢測(cè)[7]。

1.2 引物設(shè)計(jì)

基于BstDNA 聚合酶的核酸等溫?cái)U(kuò)增方法的引物設(shè)計(jì)思路：使擴(kuò)增引物包括兩段先后與靶序列結(jié)合且能在擴(kuò)增中折疊成環(huán)的序列，利用酶的置換活性與聚合酶活性，反復(fù)延伸、折疊、解離，最終使核酸得到擴(kuò)增。單一的上下游PCR 引物無(wú)法在BstDNA 聚合酶及其反應(yīng)體系下恒溫?cái)U(kuò)增核酸序列，而PSR 僅需要在PCR 引物的基礎(chǔ)上，從靶序列上取一段序列N，將這段序列添加到PCR 引物（F和R）的5'端，構(gòu)成兩條復(fù)合引物Ft 和Bt。引物組成及其在靶序列上的結(jié)合位點(diǎn)如圖1-A 所示。這兩條引物就是PSR 反應(yīng)的主引物。若要進(jìn)一步提高檢測(cè)速度及靈敏性，可以分別在F 與N 以及B 與N 之間，從5'端到3'端的方向分別與Ft、Bt相反設(shè)計(jì)加速引物IF 和IB。IF 和IB 在靶序列上的位置示意圖如圖1-B 所示。由于都是基于酶的鏈置換活性原理，PSR 引物設(shè)計(jì)可參考LAMP 引物設(shè)計(jì)規(guī)則。具體的設(shè)計(jì)參數(shù)如表1 所示，按表1 中的參數(shù)進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，將提高PSR 擴(kuò)增反應(yīng)的成功率。

表1 PSR 引物最佳設(shè)計(jì)參數(shù)[8]

1.3 擴(kuò)增產(chǎn)物判讀方式

PSR 擴(kuò)增產(chǎn)物的判讀方式有以下3 種：一是采用實(shí)時(shí)濁度儀進(jìn)行濁度的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。該方法可精確得到Ct 值的出峰時(shí)間。二是通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行結(jié)果判定。三是采用指示劑顯色法，即將顏色指示劑加入到PSR 反應(yīng)體系中，通過(guò)陰陽(yáng)性反應(yīng)的顏色差異，肉眼快速判斷試驗(yàn)結(jié)果。目前常用的顏色指示劑有SYBR Green I 指示劑[6-7]、鈣黃綠素（Calcein）指示劑、羥基萘酚藍(lán)指示劑和pH 顏色指示劑[8-9]。實(shí)時(shí)濁度儀判斷法和瓊脂糖凝膠電泳判定法均需要專(zhuān)業(yè)的儀器及相對(duì)復(fù)雜的操作，用于實(shí)驗(yàn)室研究尚可，不適用現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)；而指示劑顯色法結(jié)果判讀簡(jiǎn)單，不需要復(fù)雜的儀器及操作，適合現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。

2 應(yīng)用

2.1 病毒檢測(cè)

2.1.1 人獸共患病病毒 Sun 等[10]開(kāi)發(fā)了5'UTR-PSR 方法檢測(cè)丙型肝炎病毒（HCV）。該方法有良好的特異性和敏感性，可識(shí)別所有基因型的HCV，而不與其他病毒發(fā)生非特異性反應(yīng)，檢出限可達(dá)25 copies/mL，與RT-qPCR 相當(dāng)，比RTLAMP 高2 倍，且縮短了檢測(cè)時(shí)間。Sharma 等[7]將簡(jiǎn)化的磁珠RNA 提取法與RT-PSR 相結(jié)合，開(kāi)發(fā)了基孔肯雅病毒（CHIKV）的早期篩查方法。該方法的檢測(cè)限為10 個(gè)RNA 拷貝，與RT-qPCR相當(dāng)，并且檢測(cè)特異性良好。Tomar 等[11]建立了西尼羅病毒（WNV）的RT-PSR 檢測(cè)方法，其靈敏性為1 個(gè)RNA 拷貝，比普通RT-PCR 靈敏性提升100 倍，與黃病毒、甲病毒和麻疹病毒無(wú)交叉反應(yīng)；對(duì)107 份臨床樣本檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，RT-PSR 與RTqPCR 一致性為100%。He 等[12]針對(duì)柯薩基病毒A16（CVA-16）VP1編碼區(qū)保守序列設(shè)計(jì)特異性引物，建立了CVA-16VP1RT-PSR 檢測(cè)方法，其模板RNA可在恒溫條件下40 min內(nèi)完成逆轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增，檢出限為2.4×（101～102）copies/mL，且具有良好的特異性。

