劉文志， 郭立平， 張倩璐

(南華大學(xué)第一附屬醫(yī)院麻醉科，湖南 衡陽(yáng) 421001)

肺動(dòng)脈高壓(pulmonary hypertension, PAH)是一種以肺部血管重構(gòu)和右心室肥大為特征的惡性疾病，可促進(jìn)早期右心衰，嚴(yán)重者可致病人死亡。PAH的發(fā)病機(jī)制包括肺動(dòng)脈收縮異常，結(jié)構(gòu)性血管重塑以及病理性纖維化和硬化等[1]。肺血管重塑是指由于肺動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞(pulmonary artery smooth muscle cell, PASMC)和成纖維細(xì)胞等異常增殖與肥大，以及細(xì)胞外間質(zhì)分泌增多，引起的肺動(dòng)脈壁增厚和肺循環(huán)阻力增大，這是PAH發(fā)生的關(guān)鍵性病理改變[2]。另一方面，PAH病人血管呈彌漫性炎性浸潤(rùn)，其血漿中諸多促炎因子，例如白介素(interleukin，IL)-1β、IL-2、IL-6、IL-8、IL-12、IL-18 和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)等的水平均顯著升高[3]。另外，缺氧被證實(shí)可通過(guò)誘導(dǎo)PASMCs分泌多種炎癥因子，促進(jìn)PASMCs異常增殖和PAH肺血管重構(gòu)[4, 5]，提示PAH病情發(fā)展與PASMCs炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。細(xì)胞焦亡是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的由消皮素家族(gasdermins，GSDMs)所介導(dǎo)，依賴胱天蛋白酶(caspases)家族活性的程序性細(xì)胞死亡，其特征是細(xì)胞膜表面形成多處孔洞，使胞內(nèi)外滲透壓有顯著差異，細(xì)胞發(fā)生腫脹直至破裂。此過(guò)程伴隨大量的促炎因子釋放(主要是IL-1β和IL-18)，并募集周圍炎性細(xì)胞導(dǎo)致持續(xù)性炎癥反應(yīng)[6]。NOD樣受體蛋白3(NOD-like receptor protein 3，NLRP3)、凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing CARD，ASC)和胱天蛋白酶1前體(pro-caspase-1)組成的NLRP3炎性小體，在焦亡發(fā)生中扮演重要角色。當(dāng)內(nèi)外環(huán)境改變致該炎性小體激活時(shí)，胱天蛋白酶1前體會(huì)活化為成熟胱天蛋白酶1，進(jìn)一步切割I(lǐng)L-1β和IL-18前體，促進(jìn)成熟IL-1β和 IL-18的產(chǎn)生和釋放[7]。最近，Zhang等 人[8]構(gòu)建出缺氧性PAH大鼠模型，發(fā)現(xiàn)其肺動(dòng)脈中膜存在較為明顯的細(xì)胞焦亡，體外缺氧誘導(dǎo)PASMCs也有類似現(xiàn)象。另外，PAH大鼠在用胱天蛋白酶1抑制劑處理，其血管重構(gòu)、右心室收縮壓和右心室肥厚等均明顯改善，這提示抑制PASMCs焦亡，對(duì)防治肺血管重塑和PAH有重要意義，但有關(guān)PASMCs焦亡的具體機(jī)制仍不甚清楚。

