胡 兵

（福建省特種水產(chǎn)配合飼料重點實驗室，福建天馬科技集團(tuán)股份有限公司，福建福州 350308）

日本鰻鱺（Anguilla japonica）又稱為河鰻、白鰻，屬硬骨魚綱鰻鱺目鰻鱺科鰻鱺屬（蔣天寶等，2012）。日本鰻鱺味道鮮美，肉質(zhì)細(xì)嫩，營養(yǎng)豐富，含有多種維生素、蛋白質(zhì)和不飽和脂肪酸，被譽為“水中人參”（王廣軍等，2009；婁甜甜等，2007）。腸道是日本鰻鱺消化飼料的主要場所，也是功能最重要的一段。而其他因素，如攝食、飼料組成、飼料添加劑及腸道微生物等，都會使腸道的結(jié)構(gòu)和功能受到影響（Hamidoghli等，2019；Kume等，2019；Zheng等，2019）。

丁酸梭菌是一種益生菌，有很好的生化特性和生理特性，能有效促進(jìn)生物的生長和提高存活率，具有廣闊的市場前景和應(yīng)用前景 （蘇志星，2020）。近幾年來，丁酸梭菌被廣泛應(yīng)用于治療人類的胃腸道等疾病，同時也用作飼料添加劑，促進(jìn)動物生產(chǎn)及養(yǎng)殖，提高動物免疫力 （張自杰等，2021；蘭菲菲，2019），但其對日本鰻鱺腸道發(fā)育的影響鮮有報道。本試驗通過在日本鰻鱺商業(yè)飼料中添加丁酸梭菌，研究其對日本鰻鱺腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響，探討丁酸梭菌的促生長作用機理，為其在日本鰻鱺養(yǎng)殖中的應(yīng)用提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 試驗飼料 本試驗所用飼料為市售鰻鱺黑仔配合飼料，以魚粉、魚油、α-淀粉、復(fù)合維生素、復(fù)合礦物質(zhì)等為主要原料。商品飼料實測主要營養(yǎng)成分為粗蛋白質(zhì)48.5%，粗脂肪6.5%，粗灰分12.1%，粗纖維0.8%，總磷1.8%，賴氨酸3.7%，水分6.0%。

1.2 試驗管理及樣品處理 飼養(yǎng)試驗在福建省福清市漁溪李金平養(yǎng)殖場進(jìn)行，養(yǎng)殖對象為日本鰻鱺黑仔鰻，平均規(guī)格（4.46±0.82）g。 試驗分為對照組和試驗組，每組各2個水泥池，水泥池規(guī)格為15 m×15 m，水深0.7 m，水溫25～27℃，每口水泥池養(yǎng)殖6萬尾日本鰻鱺。試驗時各自投喂試驗組飼料（含1‰丁酸梭菌）和對照組飼料（商業(yè)飼料），試驗飼料添加1‰丁酸梭菌（丁酸梭菌從廣東大澤農(nóng)生物科技股份有限公司購得，含量為5億cfu/g），先將丁酸梭菌倒入水中，充分?jǐn)嚢杈鶆蚝?，飼料與水按1：1.2的比例經(jīng)打料機攪拌成團(tuán)狀后投喂日本鰻鱺，每天投喂2次（5：00和17：00），試驗時間為30 d。試驗結(jié)束后從每口池隨機各取3尾鰻鱺，每組6尾，逐一稱重，取其前腸、中腸和后腸，固定在中性福爾馬林緩沖液中，通過石蠟包埋、切片和HE染色后觀察各腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)。

1.3 腸道切片觀察 腸道的石蠟包埋、切片、HE染色、拍照均在武漢博爾夫生物科技有限公司進(jìn)行。采用nikon eclipse 80i顯微鏡觀察腸道組織的形態(tài)并拍照，每個切片隨機選取6個視野進(jìn)行拍照，以明美顯微數(shù)碼測量分析系統(tǒng)（Mshot Image Analysis System）測量黏膜褶皺數(shù)量、黏膜褶皺高度、肌層厚度和杯狀細(xì)胞數(shù)量（孫媛等，2012；阮國良等，2004）（每張圖片隨機取10個點測定后取平均值）。