2.1.2 動(dòng)物疫病病毒 Wo?niakowski 等[13]基于黑寡婦α-latrotoxin（位置：180～199）（GenBank登錄號(hào)：KF751511.1）、格魯吉亞ASFV 2007/1核衣殼蛋白p72（位置：104 980～104 999 和105 116～105 135）和交聯(lián)引物AB 建立了聚合酶交聯(lián)螺旋反應(yīng)（PCLSR）檢測(cè)方法。該方法在65 ℃45 min 內(nèi)即可完成擴(kuò)增，檢測(cè)P72基因片段的靈敏性為7.2×102copies/μL，且與豬瘟病毒（CSFV）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）和豬流行性腹瀉病毒（PEDV）均無(wú)交叉反應(yīng)，為現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)非洲豬瘟病毒（ASFV）提供了方法和支撐。Ji 等[14]建立了豬圓環(huán)病毒3 型（PCV3）ORF2-PSR 檢測(cè)方法。該方法的最優(yōu)反應(yīng)溫度和時(shí)間是62 ℃ 50 min，檢測(cè)靈敏度與LAMP 相當(dāng)，達(dá)1.13×102copies/μL，且與豬偽狂犬病病毒（PRV）、PRRSV、豬圓環(huán)病毒2 型（PCV2）、CSFV 和PEDV 均無(wú)交叉反應(yīng)；從臨床樣本的檢測(cè)結(jié)果看，ORF2-PSR 與LAMP檢測(cè)方法的符合率接近100%。Wang 等[15]建立的ORF3-PSR 方法能夠在62 ℃ 50 min 檢測(cè)到PEDV核酸的擴(kuò)增，且靈敏性比普通RT-PCR 高10 倍。Gupta 等[16]建立了犬細(xì)小病毒2 型（CPV2）VP2-PSR 檢測(cè)方法，最優(yōu)反應(yīng)溫度和時(shí)間是64 ℃75 min，最低檢出限是5×10-6ng DNA，靈敏度比普通PCR 高10 倍，與RT-qPCR 和LAMP 等方法相當(dāng)。此外，針對(duì)牛皰疹病毒I 型（BHV1）設(shè)計(jì)特異性引物建立的PSR 方法，經(jīng)證實(shí)也具有良好的特異性和敏感性[17]。

2.2 細(xì)菌檢測(cè)

2.2.1 人獸共患病病原菌 在建立的多種人獸共患病病原菌及食源性病原菌PSR 檢測(cè)方法中，針對(duì)流產(chǎn)型布魯氏菌，Ashmi 等[18]建立了BruAb2_0168-PSR 方法。該方法特異性好，65 ℃水浴60 min 可最低檢測(cè)到1.33 fg DNA，靈敏度比普通PCR 高10 000 倍，與RT-qPCR 相當(dāng)。此外，針對(duì)布魯氏菌疫苗株S19，IS711-PSR 檢測(cè)方法在保證特異性的前提下，靈敏度較普通PCR 提高了100 倍[19]。Liu 等[20]建立了結(jié)核分枝桿菌PSR 檢測(cè)方法，并據(jù)此開(kāi)發(fā)了新型現(xiàn)場(chǎng)核酸快速檢測(cè)試劑盒。該試劑盒穩(wěn)定性好、特異性強(qiáng)，DNA 最低檢出限是0.92 pg/μL，從臨床樣品檢測(cè)結(jié)果看，與RT-qPCR 的符合率為91.6%。