異氟醚(isoflurane)作為一種強(qiáng)效吸入性麻醉劑，可通過(guò)擴(kuò)張外周血管，降低灌注壓和外周血管阻力，對(duì)心肺功能起顯著性保護(hù)效應(yīng)[9]。Roehl等人[10]構(gòu)建了豬急性PAH模型，發(fā)現(xiàn)異氟醚預(yù)處理可顯著降低豬肺動(dòng)脈壓，以及血液中TNF-α和IL-6水平。與此類似，覃等人[11]報(bào)道，在心肺聯(lián)合移植術(shù)后的豬體內(nèi)，異氟醚持續(xù)預(yù)吸入可顯著降低肺平均動(dòng)脈壓，肺毛細(xì)血管嵌壓和中心靜脈壓，說(shuō)明異氟醚麻醉對(duì)由缺血再灌注損傷引起的PAH有一定保護(hù)作用。此外，證據(jù)顯示，異氟醚吸入麻醉可減少肝細(xì)胞內(nèi)胱天蛋白酶1/胱天蛋白酶11表達(dá)，通過(guò)經(jīng)典途徑和非經(jīng)典途徑抑制肝細(xì)胞焦亡和炎癥，進(jìn)而減輕小鼠體內(nèi)肝缺血再灌注損傷[12, 13]。鑒于PASMCs焦亡和炎癥紊亂在PAH中的重要作用，本研究聚焦于異氟醚對(duì)PASMCs焦亡的影響及潛在機(jī)制，為闡明異氟醚的抗PAH機(jī)制提供新的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

人PASMC細(xì)胞購(gòu)于美國(guó)Sciencell公司(#3110)；DMEM高糖培養(yǎng)基(#A4192101)、胎牛血清(FBS，#10100147)、胰酶/EDTA(#25200072)和Opti-MEM減血清培養(yǎng)基(#31985062)購(gòu)于美國(guó)Gibco公司；HEPES溶液(#C0215)、脫脂奶粉(#P0216)、青霉素-鏈霉素溶液(#C0222)、RIPA細(xì)胞裂解液(#P0013B)、PMSF(#ST506)、乳酸脫氫酶(LDH)細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒(#C0016)、胱天蛋白酶1活性檢測(cè)試劑盒(#C1102)、活性氧抑制劑N-乙酰基-L-半胱氨酸(NAC，#S0077)、BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒(#P0012S)、人TNF-α和IL-6 ELISA試劑盒(#PT518，#PI330)購(gòu)于上海碧云天公司；胞漿蛋白質(zhì)提取試劑盒(#BC3740)、核蛋白質(zhì)提取試劑盒(#R0050)、總蛋白質(zhì)提取試劑盒(#BC3711)、 ROS檢測(cè)試劑盒(#CA1410)、人IL-1β和IL-18 ELISA試劑盒(#SEKH-0002，#SEKH-0028)購(gòu)自北京索萊寶公司；總RNA提取純化試劑盒TRIzol? Plus RNA Purification Kit(#12183555)，TaqMan? 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(#N8080234)、Lipofectamine 3000(Lipo3000)轉(zhuǎn)染試劑(#L3000008)購(gòu)自美國(guó)ThermoFisher公司；Nrf2 siRNA(Nrf2 siRNA)和對(duì)照scrambled siRNA序列由上海吉瑪基因合成；Hoechst 33342/PI雙染試劑盒(#BL116A)購(gòu)自Biosharp公司；Nrf2(#ab137550)、HO-1(#ab52947)、NLRP3(#ab270449)、胱天蛋白酶1(#ab286125)、ASC(#ab151700)、GSDMD(#ab219800)和β-肌動(dòng)蛋白(#ab115777)兔抗人一抗購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；α-微管蛋白(#2144)、Histone H3(#4499)兔抗人一抗和辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔二抗(#7074)購(gòu)自美國(guó)CST公司；Western印跡超敏發(fā)光試劑盒Pierce ECL Plus(#CW0049)購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物公司。

1.2 人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)

人PASMCs用含20%胎牛血清，1%青霉素-鏈霉素，10 mmol/L HEPES的DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)。細(xì)胞分為常氧組、缺氧組和及缺氧+異氟醚組：(1)常氧組：將細(xì)胞置于37 ℃、21% O2、5% CO2條件下靜置培養(yǎng)；(2)缺氧組：將細(xì)胞置于37 ℃、3%O2、5%CO2條件下靜置培養(yǎng)24 h；(3)缺氧+異氟醚組：調(diào)整培養(yǎng)箱內(nèi)混合氣體濃度3%O2、5%CO2和2%異氟醚，37 ℃下靜置培養(yǎng)24 h。