1.4 數(shù)據(jù)分析 數(shù)據(jù)使用 “平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，數(shù)據(jù)用SPSS 24.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行T檢驗，P＜0.05表示具有顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 丁酸梭菌對日本鰻鱺腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響試驗結(jié)束后，對照組日本鰻鱺平均體重為（8.53±3.82）g，試驗組平均體重為（9.40±2.69）g，試驗組體重較對照組提高了10.59%（P＜0.05）。如圖1所示，添加丁酸梭菌的試驗組，在腸道形態(tài)上顯著好于對照組，其黏膜褶排列較對照組密集，紋狀緣完整，上皮細(xì)胞核排列整齊；添加丁酸梭菌后黏膜褶細(xì)且長，呈指狀，形狀較均一，數(shù)量增多。

圖1 丁酸梭菌對日本鰻鱺腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

2.2 丁酸梭菌對日本鰻鱺前腸腸道結(jié)構(gòu)的影響由表1可知，飼料中添加丁酸梭菌，對日本鰻鱺前腸褶皺數(shù)量[（32.17±0.32） 個]、 高度[（669.56±54.32）μm]、肌層厚度[（47.91±4.15）μm]及杯狀細(xì)胞數(shù)量[（8.93±0.47）個]均有顯著影響，褶皺數(shù)量較對照組提高了22.23%（P＜0.05），黏膜褶皺高度較對照組提高了34.91%（P＜0.05），肌層厚度比對照組增加了76.79%（P＜0.05），杯狀細(xì)胞數(shù)量較對照組提高了54.77%（P＜0.05）。

表1 丁酸梭菌對日本鰻鱺前腸腸道結(jié)構(gòu)的影響

2.3 丁酸梭菌對日本鰻鱺中腸腸道結(jié)構(gòu)的影響由表2可知，飼料中添加丁酸梭菌，對日本鰻鱺中腸褶皺數(shù)量[（29.42±0.21） 個]、 高度[（639.60±19.20）μm]、肌層厚度[（37.13±1.88）μm]及杯狀細(xì)胞數(shù)量[（6.38±0.11）個]均有顯著影響，褶皺數(shù)量較對照組[（26.87±0.16） 個]提高了9.49%（P＜0.05）， 黏膜褶皺高度較對照組[（359.80±17.57）μm]提高了77.77%（P＜0.05），肌層厚度[（23.39±2.34）μm]比對照組增加了58.74%（P＜0.05），杯狀細(xì)胞數(shù)量較對照組[（3.84±0.24）個]提高了66.15%（P＜0.05）。

表2 丁酸梭菌對日本鰻鱺中腸腸道結(jié)構(gòu)的影響

2.4 丁酸梭菌對日本鰻鱺后腸腸道結(jié)構(gòu)的影響由表3可知，飼料中添加丁酸梭菌，對日本鰻鱺中腸褶皺數(shù)量[（37.50±0.21） 個]、 高度[（472.70±93.23）μm]、肌層厚度[（38.83±1.81）μm]及杯狀細(xì)胞數(shù)量[（5.94±0.19）個]均有顯著影響，褶皺數(shù)量較對照組[（31.25±0.45） 個]提 高了20%（P＜0.05），黏膜褶皺高度較對照組[（225.79±55）μm]提高了109.35%（P＜0.05），肌層厚度比對照組[（17.02±1.49）μm]增加了128.14%（P＜0.05），杯狀細(xì)胞數(shù)量較對照組[（3.43±0.22）個]提高了73.18%（P＜0.05）。

