馮淑玲， 邱韻怡，吳仕輝

（廣東海大集團股份有限公司 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部微生態(tài)資源養(yǎng)殖利用重點實驗室，廣東廣州 511400）

蛋白質(zhì)是飼料中主要的營養(yǎng)指標(biāo)之一，而氨基酸是構(gòu)成動物體內(nèi)營養(yǎng)所需生物大分子蛋白質(zhì)和多肽的基本單位。氨基酸種類非常多，但組成蛋白質(zhì)的基本氨基酸約有20種。氨基酸含量的精準(zhǔn)測定對飼養(yǎng)動物的營養(yǎng)配方精準(zhǔn)設(shè)計至關(guān)重要。隨著科技的發(fā)展，氨基酸分析方法根據(jù)原理的不同，可分為化學(xué)分析法、光譜法、色譜法和其他方法 （宋軍，2020；楊苗苗，2018；賈錚等，2017） ，而采用茚三酮作為柱后衍生劑的離子交換色譜法則被公認(rèn)為是這項技術(shù)的經(jīng)典方法（楊欣卉和謝劍飛，2019；丁永勝和牟世芬，2004；AOAC Official Method 994.12），其專屬檢測設(shè)備氨基酸分析儀也因此得到廣泛應(yīng)用。國標(biāo)GB/T 18246-2019飼料中氨基酸的測定采用的就是離子交換色譜——全自動氨基酸分析儀，其具有高靈敏度、高精密度、操作簡單等優(yōu)勢。

除了設(shè)備的穩(wěn)定性，前處理是引入誤差的最關(guān)鍵因素。其中水解是氨基酸分析前處理中重要的一環(huán)，直接影響氨基酸分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。飼料中氨基酸以游離態(tài)和蛋白質(zhì)形式存在，前處理酸水解的目的是為了水解肽鍵，將氨基酸水解成游離狀態(tài)，其重點和難點是保證水解徹底完全且減少敏感氨基酸的損失。本實驗選取高級魚粉作為日常質(zhì)控樣品，樣品經(jīng)鹽酸水解后，用氨基酸分析儀進行測定，通過收集質(zhì)控數(shù)據(jù)，繪制質(zhì)控圖，并結(jié)合前處理過程中溫度等監(jiān)控手段，對可能影響結(jié)果穩(wěn)定性的因素進行分析評價。旨在對氨基酸檢測過程中存在的異常情況進行原因分析，找出檢測過程中影響16種氨基酸含量準(zhǔn)確性的關(guān)鍵因素，并進一步優(yōu)化檢測方法，提升方法的穩(wěn)定性。

1 材料與方法

1.1 原理 飼料中的蛋白質(zhì)在110℃，6 mol/L鹽酸作用下，水解成單一氨基酸，利用氨基酸分析儀對各種氨基酸組分的結(jié)構(gòu)、酸堿性、極性及分子大小的差異進行分析，經(jīng)陽離子交換柱分離后采用不同pH離子濃度的緩沖液將氨基酸組分依次洗脫下來，再與茚三酮試劑混合，然后共同流至反應(yīng)柱中，于135℃下加熱，形成深蘭紫色復(fù)合物，在570 nm有吸收峰；茚三酮與羥脯氨酸反應(yīng)不釋放氨 ，直接生成淺黃色復(fù)合物，在440 nm波長有最大吸收峰。

1.2 儀器設(shè)備 日立L-8900型氨基酸自動分析儀、分析天平（感量0.0001 g）、氮吹儀、恒溫水浴鍋、超純水機、電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、樣品粉碎機、多路溫度巡檢儀。

1.3 材料 質(zhì)控樣魚粉粉碎后并過60目篩，混勻密封，保存于0～4℃冰箱，以保證質(zhì)控樣的相對穩(wěn)定。

1.4 試劑 濃鹽酸（廣化GR）、苯酚（Sigma GR）、巰基乙酸（Sigma）、高純氮氣（≥99.99%）、16種氨基酸混合儲備液（Sigma 2.5 μmol/mL）、實驗用水（一級純水）。