2.2.2 食源性病原微生物 近年來(lái)，食源性病原微生物感染越來(lái)越受到重視。Xu 等[21]收集了涉及豬肉、牛肉、羊肉、魚(yú)肉、雞肉以及蔬菜等的532份食品樣本，針對(duì)食品沙門(mén)氏菌污染問(wèn)題建立了invAPSR 檢測(cè)方法。該方法最低檢出限是50 CFU/mL，靈敏度與LAMP 和RT-qPCR 一致。He 等[22]建立了檢測(cè)副溶血弧菌的tlh-PSR 方法。該方法的核酸最低檢出限是300 fg/μL，純培養(yǎng)最低檢出限是2.4 CFU/mL，在65 ℃ 40 min 內(nèi)即可完成反應(yīng)，靈敏度較普通PCR 提高了100 倍。此外，肺炎克雷伯桿菌和銅綠假單胞菌等院內(nèi)感染細(xì)菌同樣可以應(yīng)用PSR 方法進(jìn)行檢測(cè)[23]。

2.3 其他病原

除了應(yīng)用于病毒和細(xì)菌檢測(cè)，PSR 也應(yīng)用于真菌及衣原體診斷檢測(cè)領(lǐng)域。白色念珠菌是最重要的人類(lèi)機(jī)會(huì)性致病菌，當(dāng)機(jī)體免疫功能下降或菌群失調(diào)時(shí)，白色念珠菌會(huì)大量繁殖，引起黏膜皮膚念珠菌病或侵襲性念珠菌病等疾病。Jiang 等[24]建立了白色念珠菌ITS2-PSR 檢測(cè)方法。該方法的核酸最低檢出限是6.9 pg/μL，靈敏度比普通PCR 高10倍?；耗乙略w能夠引起雞群的滑液囊衣原體病，導(dǎo)致感染雞群出現(xiàn)關(guān)節(jié)腫脹、跛足，蛋雞出現(xiàn)蛋殼異型、產(chǎn)蛋量下降等癥狀。Wu 等[25]建立的vlh-PSR 方法在62 ℃和40 min 內(nèi)可檢測(cè)到滑液囊衣原體核酸的擴(kuò)增，特異性良好，且靈敏度較普通PCR 提高了100 倍。

3 總結(jié)和展望

在全球一體化，同一個(gè)世界，同一個(gè)健康的大背景下，新冠肺炎、埃博拉、結(jié)核病、布魯氏菌病等新發(fā)病和人獸共患病防控越來(lái)越受到國(guó)際社會(huì)和世界各國(guó)的重視。盡早發(fā)現(xiàn)感染個(gè)體，是在源頭控制疫病傳播流行的關(guān)鍵，也是降低疫情防控成本的最適手段。因此，針對(duì)病原微生物非常有必要開(kāi)發(fā)新型的快速便攜式檢測(cè)方法。PSR 是一種基于LAMP 和PCR 發(fā)展起來(lái)的新型病原微生物核酸檢測(cè)技術(shù)，其一方面解決了LAMP 引物設(shè)計(jì)復(fù)雜的問(wèn)題，另一方面較PCR 檢測(cè)靈敏度高。特別是，相比于PCR、RT-qPCR，PSR 在保留高度特異性、敏感性的基礎(chǔ)上，不需要精密復(fù)雜的變溫儀器，并且加入顯色染料后，可以用肉眼直觀判定結(jié)果，這符合世界衛(wèi)生組織（WHO）對(duì)疾病快速診斷的要求，對(duì)提升基層傳染病快速檢查、篩查能力有重要的應(yīng)用價(jià)值。另外，PSR 的反應(yīng)溫度為65 ℃，避免了RPA/RAA 技術(shù)在常溫下擴(kuò)增可能造成的核酸污染假陽(yáng)性問(wèn)題。PSR 自2015 年建立以來(lái)發(fā)展迅猛，但還有很多重要病原體，例如新冠病毒、幽門(mén)螺旋桿菌、弓形蟲(chóng)等的PSR 方法未見(jiàn)報(bào)道。隨著PSR技術(shù)的不斷發(fā)展和完善，該技術(shù)以及衍生技術(shù)將在病原微生物檢測(cè)方面具有更廣闊的應(yīng)用前景。