邢安琪，于曉慧，彭真奇，3，克軍宏，4，李 陽，蔣文明，許立華，王靜靜，劉華雷

（1.寧夏大學，寧夏銀川 750021；2.中國動物衛(wèi)生與流行病學中心，山東青島 266032；3.安徽農(nóng)業(yè)大學，安徽合肥 230036；4.塔里木大學，新疆阿拉爾 843300）

腺病毒（adenoviruses）屬于腺病毒科（Adenovirus），為無囊膜雙股線性DNA 病毒[1-2]，呈球形，外殼蛋白主要由六鄰體蛋白（hexon）、五鄰體蛋白（penton）和纖維蛋白（fiber）構(gòu)成，其中hexon 蛋白含主要抗原決定簇，參與免疫反應，能誘導產(chǎn)生中和抗體，并且與病毒致病性密切相關[3-4]。國際病毒分類委員會（International Committee on Taxonomy of Viruses，ICTV）將腺病毒科分為5 個屬，分別為哺乳動物腺病毒屬（Mastadenovirus）、禽腺病毒屬（Aviadenovirus）、胸腺病毒屬（Atadenovirus）、唾液腺病毒屬（Siadenovirus）和魚腺病毒屬（Ichtadenovirus）。腺病毒可以感染40 多種脊椎動物[1-2，5-6]，其中禽類是其常見宿主[4，7-10]。

禽腺病毒是鴿群中的一種常見病原體[11]。1984 年，Cousement 等[4]在比利時首次報道了鴿腺病毒（pigeon adenovirus，PiAdV）感染，隨后該病毒在世界范圍廣泛傳播。1995 年，De Herdt等[12]描述了I 型和II 型PiAdV 感染在特定鴿子中的相關致病過程。I 型或II 型的分類不是以抗原性差異為依據(jù)，而是以感染后引起的臨床癥狀作為分類標準[13]。I 型PiAdV（PiAdV-I，為經(jīng)典腺病毒）感染的臨床癥狀與幼鴿疾病綜合征（young pigeon disease syndrome，YPDS）類似，主要影響1 歲以下的鴿，表現(xiàn)為腹瀉、吐食、消化緩慢和體重下降等；II 型PiAdV（PiAdV-II）可感染所有年齡段的鴿，引起的死亡率更高，臨床特征更典型，導致廣泛性的肝壞死或突然死亡[12，14]。目前還沒有針對PiAdV 的疫苗，因此PiAdV 感染給我國賽鴿及肉鴿養(yǎng)殖業(yè)帶來了嚴峻挑戰(zhàn)及經(jīng)濟損失。當前，關于我國PiAdV 感染的流行病學研究較少，其在我國的分布尚不清楚。因此，開展PiAdV 的分布和流行規(guī)律研究，對我國PiAdV 感染的精準防控具有重要意義。本研究于2021—2022 年，在我國8 個?。ㄗ灾螀^(qū)）41 個活禽交易市場，采集鴿口咽/泄殖腔雙拭子樣品，通過常規(guī)PCR 方法檢測PiAdV核酸，并對陽性樣品進行遺傳進化分析，以期為科學防控PiAdV 感染提供流行病學數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

從江蘇、河南、安徽、江西、福建、廣東、廣西、云南等8個省（自治區(qū)）的41個活禽交易市場，隨機采集鴿的口咽/泄殖腔雙拭子樣品，共計462份。

1.2 核酸提取

采用FinaQuick 快速病毒DNA 柱式提取試劑盒（GENFINE），按照說明書進行病毒DNA 提取，將提取的DNA 立即用于PCR 擴增或者于-20 ℃保存。

1.3 PCR 擴增

根據(jù)相關研究[15]，針對PiAdV 的hexon 蛋白編碼基因保守區(qū)域設計引物，PCR 產(chǎn)物預期長度為616 bp，引物由青島睿博興科生物技術(shù)有限公司合成。用提取的DNA 作為模板，進行PCR 檢測。反應條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸 1 min，35 個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。擴增后，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳。

