寇美玲，謝佳芮，廖德芳，宋建領(lǐng)，苗海生

（云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，云南省熱帶亞熱帶動(dòng)物病毒病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昆明 650224）

口蹄疫（foot and mouth disease，F(xiàn)MD）是由口蹄疫病毒（foot and mouth disease virus，F(xiàn)MDV）引起的，主要感染豬、牛、羊和其他偶蹄類動(dòng)物的急性、熱性、高度接觸性傳染病[1-2]。該病分布廣，傳播速度快，傳播途徑多，流行周期長(zhǎng)，不易防控和根除，因而被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（WOAH）列為須通報(bào)動(dòng)物疫病，被我國列為一類動(dòng)物疫病[3-4]。FMD 曾在世界范圍內(nèi)多次暴發(fā)流行，在新流行地區(qū)，引起的牛發(fā)病率可達(dá)90%～100%，對(duì)成年牛的致死率為3%～5%，而對(duì)犢牛的致死率高達(dá)70%～80%[5]，也可導(dǎo)致感染動(dòng)物生產(chǎn)性能下降，種用價(jià)值喪失，給畜牧業(yè)帶來巨大經(jīng)濟(jì)損失[6]。近年來我國FMD 防控取得了較大進(jìn)展，但零星疫情依然存在[7]。FMDV 共7 個(gè)血清型，其中在亞洲主要流行O、A 和亞洲I 型[3]，在我國近年來主要是O、A 型。疫苗免疫是預(yù)防和控制 FMD的主要方式。我國目前對(duì) FMD 實(shí)行強(qiáng)制免疫策略，采取“先打后補(bǔ)”的補(bǔ)助方式。FMDV 抗體水平是評(píng)價(jià)疫苗免疫效果的主要方式。為掌握云南省邊境地區(qū)FMDV 的疫苗免疫效果和感染情況，2021年在邊境地區(qū)7個(gè)縣（市）采集牛血清樣品1 522份，采用cELISA 方法進(jìn)行FMDV O 型、A 型和非結(jié)構(gòu)蛋白抗體檢測(cè)，評(píng)價(jià)疫苗免疫效果及帶毒風(fēng)險(xiǎn)，從而為該病防控提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 血清樣品

2021 年采集云南省邊境地區(qū)景洪市、芒市、孟連縣、勐?？h、勐臘縣、滄源縣和盈江縣等7 個(gè)縣（市）的1 522 份牛血清樣品。每個(gè)縣（市）按采樣點(diǎn)所屬地理位置劃定區(qū)域，將區(qū)域內(nèi)養(yǎng)殖場(chǎng)、隔離場(chǎng)和散養(yǎng)戶編號(hào)，隨機(jī)抽取養(yǎng)殖場(chǎng)1～3 個(gè)、隔離場(chǎng)1 個(gè)、散養(yǎng)戶3～19 個(gè)，場(chǎng)群內(nèi)按牛耳標(biāo)號(hào)隨機(jī)采樣。樣品采集由7 個(gè)縣（市）動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心實(shí)施。具體采樣信息見表1。

表1 云南省邊境地區(qū)7 個(gè)縣（市）采樣信息統(tǒng)計(jì)

1.2 主要試劑

O、A 型FMDV 標(biāo)準(zhǔn)陰、陽性血清，O、A 型FMDV cELISA 抗體檢測(cè)試劑盒，參照Mackay 等[8]、Paiba 等[9]方法，由云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院國家口蹄疫專業(yè)實(shí)驗(yàn)室（昆明）制備[101]；試劑盒涉及的FMDV A、O 型滅活抗原，由中普生物有限公司（保山）提供；FMDV 非結(jié)構(gòu)蛋白單抗阻斷ELISA 試劑盒，購自深圳真瑞生物技術(shù)有限公司。