1.3 siRNA轉(zhuǎn)染

按照說(shuō)明書中提供的步驟，利用Lipo3000將Nrf2 siRNA和對(duì)應(yīng)的scrambled siRNA轉(zhuǎn)染至PASMCs中。具體如下：轉(zhuǎn)染前24 h，細(xì)胞鋪于24孔板，密度控制在0.5×105～2×105。待細(xì)胞70%～80%融合，用150 μL Opti-MEM減血清培養(yǎng)基稀釋20 pmol siRNA溶液，混勻，標(biāo)記為A液；同體積Opti-MEM培養(yǎng)基稀釋1 μL Lipo3000溶液，混勻，標(biāo)記為B液。A液和B液于室溫下放置5 min，將二者充分混合，再室溫放置5 min，此即為siRNA-脂質(zhì)體混合物，標(biāo)記為C液，細(xì)胞于400 μL/孔無(wú)血清培養(yǎng)基中37 ℃孵育6 h，換成完全培養(yǎng)基，再于培養(yǎng)箱中放置48 h。提取細(xì)胞總蛋白，應(yīng)用Western印跡檢測(cè)Nrf2基因沉默效果。siRNA序列由上海吉瑪公司合成，Nrf2 siRNA的序列為5′-GUCAGCGACAGAAGGAUUATT-3′，scrambled siRNA的序列為5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′。

1.4 蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)

細(xì)胞經(jīng)相應(yīng)處理或轉(zhuǎn)染，丟棄培養(yǎng)液，4 ℃ PBS洗3次。將RIPA裂解液與PMSF溶液按100∶1體積混合，總體積100 μL。將細(xì)胞置于冰上，加入配置好的細(xì)胞裂解液。孵育20 min，用細(xì)胞刮將細(xì)胞輕輕刮下。收集裂解后的細(xì)胞液，于4 ℃下12 000 r/min離心10 min，取上清液，BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，將蛋白質(zhì)煮沸8 min以變性，置于-20 ℃保存?zhèn)溆?。根?jù)測(cè)得的蛋白質(zhì)濃度，取適量蛋白質(zhì)行SDA-PAGE凝膠電泳分離(濃縮膠80 V 30 min，分離膠120 V 1.5 h)，行濕轉(zhuǎn)法使蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜。用TBST液配置5%脫脂牛奶，將PVDF膜封閉4 h，分別孵育Nrf2、Kepa1、HO-1、NLRP3、胱天蛋白酶1、ASC、GSDMD、β-肌動(dòng)蛋白 一抗(稀釋比例均為1∶1 000), 置搖床4 ℃搖動(dòng)過(guò)夜。次日用 TBST洗膜(5 min/次，4次)，與HRP標(biāo)記羊抗兔二抗共孵育(稀釋比例1∶5 000)，4 ℃搖動(dòng)2 h，TBST洗膜(5 min/次，4次)，最后用ECL發(fā)光試劑盒顯影成像，Image J 軟件(version 1.53)分析蛋白質(zhì)條帶灰度值。

1.5 RNA提取和逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

細(xì)胞經(jīng)相應(yīng)處理或轉(zhuǎn)染，按Trizol試劑盒中的步驟提取總RNA。測(cè)定純度和濃度，利用TapMan逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將1 μg RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，按照說(shuō)明書配置相應(yīng)的反應(yīng)體系[14]。于StepOnePlusTM實(shí)時(shí)熒光定量 PCR系統(tǒng)(Applied Systems)進(jìn)行鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。PCR反應(yīng)參數(shù)為：預(yù)變性(95 ℃，10 min)、變性(97 ℃，15 s)、退火(55 ℃，30 s)、延伸(72 ℃，50 s)，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。得出溶解曲線統(tǒng)計(jì)Ct值。以 β-肌動(dòng)蛋白為內(nèi)參進(jìn)行分析，用2-ΔΔCt法來(lái)計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量，每個(gè)樣品均重復(fù) 3 次。所用到的引物序列如下：NLRP3 上游，5′-GGACTGAAGCA CCTGTTGTGCA-3′和下游，5′-TCCTGAGTCTCCCA AGGCATTC-3′；ASC上游，5′-AGCTCACCGCTAA CGTGCTGC-3′和下游，5′-GCTTGGCTGCCGACTGA GGAG-3′；GSDMD上游，5′-ATGAGGTGCCTCC ACAACTTCC-3′和下游，5′-CCAGTTCCTTGGAGAT GGTCTC-3′；β-actin上游，5′-CACCATTGGCAA TGAGCGGTTC-3′和下游，5′-AGGTCTTTGCGG ATGTCCACGT-3′。