表3 丁酸梭菌對日本鰻鱺后腸腸道結(jié)構(gòu)的影響

2.5 日本鰻鱺前腸、中腸和后腸結(jié)構(gòu)對比 由表4可知，對照組和試驗組后腸[（31.25±0.45）、（37.50±0.21）個]的黏膜褶皺數(shù)量要顯著高于前腸[（26.32±0.26）、（32.17±0.32） 個]和 中 腸[（26.87±0.16）、（29.42±0.21） 個]， 分別提高了18.73%、16.30%；16.57%、27.46%（P＜0.05），且前腸、中腸和后腸黏膜褶皺數(shù)量有遞增趨勢；而黏膜褶皺高度，肌層厚度及杯狀細(xì)胞數(shù)量則有遞減趨勢，前腸的黏膜褶皺高度[（496.31±72.19）、（669.56±54.32）μm]，肌層厚度[（27.10±5.81）、（47.91±4.15）μm]及杯狀細(xì)胞數(shù)量[（5.77±0.32）、（8.93±0.47）個]顯著高于中腸和后腸，對照組和試驗組前腸黏膜褶皺高度比中腸和后腸分別提高了30.44%、4.68%；119.81%、50.26%（P＜0.05），前腸肌層厚度比中腸和后腸分別提高了15.86%、29.03%；59.22%、23.38%（P＜0.05），前腸杯狀細(xì)胞數(shù)量比中腸和后腸分別提高了50.26%、39.97%；68.22%、50.34%（P＜0.05）。

表4 日本鰻鱺前腸、中腸和后腸腸道結(jié)構(gòu)變化

3 討論

3.1 丁酸梭菌對日本鰻鱺腸道形態(tài)的影響 研究指出，魚類腸道結(jié)構(gòu)受多種因素的影響，如食性、腸道微生物、生長階段等。試驗發(fā)現(xiàn)，在動物體出現(xiàn)炎癥時，丁酸梭菌可以通過調(diào)節(jié)基因表達(dá)，從而抑制炎癥，丁酸梭菌能產(chǎn)抑菌蛋白，后研究證明起抑菌作用的是抗菌肽，丁酸梭菌可以降低動物血清中腎上腺皮質(zhì)激素皮質(zhì)酮的含量，顯著增強肝臟及結(jié)腸黏膜的抗氧化能力 （Luo等，2021；田召方等，2017；王騰浩等2015；廖秀冬等，2015）。

本試驗中，添加丁酸梭菌組的日本鰻鱺，腸黏膜長且細(xì)，紋狀緣完整，形狀均一，上皮細(xì)胞核整齊排列在細(xì)胞基部，且杯狀細(xì)胞的數(shù)量增多，黏膜褶數(shù)量增多，肌層厚度增厚；說明丁酸梭菌能夠有效的改善日本鰻鱺腸道的結(jié)構(gòu)形態(tài)：促進(jìn)黏膜褶高度增高，杯狀細(xì)胞的數(shù)量增多，以及微絨毛生長密集，均勻分布，使得腸道的吸收面積增加，能夠提高飼料的消化吸收率；杯狀細(xì)胞增多，增強了腸道細(xì)胞的自我保護(hù)及修復(fù)能力 （Bondia-Pons等，2015；Eias等，2013）。丁酸梭菌可影響日本鰻鱺腸道分泌消化液和黏液，使飼料潤滑，減少腸黏膜因食物而造成的機械性損傷；縱肌層厚度增加，更利于腸蠕動，并與飼料混合充分，使得飼料的轉(zhuǎn)化率提高，進(jìn)而促進(jìn)日本鰻鱺的生長。這些結(jié)果也與蘭菲菲（2019）在飼料中添加丁酸梭菌對歐洲鰻鱺生長與健康的影響及范晨薇（2020）在丁酸梭菌對克氏原螯蝦腸道健康的影響等研究結(jié)果相一致。