1.4 PCR 擴增產(chǎn)物序列測定

PCR 擴增產(chǎn)物按照北京全式金快速膠回收試劑盒說明書進行純化回收，純化后的DNA 產(chǎn)物送至青島睿博興科生物技術(shù)有限公司進行序列測定。

1.5 遺傳進化分析

利用MEGA 6 軟件，針對腺病毒hexon 蛋白編碼基因序列，采用鄰位相連法（neighbor-joining）構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，分析病毒的遺傳進化特點。

2 結(jié)果

2.1 病原檢測

2.1.1 總體情況 病原檢測結(jié)果（表1～2）顯示：2021—2022 年在河南、安徽、江西、福建、廣東、廣西、云南等7 個?。ㄗ灾螀^(qū)）24 個活禽交易市場檢出120 份PiAdV 病原陽性樣品，個體陽性率為25.97%（95%CI：21.98%～29.97%），場點陽性率為58.54%（95%CI：43.46%～73.62%）。

表1 8 個?。ㄗ灾螀^(qū)）活禽交易市場PiAdV 檢測結(jié)果

2.1.2 地區(qū)情況 陽性場點分布范圍較廣，除江蘇省外，其他采樣省份均有陽性檢出，不同省份的PiAdV 陽性率有一定差異。其中：江西（40.00%）、廣西（39.08%）個體陽性率較高，而云南（5.56%）、安徽較低（3.13%）。

2.1.3 場點類型情況 24 個PiAdV 陽性采樣點包括17 個零售市場和7 個活禽批發(fā)市場。場點統(tǒng)計結(jié)果（表2）顯示，活禽批發(fā)市場的場點陽性率高于零售市場，分別為87.50%和51.52%。

表2 不同采樣點PiAdV 陽性率分布

2.2 遺傳進化分析

隨機挑選來自不同省份的15 份PiAdV 病原陽性樣品進行基因測序，測序結(jié)果經(jīng)BLAST 比對發(fā)現(xiàn)，均符合PiAdV 序列。選取GenBank 公布的21株（表3）具有代表性的腺病毒hexon 蛋白編碼基因序列與本研究測定的hexon 蛋白編碼基因構(gòu)建遺傳進化樹。結(jié)果顯示：本研究的15 份PiAdV 陽性樣品均屬于PiAdV-B 分支（圖1），與2018 年國內(nèi)檢測到的PAV/FJ2017 株[14]親緣關系最近，同屬于PiAdV-B 中的varient B 小分支，核苷酸同源性為99.1%～100%，與PiAdV-B 同分支中varient A小分支的YPDS-Y-V1.A19.11 和M144 毒株的核苷酸同源性為83.3%～84.0%，而與同物種的PiAdV-A分支親緣關系較遠，與該種IDA4 分離株的核苷酸同源性只有65.0%～66.0%。

3 討論

近年來，我國養(yǎng)鴿業(yè)發(fā)展迅猛，鴿飼養(yǎng)數(shù)量逐步增加，養(yǎng)鴿業(yè)已經(jīng)成為我國繼雞、鴨、鵝之后的第四大家禽產(chǎn)業(yè)。但是當前對于鴿相關疾病的系統(tǒng)流行病學研究較少，對疫病的種類、分布、危害