1.6 活性氧活性檢測(cè)

細(xì)胞經(jīng)相應(yīng)處理或轉(zhuǎn)染后，用DCFH-DA 作為熒光探針，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS水平[15]，具體步驟如下：DCFH-DA用無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液按1∶1 000稀釋，使終濃度為 10 μmol/L。收集細(xì)胞，離心，棄培養(yǎng)基，使細(xì)胞懸浮于0.5 mL 和1 mL稀釋好的 DCFH-DA溶液中，密度控制在1×106～2×107/mL。置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)，孵育20 min，期間每隔 3～5 min 顛倒混勻，使細(xì)胞和探針充分接觸。為防止液體本底熒光強(qiáng)度過(guò)高，用無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3次，以充分除去未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA。利用熒光分光光度計(jì)(PerkinElmer FL6500)，在 488 nm激發(fā)波長(zhǎng)、525 nm 發(fā)射波長(zhǎng)條件下檢測(cè)熒光強(qiáng)度。

1.7 乳酸脫氫酶釋放率檢測(cè)

細(xì)胞LDH釋放水平，根據(jù)LDH細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒提供的步驟進(jìn)行。具體如下：將細(xì)胞接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中(200 μL/孔)，待細(xì)胞70%～80%融合，PBS洗滌，更換無(wú)血清培養(yǎng)基。經(jīng)相應(yīng)處理或轉(zhuǎn)染，將細(xì)胞培養(yǎng)板用多孔板離心機(jī)離心(400 g，5 min)。分別取各孔的上清液120 μL，加入到新的96孔板相應(yīng)孔中。加入LDH檢測(cè)試劑(60 μL/孔)，反復(fù)吹打數(shù)次混勻，25 ℃避光孵育30 min。酶標(biāo)儀(ThermoFisher Multiskan FC)檢測(cè) 490 nm 處各孔的吸光度(OD)。根據(jù)公式LDH釋放率(%)=(處理樣品吸光度-樣品對(duì)照孔吸光度)/(細(xì)胞最大酶活性的吸光度-對(duì)照樣品吸光度)×100%，計(jì)算出各組細(xì)胞培養(yǎng)液上清中的LDH含量。

1.8 胱天蛋白酶1活性檢測(cè)

胱天蛋白酶1活性檢測(cè)根據(jù)其活性檢測(cè)試劑盒中的步驟進(jìn)行。其原理是底物 Ac-YVADpNA 可在胱天蛋白酶1催化下生成黃色的 pNA，故檢測(cè) pNA含量即可反應(yīng)胱天蛋白酶1活性。細(xì)胞經(jīng)相應(yīng)處理或轉(zhuǎn)染后，選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，胰酶消化，600 g 4 ℃離心5 min，收集細(xì)胞，加入試劑盒提供的裂解液，冰浴裂解15 min。12 000 g 4 ℃離心10 min，小心取上清，轉(zhuǎn)移到冰浴預(yù)冷的離心管中。BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。將等量上清液樣品(含30 μg 蛋白質(zhì))置于 96 孔板，加入10 μL Ac-DEVD-pNA ，混勻，37 ℃ 下孵育2 h，酶標(biāo)儀檢測(cè) 405 nm 處A值，得出所生成的pNA含量。將未處理組設(shè)為對(duì)照組，其胱天蛋白酶1活性設(shè)為 1，得出不同處理/轉(zhuǎn)染后細(xì)胞胱天蛋白酶1的相對(duì)活性。

