商 軍，張浩然，田 愷，華賢輝，徐 汀

（上海市獸藥飼料檢測(cè)所，上海 201103）

飼料在運(yùn)輸、貯存過(guò)程中，不飽和油脂和其他對(duì)氧不穩(wěn)定的物質(zhì) （如維生素類）很容易受到破壞，而且這種破壞是一種不可逆的損害。飼料氧化損害會(huì)破壞脂溶性維生素和色素，明顯降低飼料蛋白和能量利用效率，增加飼料的毒性產(chǎn)物，也使動(dòng)物生產(chǎn)性能降低，甚至中毒死亡（李方方等，2020）。在飼料中添加少量或微量的抗氧化劑，可延長(zhǎng)飼料的保質(zhì)期，提高飼料的利用率，有效地避免上述不利因素，為此，抗氧化劑是飼料工業(yè)生產(chǎn)中不可缺少的一種添加劑（王杰等，2019；黃濤等，2004）?？寡趸瘎┛煞譃楹铣深惡吞烊活悾壳霸陲暳瞎I(yè)生產(chǎn)中使用的絕大多數(shù)為合成類抗氧化劑，作為合成類抗氧化劑允許在飼料中添加使用的有沒食子酸丙酯 （PG）、特丁基對(duì)苯二酚（TBHQ）、乙氧基喹啉（EQ）、丁基羥基茴香醚（BHA）和二丁基羥基甲苯（BHT），上述5種合成類抗氧化劑收載于 《飼料添加劑品種目錄》（農(nóng)業(yè)部第2045號(hào)公告）中。

由于合成類抗氧化劑過(guò)量使用會(huì)對(duì)人畜產(chǎn)生毒性，為此，在《飼料添加劑安全使用規(guī)范》（農(nóng)業(yè)部第2625號(hào)公告）中對(duì)上述5種合成類抗氧化劑在飼料中使用都有著明確的限量要求。其中，單獨(dú)使用時(shí)，在配合飼料或全混合日糧中的最高限量分別為PG 100 mg/kg，EQ 150 mg/kg（犬除外，犬為100 mg/kg），BHA、BHT和TBHQ為150 mg/kg；同時(shí)使用時(shí)，在配合飼料或全混合日糧中的總量不得超過(guò)150 mg/kg；單獨(dú)或同時(shí)在飼用油脂中使用時(shí)，總量不得超過(guò)200 mg/kg。目前，作為飼料中合成類抗氧化劑的測(cè)定標(biāo)準(zhǔn) （GB/T 17814-2011）中規(guī)定了4種合成類抗氧化劑檢測(cè)，未將特丁基對(duì)苯二酚（TBHQ）列入檢測(cè)項(xiàng)目。為此，參考目前國(guó)內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道 （胡玉霞，2019；李滿秀等，2015； 李興根等，2012； 蔡發(fā)等，2010；Perrin C，2003；Christian等，2002），提出了對(duì)該標(biāo)準(zhǔn)的修訂（國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)目計(jì)劃編號(hào)：20193212-T-469），本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定飼料中5種合成類抗氧化劑含量，以增強(qiáng)修訂后標(biāo)準(zhǔn)的適用性和普適性，為《飼料添加劑安全使用規(guī)范》中規(guī)定上述5種合成類抗氧化劑在飼料中規(guī)范合理使用提供檢測(cè)技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 高效液相色譜儀（Waters 2695-2998，配有紫外檢測(cè)器或二極管陣列檢測(cè)器，美國(guó)Waters公司）；色譜工作處理站（EmpowerⅡChem-station，美國(guó)Waters公司）；超聲波清洗器（KQ-250DB型，昆山市超聲波儀器有限公司）；乙腈（色譜純，默克公司）；乙酸（色譜純，默克公司）；PG標(biāo)準(zhǔn)品（CAS：121-79-9，含量≥98%，德國(guó)Dr.Ehrenstorfer GmbH公 司 ）；TBHQ標(biāo) 準(zhǔn) 品（CAS：1948-33-0，含量≥98%，德國(guó)Dr.Ehrenstorfer GmbH公司）；EQ標(biāo)準(zhǔn)品 （CAS：91-53-2，含量≥95%，德國(guó)Dr.Ehrenstorfer GmbH公司）；BHA標(biāo)準(zhǔn)品（CAS：25013-16-5，含量≥98%，德國(guó)Dr.Ehrenstorfer GmbH公司）；BHT標(biāo)準(zhǔn)品（CAS：128-37-0，含量≥98%，德國(guó)Dr.Ehrenstorfer GmbH公司）；一次性注射器（1、10 mL，山東朱氏藥業(yè)集團(tuán)有限公司）；有機(jī)相針式濾器（直徑25 mm，孔徑0.45 μm，美國(guó)PALL公司）；有機(jī)相微孔濾膜（孔徑0.22 μm，美國(guó)PALL公司）；水（符合GB/T 6682一級(jí)用水的規(guī)定）；樣品（市場(chǎng)抽檢及部分企業(yè)提供）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備 （1）混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：分別準(zhǔn)確稱取適量5種抗氧化劑標(biāo)準(zhǔn)品，用乙腈制備成含PG的質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL，含TBHQ、EQ、BHA和BHT的質(zhì)量濃度為1 mg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，置于棕色容量瓶中，2～8℃冰箱中保存?zhèn)溆?，有效期?周。（2）混合標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液：準(zhǔn)確移取上述混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液20 mL于200 mL棕色容量瓶中，用乙腈定容至刻度，搖勻；分別準(zhǔn)確移取適量上述溶液，然后用乙腈分別稀釋制備成使PG的質(zhì)量濃度為0.50、2.00、4.00、8.00、16.0、20.0 μg/mL和25.0 μg/mL，TBHQ、EQ、BHA、BHT的 質(zhì) 量 濃 度 為1.00、4.00、8.00、16.0、32.0、40.0 μg/mL和50.0 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液。臨用現(xiàn)配。