等尚不清楚。PiAdV 是鴿群中常見的病原體，其中鴿典型PiAdV 感染臨床上主要表現(xiàn)為嗉囊積食、腹瀉、吐食和體重下降等癥狀[16]，當其與其他病原發(fā)生混合感染或者機體抵抗力較低時，會導致鴿死亡率明顯升高，嚴重影響著養(yǎng)鴿業(yè)健康發(fā)展。為了解PiAdV 在我國的流行現(xiàn)狀，本研究對2021—2022 年在江蘇、河南、安徽、江西、福建、廣東、廣西、云南等8 個?。ㄗ灾螀^(qū)）41 個活禽交易市場采集的鴿拭子樣品進行病原檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)個體陽性率為25.97%，其中江西省的個體陽性率高達40.00%。史磊波[17]對西安市周邊地區(qū)采集的396份鴿泄殖腔拭子樣品進行PiAdV 核酸檢測，發(fā)現(xiàn)樣品陽性率為14.6%；楊俊杰[18]對呼和浩特市周邊公棚采集的107 份賽鴿泄殖腔拭子進行PiAdV檢測，發(fā)現(xiàn)陽性率為32.7%；習碩等[19]對北京、河北、江西、山東、河南5 個地區(qū)552 份鴿血清樣品進行PiAdV 檢測，發(fā)現(xiàn)血清陽性率為62.3%。以上研究表明，PiAdV 在我國鴿群中流行廣泛。

根據(jù)ICTV 分類報告，同物種的PiAdV 分為PiAdV-A 和PiAdV-B 種。本研究所測定的PiAdV均處于PiAdV-B 分支，與2018 年國內(nèi)檢測到的PAV/FJ2017 株親緣關系最近，與同屬于PiAdV-B分支varient B 小分支病毒的核苷酸同源性為99.1%～100%，與PiAdV-B 同分支中varient A 小分支的YPDS-Y-V1.A19.11 和M144 分離株的核苷酸同源性為83.3%～84.0%，而與同物種的PiAdV-A種分支中的IDA4 分離株同源性較低。本研究同時使用史磊波[17]報道的針對PiAdV-A 種引物進行樣品核酸檢測，均未檢測到PiAdV-A 種病原學陽性，只檢測到PiAdV-B 種陽性，表明我國鴿群中主要流行PiAdV-B 種病毒。根據(jù)PiAdV 感染后引起的臨床癥狀差異的分類標準，本研究所采集的拭子樣品均來自活禽交易市場無明顯臨床癥狀的鴿，因此檢測到的PiAdV 均屬于PiAdV-I 型。

值得注意的是，本研究所檢測到的120 份PiAdV 病原學陽性來源于24 個采樣點，場點陽性率高達58.54%，包括17 個零售市場和7 個活禽批發(fā)市場，說明活禽批發(fā)市場和零售市場是PiAdV的高污染場點?；钋菔袌鲋星莘N類繁多，存在多種禽類混養(yǎng)、來源復雜、市場衛(wèi)生條件較差等現(xiàn)象，極易導致病毒傳播和混合感染。因此，應加強活禽市場的衛(wèi)生消毒管理，積極采取定期休市、嚴格清洗消毒等措施。同時，本研究只針對各地區(qū)活禽交易市場鴿群的感染情況進行了初步檢測與分析，研究結(jié)果存在一定的局限性，要獲得更為準確的流行病學數(shù)據(jù)仍需結(jié)合養(yǎng)殖環(huán)節(jié)鴿群的檢測結(jié)果進行深入研究探討。

由于市場上暫無針對PiAdV 的專用疫苗，因此對于該病的防控，要注重加強飼養(yǎng)管理，增強養(yǎng)殖業(yè)主的生物安全意識，改善養(yǎng)殖環(huán)境，提高鴿群抵抗力，利用有效手段降低病毒的感染、變異和傳播風險，盡快研發(fā)PiAdV 針對性疫苗，完善防控物質(zhì)儲備，提高防控能力。

4 結(jié)論

研究表明，我國市場交易鴿群中存在PiAdV流行，且部分市場污染面較廣，感染率較高，PiAdV-B 種為優(yōu)勢流行毒種。建議加強鴿場的飼養(yǎng)管理，提高鴿群抵抗力，同時加強活禽交易市場的衛(wèi)生管理，防止病毒擴散，加快開展PiAdV 疫苗研發(fā)，從而有效防控鴿腺病毒病流行。