1.9 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

ELSA(enzyme-linked immunosorbent assay)試驗(yàn)根據(jù)試劑盒(含抗體預(yù)包被酶標(biāo)板)中提供的步驟進(jìn)行。具體如下：細(xì)胞經(jīng)相應(yīng)處理或轉(zhuǎn)染后，將培養(yǎng)液移至無(wú)菌離心管，1 000 g 4 ℃離心10 min，取上清并等量分裝至小EP管中，4 ℃保存?zhèn)溆?。ELISA檢測(cè)前 30 min，將試劑盒、待測(cè)上清液放置于室溫下回溫。用試劑盒內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品和上清液進(jìn)行梯度稀釋，并按說(shuō)明書要求將濃縮洗滌液(20×)用雙蒸水稀釋，配置成洗滌工作液。加入標(biāo)準(zhǔn)品/上清液前，用洗滌液洗板3次(300 μL/孔)，吸水紙上拍干。加入100 μL 不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品及上清液樣本依次加入反應(yīng)孔中，膠紙封板，37 ℃孵育90 min，洗板4次、拍干。再向反應(yīng)孔中加入100 μL生物素化抗體工作液，膠紙封板，37 ℃孵育60 min，洗板4次、拍干。再加入100 μL酶結(jié)合物工作液至反應(yīng)孔中，膠紙封板，37 ℃ 孵育30 min，洗板5次、拍干。再加入100 μL顯色底物至反應(yīng)孔中，膠紙封板，37 ℃避光顯色15 min，最后加入50 μL終止液終止反應(yīng)。酶標(biāo)儀檢測(cè) 450 nm 處A值，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行后續(xù)分析。

1.10 Hoechst/ PI染色法檢測(cè)肺動(dòng)脈平滑肌焦亡

將PASMCs種植于6孔板中，經(jīng)相應(yīng)處理或轉(zhuǎn)染，PBS溶液漂洗3次，分別加入 5 μL Hoechst 33342 工作液和5 μL PI工作液，輕輕混勻，4 ℃避光孵育30 min。PBS溶液漂洗2次，使用熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞焦亡情況。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 異氟醚處理對(duì)缺氧誘導(dǎo)的NOD樣受體蛋白3炎性小體激活和肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞焦亡的影響

研究表明，缺氧可誘導(dǎo)肺血管痙攣以及不可逆重構(gòu)，這是PAH發(fā)生的重要因素[16, 17]。首先檢測(cè)了缺氧對(duì)人PASMCs焦亡的影響。采用3%O2缺氧處理PASMCs 24 h，RT-PCR和Western 印跡法檢測(cè)焦亡相關(guān)蛋白質(zhì)表達(dá)，胱天蛋白酶1活性試劑盒檢測(cè)其活性，LDH細(xì)胞毒性試劑盒檢測(cè)細(xì)胞LDH釋放水平，ELISA檢測(cè)培養(yǎng)基上清IL-1β、IL-18、IL-6和TNF-α分泌。結(jié)果表明，與常氧組細(xì)胞相比，缺氧組細(xì)胞NLRP3、ASC、GSDMD的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平均顯著上升(P<0.0001，F(xiàn)ig. 1A, B)，切割胱天蛋白酶1蛋白水平顯著升高(P<0. 0001，F(xiàn)ig. 1B)，胱天蛋白酶1活性增強(qiáng)(P<0. 01，F(xiàn)ig. 1C)，LDH釋放率增加(P<0. 01，F(xiàn)ig. 1D)，培養(yǎng)基中IL-1β、IL-18、IL-6和TNF-α分泌量明顯增加(P<0. 0001, Fig. 1E)，Hoechst/ PI染色顯示，焦亡孔洞形成增加(Fig. 1F)。而異氟醚處理后，缺氧引起的上述指標(biāo)均有不同程度下調(diào)(P<0. 05，F(xiàn)ig. 1)。這些結(jié)果提示，異氟醚能減輕缺氧誘導(dǎo)的NLRP3炎性小體激活和PASMCs焦亡。

2.2 異氟醚通過(guò)減少活性氧生成以緩解缺氧誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞焦亡