1.5 試劑配制 鹽酸溶液（0.02 mol/L）：以濃鹽酸600倍稀釋得到。鹽酸水解溶液（6 mol/L）：將500 mL濃鹽酸與等體積水混合并加入1 g苯酚，混勻。不同pH和離子強度的洗脫用檸檬酸鈉緩沖液:按儀器說明書配制。茚三酮溶液:按儀器說明書配制。氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)工作液（0.1 μmol/mL）：吸取1 mL 2.5 μmol/mL標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用0.02 mol/L鹽酸定容至25 mL；分裝備用。

1.6 樣品前處理 準(zhǔn)確稱取0.06～0.08 g（精確至0.0001 g）樣品于25 mL水解管中，加入6 mol/L鹽酸15 mL，加入巰基乙酸3～5滴，充入高純氮氣5 min，封口擰緊，將水解管放在（110±2）℃的恒溫干燥箱內(nèi)，同時用多路溫度巡檢儀連續(xù)24 h監(jiān)測烘箱溫度。樣品水解22～24 h，取出冷卻，觀察水解管液面高度，如果液面高度明顯降低，表明在水解過程中存在密封不好，需重新稱樣測試。打開水解管蓋，用一級水多次沖洗水解管內(nèi)壁并將水解液全部轉(zhuǎn)移到100 mL容量瓶定容，過濾并棄去初濾液，準(zhǔn)確吸取1.0 mL于10 mL燒杯中75℃水浴蒸干，用2.0 mL 0.02 mol/L稀鹽酸溶解，混合均勻后用0.22 μm水相濾膜過濾，得上機溶液，供儀器測定。

1.7 儀器分析條件4.6 mm×60 mm，填料為3 μm磺酸型陽離子樹脂分離柱，緩沖液流速0.40 mL/min，反應(yīng)液流速0.35 mL/min，柱溫57℃，測定波長為570 nm和440 nm；每個樣品分析時間約32 min，氨基酸自動分析儀以外標(biāo)法測定氨基酸含量。

1.8 數(shù)據(jù)處理 連續(xù)記錄5個月的質(zhì)控值作為分析樣本的原始數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)處理用Microsoft Office Excel 2016和SPSS 25進行分析，質(zhì)控圖用Minitab 17進行繪制。實驗數(shù)據(jù)用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜圖 通過L-8900日立氨基酸分析儀分析程序，分離得16種氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液圖譜（圖1）和質(zhì)控魚粉圖譜（圖2），其基線平穩(wěn)，峰型窄而尖，峰寬合適，質(zhì)控魚粉各氨基酸出峰時間與標(biāo)準(zhǔn)品一致，分離良好。

圖1 16種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的分離色譜圖

圖2 質(zhì)控魚粉中16種氨基酸分離色譜圖

2.2 質(zhì)控圖的繪制 質(zhì)量控制過程中每批樣品至少一個質(zhì)控樣，按照時間順序收集結(jié)果數(shù)據(jù)，以測量批次為橫坐標(biāo)，測量值為縱坐標(biāo)，依據(jù)GB/T 17989.2-2020常規(guī)控制圖繪制控制圖——均值-標(biāo)準(zhǔn)差控制圖，當(dāng)測定值超過質(zhì)控檢驗?zāi)Ｊ?所規(guī)定控制線±3 s時，則視為失控，本次檢驗有85批數(shù)據(jù)，超出控制線有3組，判失控數(shù)據(jù)有4個（蘇氨酸、絲氨酸各1個，蛋氨酸2個），詳見表1。