1.2.2 試樣溶液制備 （1）固體類試樣：準(zhǔn)確稱取已粉碎、全部通過(guò)0.42 mm孔徑分析篩、已混勻的試樣5 g，置150～250 mL的具塞三角瓶中，準(zhǔn)確加入50 mL的乙腈，搖勻，置超聲波清洗器中提取30～40 min，在提取過(guò)程中振搖2～3次。放冷至室溫，搖勻。用10 mL注射器吸取上述提取液適量，用有機(jī)相針式濾器（直徑25 mm，孔徑0.45 μm）過(guò)濾，濾液再經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾后備用。供液相色譜測(cè)定。（2）動(dòng)物油脂類試樣：準(zhǔn)確稱取5 g油脂，置150～250 mL的具塞三角瓶中（如為凝固狀，置65℃水浴中加熱7 min，使融化），準(zhǔn)確加入50 mL的乙腈，置超聲波清洗器中，在55℃的水浴中超聲提取約40 min。冷卻至室溫，取上層液10～20 mL，置離心管中，9000 r/min離心5 min，用10 mL注射器吸取上述離心液適量，用有機(jī)相針式濾器（直徑25 mm，孔徑0.45 μm）過(guò)濾，濾液再經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾后備用。供液相色譜測(cè)定。

1.2.3 液相色譜條件 色譜柱：十八烷基鍵合相（C18）柱（長(zhǎng)150 mm× 內(nèi)徑4.6 mm，粒徑5 μm）；進(jìn)樣體積：20 μL；波長(zhǎng)：200～400 nm；檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm；洗脫方式：等度洗脫；流動(dòng)相：乙腈-2%乙酸溶液（65+35，V1+V2）；流速：0.5 mL/min；柱溫：20～30℃。

1.2.3 試樣測(cè)定 分別取混合標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液和試樣溶液分別按“1.2.3”的液相色譜條件上機(jī)測(cè)定，以保留時(shí)間定性，試樣溶液中抗氧化劑的保留時(shí)間與混合標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液中抗氧化劑 （質(zhì)量濃度相當(dāng)）的保留時(shí)間應(yīng)一致，其相對(duì)偏差在±2.5%之內(nèi)。以5種抗氧化劑的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，色譜峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。試樣溶液中抗氧化劑的質(zhì)量濃度應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍內(nèi)。如超出標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍，應(yīng)將試樣溶液用乙腈稀釋后，重新測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的確定