在本試驗中，添加1‰的丁酸梭菌對日本鰻鱺腸道整體影響都是有益的，但其對日本鰻鱺的前、中、后腸不同結(jié)構(gòu)的有益影響卻各有差異。與對照組相比，添加1‰的丁酸梭菌，日本鰻鱺后腸和前腸黏膜褶數(shù)目增加最多，較中腸黏膜褶的增加數(shù)目差異也更顯著，而其黏膜褶高度和杯狀體數(shù)量則為中腸和后腸最高且增加最多，較前腸差異更顯著，這可能是丁酸梭菌和腸道結(jié)構(gòu)功能雙重影響的結(jié)果。在腸道中，丁酸、乙酸等短鏈脂肪酸是丁酸梭菌的主要產(chǎn)物（趙必遷等，2020；桂國弘等，2016），短鏈脂肪酸由飲食中纖維多糖、非消化性淀粉等在腸腔中通過厭氧菌，酵解生成，其能增進(jìn)鈉吸收，提高結(jié)腸黏膜生長速度，加快上皮細(xì)胞增殖速率（劉松珍等，2013；宋增福等，2006；耿珊珊等，2004）。這可能是本試驗中，添加1‰的丁酸梭菌組鰻鱺黏膜褶數(shù)目和高度增加的主要原因，而杯狀體數(shù)量的增加則可能是黏膜褶數(shù)目和高度增加而出現(xiàn)的適應(yīng)性變化，Ling等（2015）的研究結(jié)果也證實了這一點。同時丁酸梭菌在腸道中還可產(chǎn)生淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶、脂肪酶等酶制劑（桂國弘等，2016），而多數(shù)魚類的腸道前、中、后腸三段因消化酶活力大小而存在不同的差異，部分魚類如白鰱、團(tuán)頭魴、胡子鯰等，其主要消化酶如淀粉酶、蛋白酶的活性沿前腸向后腸逐漸降低（姚一琳等，2010；涂永鋒等，2004）。另有潘曉東等（2010）在丁酸梭菌對鮸魚腸黏膜結(jié)構(gòu)及腸內(nèi)短鏈脂肪酸的影響試驗中，也出現(xiàn)了后腸絨毛高度較中腸增加更顯著這一結(jié)果，這也從側(cè)面證明了本試驗結(jié)果。但具體影響因素仍需進(jìn)一步驗證。

另外，添加1‰的丁酸梭菌后，日本鰻鱺前腸肌層厚度增加最多，較中腸和后腸差異更為顯著；這可能是因為在腸道中，丁酸梭菌代謝產(chǎn)生了丁酸。而腸道上皮組織細(xì)胞修復(fù)和再生的主要能量來源于丁酸（徐亞飛等，2018；劉婷婷等，2011），從而促進(jìn)了肌層厚度的增厚。另外，本試驗結(jié)果與徐亞飛等（2018）研究結(jié)果，在飼料中添加丁酸梭菌后，凡納濱對蝦的腸道肌層厚度增加顯著相一致。

3.2 腸道的結(jié)構(gòu)對日本鰻鱺生長的影響 腸道是魚類運輸、食物消化和營養(yǎng)物質(zhì)吸收的主要場所，并有免疫的功能，是魚類的免疫器官和消化器官 （涂永鋒等，2004）。腸道的功能和結(jié)構(gòu)密切相連，營養(yǎng)物質(zhì)被消化吸收的前提是要有完善的腸道結(jié)構(gòu)和正常的腸道功能。動物機體的發(fā)育和生長也受營養(yǎng)物質(zhì)吸收程度的直接影響。有研究表明，魚類腸道的功能和結(jié)構(gòu)不僅受生長階段和食性等因素的影響，還受飼料種類和微生物菌群的影響；這也直接影響魚類吸收飼料中的營養(yǎng)物質(zhì)，進(jìn)一步導(dǎo)致生長出現(xiàn)差異（Lee等，2018；劉軍等，2009；張錦華，2003）。

本試驗結(jié)果表明，腸道的發(fā)育與日本鰻鱺的生長性能關(guān)系緊密，丁酸梭菌添加組鰻鱺終末均重顯著高于對照組。這可能是丁酸梭菌對腸道的微生物平衡有調(diào)節(jié)作用，可維持日本鰻鱺穩(wěn)定的腸道環(huán)境，同時，丁酸梭菌在日本鰻鱺腸道內(nèi)可產(chǎn)生淀粉酶、蛋白酶等消化酶，促進(jìn)了鰻鱺腸道對飼料中營養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收。這也與Meng等（2020）、Chen等（2021）的研究結(jié)果相似。

4 結(jié)論

在本試驗條件下，飼料中添加1‰的丁酸梭菌 （含量為5億cfu/g），能顯著提高日本鰻鱺前腸、中腸和后腸的黏膜褶皺數(shù)量、高度、肌層厚度和杯狀細(xì)胞數(shù)量，改善日本鰻鱺的腸道結(jié)構(gòu)。