表1 數(shù)據(jù)統(tǒng)計和處理

2.3 異常數(shù)據(jù)分析

2.3.1 含羥基脂肪族側(cè)鏈氨基酸——絲氨酸、蘇氨酸數(shù)據(jù)存在階段性偏低的情況 通過軟件繪制蘇氨酸（Thr）和絲氨酸（Ser）的均值-標(biāo)準(zhǔn)差控制圖（圖3）看出，從30～39個數(shù)據(jù)點中，有一個數(shù)據(jù)點距離中心線超過3倍標(biāo)準(zhǔn)差，屬于檢驗?zāi)Ｊ?，提示失控狀態(tài)；在這個數(shù)據(jù)段，蘇氨酸和絲氨酸同時存在數(shù)據(jù)偏低的情況，提示過程均值或波動性已經(jīng)偏離中心線。經(jīng)調(diào)看烘箱溫度記錄（圖4），烘箱溫度設(shè)定110℃，一般波動在±2℃，但在此期間，溫度逐漸升高，最高達(dá)125℃（烘箱上下限為設(shè)定溫度±15℃，超出此限值則自動斷電），樣品中蘇氨酸（Thr）和絲氨酸（Ser）的含量降低原因是干燥箱溫度過高，導(dǎo)致樣品中含羥基鍵氨基酸在消解過程中過快損失。發(fā)現(xiàn)干燥箱溫度異常后馬上維修，分析原因是在水解過程中，部分批次樣品中出現(xiàn)個別樣品水解時水解管密封性不好的問題，鹽酸在水解過程中揮發(fā)，腐蝕烘箱零部件，特別是風(fēng)機和探頭，造成烘箱的溫度失控，這是目前采用電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱進行酸水解的弊端之一，也是要24 h監(jiān)測干燥箱溫度的原因。

圖3 Minitab軟件繪制蘇氨酸（Thr）和絲氨酸（Ser）的均值-標(biāo)準(zhǔn)差控制圖

圖4 多路巡檢儀測得恒溫干燥箱溫度記錄

為了進一步驗證水解溫度對16種氨基酸的影響程度，設(shè)計了樣品經(jīng)不同水解溫度（90、100、110、120、130℃）水解24 h的實驗，通過檢測各氨基酸含量的變化情況來進行驗證。

實驗結(jié)果表明（表2和圖5），不同溫度對飼料中16種氨基酸的測定結(jié)果的影響不同。主要分為2類：第一類是難水解的，例如天冬氨酸（Asp）、谷氨 酸 （Glu）、甘 氨 酸 （Gly）、丙氨 酸 （Ala）、纈氨酸（Val）、異亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）這幾個氨基酸含量隨溫度的升高逐漸提高，蛋氨酸（Met）、酪氨酸（Tyr）、苯丙氨酸（Phe）、賴氨酸（Lys）、組氨酸（His）、精氨酸 （Arg）至少要達(dá)到110℃才能基本水解完全，達(dá)到結(jié)果穩(wěn)定；Darragh等 （1996）和Ozols J（1990））研究表明，在水解階段各氨基酸會發(fā)生不同程度的損失，氨基酸的排序可能影響水解效果。如果支鏈上是脂肪族氨基酸，那么就會形成位阻，影響水解效率。脂肪族氨基酸之間的化學(xué)鍵，比如異亮氨酸-異亮氨酸、纈氨酸-纈氨酸、異亮氨酸-纈氨酸之間的肽鍵最難被打開，110℃水解24 h只能打開50%～70%，隨著溫度升高，肽鍵打開越多，含量越高（周夢怡和馬小芳，2018）；第二類是高溫易降解的，例如蘇氨酸（Thr）和絲氨酸（Ser）隨著溫度的升高含量有顯著下降。分析原因，蘇氨酸（Thr）和絲氨酸（Ser）均含有羥基鍵，極性基團具有親水性，性質(zhì)不穩(wěn)定容易降解，導(dǎo)致?lián)p失，容易受高溫的影響，需要嚴(yán)格控制并監(jiān)測氨基酸水解溫度。綜合來看，酸水解法水解24 h最適水解溫度是110℃，此時大多氨基酸含量達(dá)到最大。