2.1.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 取混合標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液進(jìn)行檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇，采用二極管陣列檢測(cè)器在波長(zhǎng)200～400 nm內(nèi)進(jìn)行紫外掃描，提取相應(yīng)紫外光譜圖，結(jié)果見圖1。結(jié)果表明，5種抗氧化劑在波長(zhǎng)在200～400 nm均有2處最大紫外吸收波長(zhǎng)，其中在220 nm波長(zhǎng)附近處均有最大吸收，其他最大吸收波長(zhǎng)處又各不相同。由于飼料試樣基質(zhì)較為復(fù)雜，選擇已接近紫外末端吸收的220 nm波長(zhǎng)附近處作為檢測(cè)波長(zhǎng)，會(huì)對(duì)5種抗氧化劑的測(cè)定產(chǎn)生較大的干擾。為使測(cè)定過(guò)程中5種抗氧化劑均能得到較好的響應(yīng)值 （峰面積），分別在230、250、280 nm和310 nm波長(zhǎng)處 分別提取相應(yīng)色譜圖，結(jié)果見圖2。結(jié)果表明，在230 nm波長(zhǎng)處提取的色譜圖，溶劑峰的響應(yīng)值較待測(cè)5種抗氧化劑峰的響應(yīng)值大；在250 nm波長(zhǎng)處，TBHQ峰和BHT峰的響應(yīng)值太?。辉?10 nm波長(zhǎng)處，BHT峰沒有響應(yīng)；在280 nm波長(zhǎng)處，5種抗氧化劑的峰面積均最為適宜。本文選擇280 nm作為5種抗氧化劑的檢測(cè)波長(zhǎng)。

圖1 5種抗氧化劑在波長(zhǎng)200～400 nm內(nèi)紫外掃描圖

圖2 5種抗氧化劑在不同波長(zhǎng)處的提取色譜圖

2.1.2 流動(dòng)相的選擇與優(yōu)化 本文采用等度洗脫方式，分別考察了不同流動(dòng)相組成（甲醇-甲酸、乙醇-乙酸和乙腈-乙酸）對(duì)飼料中5種抗氧化劑測(cè)定的影響，經(jīng)實(shí)驗(yàn)表明，采用乙腈-乙酸組成的流動(dòng)相，5種抗氧化劑在不同品牌的C18柱上均能得到滿意的色譜性能。為確保本方法的適用性，以5種抗氧化劑均應(yīng)符合色譜峰的保留時(shí)間 （t）3≤t≤30和色譜峰間的分離度（R）≥1.5作為優(yōu)化指標(biāo)。取混合標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液和添加5種抗氧化劑的試樣溶液分別對(duì)乙腈-乙酸流動(dòng)相組成的配比進(jìn)行了優(yōu)化選擇。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)流動(dòng)相中乙腈的比例為65%時(shí)，5種抗氧化劑的色譜峰均能完全分離（R≥1.5），最先洗脫出的PG色譜峰的保留時(shí)間約為3.9 min，最后洗脫出的BHT色譜峰的保留時(shí)間約為25.5 min，保留時(shí)間也均在3≤t≤30范圍內(nèi)。當(dāng)選擇乙酸溶液濃度為2%（V/V）時(shí)，5種抗氧化劑色譜峰保留時(shí)間的重復(fù)性和色譜峰形均良好。本文選擇了乙腈-2%乙酸溶液（65+35，V1+V2）組成的流動(dòng)相。優(yōu)化結(jié)果見圖3。

圖3 流動(dòng)相和流速優(yōu)化后5種抗氧化劑的典型色譜圖

2.1.3 流速的優(yōu)化 以優(yōu)化后的流動(dòng)相，分別設(shè)定流速為0.5、0.6、0.8 mL/min和1.0mL/min來(lái)考察對(duì)5種抗氧化劑的t和R的影響，為確保本方法的適用性，以5種抗氧化劑均應(yīng)符合色譜峰的保留時(shí)間（t）3≤t≤30和色譜峰間的分離度 （R）≥1.5作為優(yōu)化指標(biāo)。取混合標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液和添加5種抗氧化劑的試樣溶液分別對(duì)流速進(jìn)行了優(yōu)化選擇。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)流速為0.5 mL/min時(shí)，5種抗氧化劑的色譜峰均能完全分離（R≥1.5），保留時(shí)間均為3≤t≤30。本文選擇流速為0.5 mL/min。優(yōu)化結(jié)果見圖3。