1.3 檢測(cè)方法

1.3.1 血清抗體檢測(cè) 利用O、A 型 FMDV cELISA 抗體檢測(cè)試劑盒，對(duì)樣品進(jìn)行血清學(xué)檢測(cè)，兩種血清型操作方法相同。取出試劑盒提供的ELISA 板，加入10 μL 待檢血清以及陽性、陰性對(duì)照血清至相應(yīng)檢測(cè)孔和對(duì)照孔，每孔加入50 μL 100倍稀釋的競(jìng)爭(zhēng)抗體，震蕩混勻，37 ℃溫育1 h；PBST 洗板3 次，吸水紙上拍干；每孔加入50 μL 1 000 倍稀釋的兔抗豚鼠HPR 酶標(biāo)二抗，37 ℃溫育40 min；洗板5～6 次拍干；加入TMB 顯色液100 μL/孔，37 ℃避光溫育10 min；加入終止液100 μL/孔，ELISA 讀板儀450 nm 波長(zhǎng)測(cè)定樣本和對(duì)照的吸光值A(chǔ)450。試劑盒質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)：陽性對(duì)照孔平均A450值≥0.8，陰性對(duì)照孔平均A450值≤0.3 時(shí)，試驗(yàn)結(jié)果成立；抑制率≥40%時(shí)判定為陽性，＜40%時(shí)判定為陰性。

1.3.2 非結(jié)構(gòu)蛋白抗體檢測(cè) 利用FMDV 非結(jié)構(gòu)蛋白單抗阻斷ELISA 試劑盒，按照試劑盒說明書操作。結(jié)果判定：阻斷率=（陰性對(duì)照A450平均值-樣品孔A450平均值）/陰性對(duì)照A450平均值×100%。當(dāng)陽性對(duì)照A450平均值≥55%，且陰性對(duì)照A450平均值-陽性對(duì)照A450平均值≥0.6 時(shí)，試驗(yàn)結(jié)果成立；被檢樣品阻斷率≥40%判定為陽性，25%～40%判定為可疑，＜25%判定為陰性。

1.4 數(shù)據(jù)分析

比較FMDV O 型、A 型及非結(jié)構(gòu)蛋白抗體陽性率，采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 地區(qū)分布

地區(qū)統(tǒng)計(jì)結(jié)果（表2）顯示：2021 年云南省7 個(gè)邊境縣（市）1 522 頭份牛血清樣品FMDV O 型抗體陽性率為40.10%～85.50%，A 型為58.50%～84.50%，非結(jié)構(gòu)蛋白抗體為25.76%～57.50%，O 型（57.61%）、A 型（67.29%）平均抗體陽性率均未達(dá)到國家最低要求（≥70%）。各縣（市）抗體陽性率有所差異，其中勐臘縣最高（O型85.50%、A 型84.50%、非結(jié)構(gòu)蛋白57.50%），不同地區(qū)間O 型、A 型及非結(jié)構(gòu)蛋白抗體陽性率均差異顯著（P＜0.05）。勐臘、盈江牛非結(jié)構(gòu)蛋白抗體陽性率分別達(dá)57.50%、54.62%，說明這些地區(qū)存在FMD 流行的可能性較大。

表2 云南省邊境不同地區(qū)牛FMDV 抗體檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)

2.2 群間分布

2.2.1 不同來源 不同來源牛統(tǒng)計(jì)結(jié)果（表3）顯示：1 522 份牛血清樣品中包含入境牛樣品340份、本地牛1 182 份；本地牛O、A 型抗體陽性率分別為54.31%、63.87%，非結(jié)構(gòu)蛋白抗體陽性率為40.52%，入境牛O、A 型抗體陽性率分別為70.29%、79.70%，非結(jié)構(gòu)蛋白抗體陽性率為58.23%。入境牛O 型、A 型、非結(jié)構(gòu)蛋白抗體陽性率均明顯高于本地牛（P＜0.05），說明入境牛免疫抗體水平較低，帶毒風(fēng)險(xiǎn)較大。

表3 不同來源牛FMDV 抗體檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)

2.2.2 不同飼養(yǎng)方式 不同飼養(yǎng)管理方式牛的FMDV 抗體檢測(cè)統(tǒng)計(jì)結(jié)果（表4）顯示：規(guī)模場(chǎng)牛O、A 型FMDV 抗體陽性率總體高于散養(yǎng)戶，非結(jié)構(gòu)蛋白抗體略低于散養(yǎng)戶，說明規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)疫苗免疫狀況好于散養(yǎng)戶，帶毒風(fēng)險(xiǎn)低于散養(yǎng)戶；而隔離場(chǎng)均為外來牛，3 項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)均明顯高于國內(nèi)規(guī)模場(chǎng)和散養(yǎng)戶（P＜0.05）。