圖5 不同水解溫度對氨基酸含量的影響

表2 不同溫度條件下氨基酸含量的變化 g/100 g

2.3.2 個別蛋氨酸檢測結(jié)果偏低 蛋氨酸質(zhì)控圖有2個檢測數(shù)據(jù)超出控制線，2個檢測數(shù)據(jù)超出警告線（圖6），提示異常，這里考慮是水解管的密封性不好、充入的氮氣不足或無充入氮氣導(dǎo)致蛋氨酸結(jié)果偏低。充氮氣的作用是保護蛋氨酸二硫鍵在水解過程中不被氧化分解，巰基乙酸也有同樣的保護作用。為進一步驗證，設(shè)計了5組對比實驗：（1）充入氮氣并添加巰基乙酸；（2）只充入氮氣；（3）只添加巰基乙酸；（4）充入氮氣并添加巰基乙酸但不密封；（5）為無充入氮氣無添加巰基乙酸作對照。實驗結(jié)果詳見表3。

表3 質(zhì)控魚粉在充入氮氣和添加巰基乙酸等不同條件下對蛋氨酸準(zhǔn)確性的影響 g/100 g

圖6 Minitab軟件繪制蛋氨酸（Met）的均值-標(biāo)準(zhǔn)差控制圖

實驗結(jié)果顯示，16種氨基酸檢測前處理中添加巰基乙酸并充入氮氣主要影響蛋氨酸的含量。實驗組1、2、3、4的蛋氨酸含量分別較對照組增高26.5%、25.2%、27.2%、25.2%（P＜0.05），說明添加巰基乙酸和充入氮氣對蛋氨酸保護較好。另外實驗組1、2、3、4的蛋氨酸含量之間并無顯著差異（P＞0.05），說明有效充入氮氣進行保護或添加巰基乙酸，都能達(dá)到保護蛋氨酸的作用。

3 討論

3.1 水解溫度對16種氨基酸檢測結(jié)果的影響本研究發(fā)現(xiàn)，由于各氨基酸的結(jié)構(gòu)不同，酸水解24 h其所需的最佳水解溫度亦不一樣。例如天冬氨酸（Asp）、谷氨酸（Glu）、甘氨酸（Gly）、丙氨酸（Ala）、纈氨酸（Val）、異亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）屬于難水解的氨基酸，水解溫度要求110℃以上才能充分水解，而蘇氨酸、絲氨酸對溫度敏感，最佳水解溫度為100℃，特別是超過110℃會導(dǎo)致含量明顯降低，例如水解溫度從110℃升到130℃時，蘇氨酸含量從2.75 g/100 g下降到2.33 g/100 g（下降了15.3%），絲氨酸含量從2.38 g/100 g下降到1.57 g/100 g（下降34.0%）。綜合來看，同時檢測16種氨基酸組分的最佳水解溫度為110℃。因此在氨基酸檢測前處理過程中，要嚴(yán)格控制水解溫度在（110±2）℃，必要時進行在線溫度監(jiān)控，以保證各氨基酸組分檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

3.2 充氮氣和添加巰基乙酸對蛋氨酸檢測結(jié)果的影響 本研究通過五組對比實驗，發(fā)現(xiàn)充氮氣或添加巰基乙酸均能很好的保護蛋氨酸在水解過程中不被破壞。通過充氮氣或添加巰基乙酸的方式與對照組相比，最高提高蛋氨酸含量達(dá)27.2%。說明在氨基酸檢測前處理過程中，采用充氮氣或添加巰基乙酸的方式對蛋氨酸進行保護是非常必要的，同時充氮氣和添加巰基乙酸兩種方法對結(jié)果的影響無顯著性差異（P＞0.05），因此，可以根據(jù)實驗室情況進行選擇。

4 結(jié)論

本文通過對質(zhì)控樣品的質(zhì)控圖分析發(fā)現(xiàn)，絲氨酸、蘇氨酸、蛋氨酸受到烘箱水解溫度波動或在水解過程中被破壞等因素的影響，導(dǎo)致結(jié)果出現(xiàn)偏差。確定了同時檢測16種氨基酸的最佳水解溫度為110℃，并且必須嚴(yán)格控制，必要時要進行在線溫度監(jiān)控，同時可以通過充氮氣或添加巰基乙酸的方式保護蛋氨酸在水解過程中不被破壞，以此確保氨基酸檢測結(jié)果準(zhǔn)確性。