2.2 預(yù)處理方法的選擇

2.2.1 固體類試樣 根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)的報(bào)道 （黃彪等，2018； 楊春林等，2013； 鐘偉燕等，2012；Saad等，2007），測(cè)定樣品中抗氧化劑含量的提取方法主要有層析柱法、液液萃取法、固相萃取法、超聲波輔助有機(jī)溶劑直接提取法等。層析柱法因?qū)游鲋畛涞男什町惗绊憸y(cè)定結(jié)果的重復(fù)性，操作耗時(shí)較長(zhǎng)，不適合大批量樣品的處理；液液萃取法雖處理方法簡(jiǎn)單，但回收率相對(duì)較低，不適合大批量樣品的處理；固相萃取法具有有機(jī)溶劑消耗少、分離效果好、操作簡(jiǎn)單、便于自動(dòng)化的優(yōu)點(diǎn)，缺點(diǎn)是順序操作，針對(duì)不同基質(zhì)的樣品會(huì)導(dǎo)致不同步驟的優(yōu)化復(fù)雜，甚至不能優(yōu)化；超聲波輔助有機(jī)溶劑直接提取法不需專用設(shè)備，提取效率較高，適合大批量樣品的處理。根據(jù)飼料樣品的性質(zhì)，選擇了乙腈為提取有機(jī)溶劑，選用了超聲波輔助有機(jī)溶劑直接提取法，按“1.2.2”試樣溶液制備分別對(duì)加標(biāo)的不同基質(zhì)飼料試樣進(jìn)行了提取處理，試驗(yàn)結(jié)果見“2.3.3”的加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，采用乙腈為提取有機(jī)溶劑，超聲水浴助溶40 min，提取液經(jīng)有機(jī)相針式濾器（直徑：25 mm，孔徑：0.45 μm）過(guò)濾，實(shí)現(xiàn)提取，上述提取方法適用于固體類飼料試樣中5種抗氧劑的測(cè)定。

2.2.2 動(dòng)物油脂類試樣 部分動(dòng)物油脂，如牛油，常溫下為凝固狀態(tài)，因此在用乙腈提取之前，需要將其融化。5 g油脂在融化狀態(tài)下，加入50 mL乙腈后，常溫超聲提取，會(huì)出現(xiàn)重新凝固的現(xiàn)象。因此，需要在一定溫度下進(jìn)行超聲提取。根據(jù)40～65℃下超聲提取的現(xiàn)象，發(fā)現(xiàn)超聲溫度設(shè)置為55℃時(shí)，能夠避免油重新凝固，乙腈和融化狀態(tài)的油脂能夠充分接觸。此外，為考察55℃超聲40 min對(duì)各組分的影響，將50 mL的混合標(biāo)準(zhǔn)作同步處理，和未超聲處理的等濃度混合標(biāo)準(zhǔn)液峰面積相比，處理后的各組分峰面積的回收率為98.7%～101.4%。因此，選擇超聲提取溫度為55℃，以保證油脂樣品中抗氧化劑的充分提取。55℃超聲提取后，試樣溶液溫?zé)幔缰苯尤∩蠈舆^(guò)濾膜，會(huì)出現(xiàn)渾濁現(xiàn)象，因此需要靜置10 min以上。為提高效率，取上層液10～20 mL，置離心管中，9000 r/min離心5 min，用有機(jī)相針式濾器（直徑25 mm，孔徑0.45 μm）過(guò)濾，實(shí)現(xiàn)提取。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見“2.3.3”的加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，上述提取方法適用于動(dòng)物油脂類試樣中5種抗氧劑的測(cè)定。

2.3 方法的確認(rèn)

2.3.1 線性關(guān)系 按“1.2.3”的液相色譜條件，取混合標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液進(jìn)行液相色譜分析，每個(gè)濃度進(jìn)樣3次。以5種抗氧化劑色譜峰的峰面積為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，PG在質(zhì)量濃度0.50～25.00 μg/mL，BHA、EQ、TBHQ和BHT在質(zhì) 量濃度1.00～50.00 μg/mL均與峰面積呈良好的線性關(guān)系（相關(guān)系數(shù)r2＞0.999）。結(jié)果見圖4。