眾多文獻(xiàn)報(bào)道，細(xì)胞內(nèi)ROS生成過(guò)多與NLRP3炎癥小體激活和焦亡發(fā)生密切相關(guān)[18, 19]。本文探討了異氟醚緩解缺氧誘導(dǎo)的PASMCs焦亡是否與ROS有關(guān)。采用3%O2缺氧處理PASMCs，異氟醚處理/不處理24 h，ROS檢測(cè)試劑盒檢測(cè)胞內(nèi)ROS生成。另外，用ROS抑制劑NAC預(yù)處理PASMCs缺氧模型，檢測(cè)焦亡相關(guān)蛋白質(zhì)表達(dá)，胱天蛋白酶1活性，LDH釋放，培養(yǎng)基上清炎癥因子分泌以及焦亡孔洞形成等指標(biāo)。結(jié)果表明，PASMCs經(jīng)缺氧處理后，胞內(nèi)ROS生成增加了約3.36倍，而異氟醚可顯著減少缺氧誘導(dǎo)的ROS生成(P<0. 01，F(xiàn)ig. 2A)。進(jìn)一步，用NAC預(yù)處理PASMCs，異氟醚緩解PASMCs焦亡的現(xiàn)象則更加明顯，體現(xiàn)在焦亡相關(guān)蛋白質(zhì)表達(dá)進(jìn)一步減少，胱天蛋白酶1活性降低，LDH釋放水平下降，IL-1β和IL-18等促炎因子分泌量減少(P<0. 05，F(xiàn)ig. 2B-F)，焦亡孔洞形成進(jìn)一步減弱(Fig. 2G)。這些現(xiàn)象證實(shí)，異氟醚是通過(guò)減少胞內(nèi)ROS生成來(lái)減輕缺氧誘導(dǎo)的PASMCs焦亡。

Fig.2 Inhibition of ROS production is responsible for the suppressive effects of isoflurane on NLRP3 inflammasome activation and pyroptosis in human PASMCs For normoxia experiments, cells were incubated in a humidified incubator with a constant supply of air(21% O2)with 5% CO2 at 37℃. For hypoxia/isoflurane experiments, cells were placed in a special hypoxia incubator with a gas mixture of air(3% O2), 5% CO2 with or without 2% isoflurane at 37℃ for 24 hours. (A) Cellular ROS levels were detected using a ROS assay kit. (B-F) Cells were pre-incubated with 2 mmol/L NAC for 2 hours, then they were hypoxic and/or treated with isoflurane. The mRNA and protein levels of pyroptosis-related factors were detected by RT-PCR (B) and Western blots (C). Caspase-1 activity was measured using a caspase-1 activity assay kit (D). LDH release was evaluated by LDH cytotoxicity assay kits (E). The secretion levels of IL-1β, IL-18, IL-6 and TNF-α in culture medium were assessed by ELISA kits (F); (G) Pyroptosis in PASMCs as observed by Hoechst/PI staining (scale bar is 20 μm). *P<0. 05, **P<0. 01, ***P<0.001,****P<0. 0001. n=3

2.3 異氟醚可促進(jìn)缺氧肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞內(nèi)核轉(zhuǎn)錄因子2核轉(zhuǎn)位和血紅素加氧酶1表達(dá)