表4 不同飼養(yǎng)管理方式牛的FMDV 抗體檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)

3 討論

云南省地處我國西南邊境，邊境線漫長(zhǎng)且犬牙交錯(cuò)，邊民往來頻繁，活牛走私入境活動(dòng)難以控制[11-12]。2020 年以來，受新冠肺炎疫情影響，邊境管控加強(qiáng)，入境牛數(shù)量雖大幅減少，但依然存在。東南亞地區(qū)是FMDV 疫源地。據(jù)WOAH 官方網(wǎng)站公布的信息統(tǒng)計(jì)，2020 年1 月—2021 年6 月東南亞地區(qū)共發(fā)生500 余起FMD 疫情，這對(duì)我國FMD 防控形成較大威脅。云南省邊境地區(qū)作為阻斷東南亞 FMD 疫情傳入我國的第一道屏障，疫苗免疫強(qiáng)度和效果尤為重要。本次調(diào)查對(duì)同1 份樣品分別進(jìn)行O、A 型FMDV 抗體檢測(cè)和非結(jié)構(gòu)蛋白抗體檢測(cè)，前者是為了評(píng)價(jià)免疫效果，后者是為了判斷感染情況，檢測(cè)結(jié)果具備一定的科學(xué)性和全面性。

血清樣品采集自云南省邊境地區(qū)7 個(gè)縣（市）。這些地區(qū)牛養(yǎng)殖相對(duì)集中，并且是外來牛入境重要通道，因此所采樣品具有一定代表性。O、A 型FMDV 抗體檢測(cè)結(jié)果顯示，云南省邊境地區(qū)抗體水平偏低，除勐臘縣外，其他縣（市）均未達(dá)到70%的國家最低免疫要求，亟需提升疫苗免疫強(qiáng)度。非結(jié)構(gòu)蛋白抗體檢測(cè)結(jié)果顯示，云南省邊境地區(qū)牛非結(jié)構(gòu)蛋白抗體陽性率整體偏高（25.76%～57.50%），說明邊境地區(qū)存在一定的FMDV 流行風(fēng)險(xiǎn)，但也可能與接種的疫苗未經(jīng)純化以及該檢測(cè)方法本身的缺陷有一定關(guān)系。勐臘和盈江縣的非結(jié)構(gòu)蛋白抗體陽性率分別達(dá)到57.5%和54.62%，經(jīng)查證這兩個(gè)地區(qū)的牛多數(shù)為走私入境牛。不同飼養(yǎng)方式牛的統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，隔離場(chǎng)中邊境緝私部門查獲的走私入境牛O、A 型抗體和非結(jié)構(gòu)蛋白抗體陽性率均高于本地牛?？紤]到緬甸、老撾等東南亞國家FMD 疫情現(xiàn)況和免疫情況，推斷這部分牛可能感染過或攜帶有FMDV。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，規(guī)模場(chǎng)疫苗免疫狀況好于散養(yǎng)戶，非結(jié)構(gòu)蛋白抗體陽性率低于散養(yǎng)戶，表明規(guī)模場(chǎng)抵御FMDV感染的能力要強(qiáng)于散養(yǎng)戶。

4 結(jié)論

云南省邊境地區(qū)牛FMD 免疫保護(hù)水平不高，且存在一定的病毒傳入風(fēng)險(xiǎn)，亟需進(jìn)一步提高疫苗免疫接種強(qiáng)度和免疫效果評(píng)估力度，持續(xù)對(duì)云南省邊境地區(qū)開展牛FMD 病原學(xué)和血清學(xué)監(jiān)測(cè)，掌握其流行病學(xué)特點(diǎn)和規(guī)律，以便及時(shí)發(fā)現(xiàn)和預(yù)警FMD 疫情，為邊境地區(qū)FMD 防控提供數(shù)據(jù)支撐。