圖4 混合標(biāo)準(zhǔn)（PG、TBHQ、BHA、EQ和BHT）系列工作溶液的線性關(guān)系圖

2.3.2 檢出限（LOD）和定量限（LOQ） 選取空白基質(zhì)飼料，添加一定濃度的5種抗氧化劑標(biāo)準(zhǔn)溶液，按“1.2.2”的試樣溶液制備，“1.2.3”的液相色譜條件進(jìn)行測(cè)定。依據(jù)設(shè)定5種抗氧化劑的LOD為信噪比（S/N）=3，LOQ為信噪比（S/N）=10。 經(jīng)實(shí)驗(yàn)，確定了本方法的檢出限分別為：PG 1.8 mg/kg、BHA 1.9 mg/kg、EQ 2.0 mg/kg、TBHQ 1.9 mg/kg、BHT 5.0 mg/kg；本方法的定量限分別為：PG 8.8 mg/kg、BHA 8.7 mg/kg、EQ 8.9 mg/kg、TBHQ 8.6 mg/kg、BHT 10.0 mg/kg。 結(jié)果見圖5。

圖5 LOD和LOQ確定的典型色譜圖

2.3.3 加標(biāo)回收率與精密度 分別準(zhǔn)確稱取配合飼料、維生素添加劑預(yù)混合飼料、魚粉、牛油約5 g，根據(jù)5種抗氧化劑的線性范圍，依低、中、高分別加入3個(gè)濃度水平的5種抗氧化劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液各5份，按“1.2.2”制備成試樣溶液，進(jìn)行5種抗氧化劑的質(zhì)量濃度測(cè)定。考慮到樣品中存在一定本底，不是理想的空白基質(zhì)，因此，針對(duì)不同本底進(jìn)行了相應(yīng)組分的低、中、高濃度添加，調(diào)整稀釋倍數(shù)，使加標(biāo)試樣溶液中抗氧化劑的質(zhì)量濃度在標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍內(nèi)，扣除本底后分別計(jì)算添加試樣中的平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。結(jié)果見表1和圖6。結(jié)果表明，在不同基質(zhì)飼料的加標(biāo)試樣中PG的平均回收率為76.2%～98.8%（RSD 1.1%～9.6%）；TBHQ的平均回收率為77.2%～97.8%（RSD 0.9%～4.3%）；EQ的平均回收率為77.3%～98.0%（RSD 0.7%～6.9%）；BHA的平均回收率為76.7%～95.8%（RSD 1.1%～6.2%）；BHT的平均回收率為75.3%～95.8%（RSD 0.9%～7.1%）。由上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，方法準(zhǔn)確可靠。

圖6 配合飼料、維生素添加劑預(yù)混合飼料、魚粉和牛油分別添加低、中、高3個(gè)濃度水平的混合標(biāo)準(zhǔn)后的典型色譜圖

表1 不同基質(zhì)飼料的加標(biāo)回收率與精密度測(cè)定結(jié)果（n=5）

2.4 試樣測(cè)定 分別取骨粉、魚粉、雞肉粉、雞油、牛油、仔豬前期濃縮飼料、育肥豬配合飼料、4%母豬哺乳期復(fù)合預(yù)混合飼料、0.3%肉種雞復(fù)合預(yù)混合飼料和寵物維生素預(yù)混合飼料各3份，按“1.2”的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見表2。結(jié)果表明，上述飼料樣品中抗氧化劑檢出的有TBHQ、EQ、BHA和BHT，其中仔豬前期濃縮飼料和牛油中檢出TBHQ，骨粉、魚粉和雞肉粉中檢出EQ，雞油、4%母豬哺乳期復(fù)合預(yù)混合飼料和寵物維生素預(yù)混合飼料中檢出BHA，牛油、育肥豬配合飼料、0.3%肉種雞復(fù)合預(yù)混合飼料和寵物維生素預(yù)混合飼料中檢出BHT。在魚粉和寵物維生素預(yù)混合飼料中添加復(fù)合抗氧化劑，從測(cè)定結(jié)果可知目前飼料工業(yè)中主要使用的合成類抗氧化劑為EQ、BHA和BHT。

表2 試樣中合成類抗氧化劑的測(cè)定結(jié)果（n=3）

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本法操作簡(jiǎn)便易行、快速，準(zhǔn)確性、重復(fù)性均較好，各項(xiàng)性能指標(biāo)達(dá)到日常檢測(cè)分析的要求，適用于飼料中PG、TBHQ、EQ、BHA和BHT5種合成類抗氧化劑含量測(cè)定的質(zhì)量控制。