核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor E2 related factor 2, Nrf2)被證明是細(xì)胞內(nèi)抗氧化和抗炎癥損傷的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，在PAH等多種疾病中扮演有益角色[20]。生理?xiàng)l件下，胞質(zhì)中Nrf2與其特異性阻遏蛋白Kelch樣ECH相關(guān)蛋白1(Keap1)結(jié)合，通過(guò)泛素-蛋白酶體途徑被降解。而病理情況下，Nrf2與Keap1解離，進(jìn)入細(xì)胞核，與抗氧化反應(yīng)元件(antioxidant response element，ARE)等結(jié)合，誘導(dǎo)細(xì)胞保護(hù)基因的轉(zhuǎn)錄，以清除ROS等有害物質(zhì)。血紅素加氧酶-1(heme oxygenase-1, HO-1)是Nrf2特異性靶基因之一，也是一種重要的抗氧化酶[21]。本文檢測(cè)了異氟醚對(duì)Nrf2/HO-1信號(hào)通路的影響。PASMCs經(jīng)缺氧/異氟醚處理24 h，Western印跡法檢測(cè)Nrf2和HO-1表達(dá)。結(jié)果顯示，與常氧組細(xì)胞相比，缺氧組細(xì)胞胞漿Nrf2表達(dá)升高，核內(nèi)Nrf2表達(dá)降低(P<0.01, Fig. 3A，3B)，胞內(nèi)HO-1表達(dá)減少(P<0.001, Fig. 3C)，而異氟醚處理可顯著抵消缺氧引起的Nrf2和HO-1的表達(dá)變化(P<0.01, Fig. 3)。這些發(fā)現(xiàn)提示，異氟醚可激活缺氧PASMCs內(nèi)Nrf2/HO-1信號(hào)通路。

Fig.3 Isoflurane promotes Nrf2 nuclear translocation and elevates the expression of HO-1 in hypoxic human PASMCs For normoxia experiments, cells were incubated in a humidified incubator with a constant supply of air(21% O2)with 5% CO2 at 37℃. For hypoxia/isoflurane experiments, cells were placed in a special hypoxia incubator with a gas mixture of air(3% O2), 5% CO2 with or without 2% isoflurane at 37℃ for 24 hours. (A, B) Cytoplasmic and nuclear Nrf2 expressions were detected by Western blotting. (C) The protein levels of HO-1 were detected by Western blotting. **P<0. 01, ***P<0.001, ****P<0. 0001. n=3

2.4 異氟醚通過(guò)激活Nrf2/HO-1通路減少活性氧生成和肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞焦亡

為了進(jìn)一步證實(shí)異氟醚通過(guò)Nrf2/HO-1通路清除ROS，本文將Nrf2 siRNA轉(zhuǎn)染入PASMCs，或者用HO-1特異性抑制劑鋅原卟啉(Znpp)預(yù)處理PASMCs，再將PASMCs經(jīng)缺氧/異氟醚處理24 h，檢測(cè)ROS生成。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染Nrf2 siRNA后，胞內(nèi)Nrf2水平下降了86%，提示轉(zhuǎn)染效果較好(P<0.001，F(xiàn)ig. 4A)。另外，異氟醚減少PASMCs內(nèi)ROS生成的效應(yīng)可被Nrf2 siRNA或Znpp預(yù)處理大部分抵消(P<0.05，F(xiàn)ig. 4B)。本文進(jìn)一步分析了沉默Nrf2對(duì)PASMCs焦亡的影響。結(jié)果表明，Nrf2 siRNA轉(zhuǎn)染后，異氟醚緩解PASMCs焦亡現(xiàn)象則被顯著抵消(P<0. 05，F(xiàn)ig. 4C-G)，這些結(jié)果證實(shí)，異氟醚通過(guò)激活Nrf2/HO-1通路以減少缺氧PASMCs內(nèi)ROS生成和PASMCs焦亡。

Fig.4 Isoflurane decreases ROS production in human PASMCs by activating the Nrf2/HO-1 pathway For normoxia experiments, cells were incubated in a humidified incubator with a constant supply of air(21% O2)with 5% CO2 at 37℃. For hypoxia/isoflurane experiments, cells were placed in a special hypoxia incubator with a gas mixture of air(3% O2), 5% CO2 with or without 2% isoflurane at 37℃ for 24 hours. Cells were transfected with 20 pmol/L Nrf2 siRNA or pre-treated with 10 μmol/L Znpp. (A) Western blotting was used to detect the transfection efficiency of Nrf2 siRNA. (B) Cellular ROS levels were detected using a ROS assay kit; (C, D) The mRNA and protein levels of pyroptosis-related factors were detected by RT-PCR and Western blotting; (E) Caspase-1 activity was measured using a caspase-1 activity assay kit; (F) LDH release was evaluated by LDH cytotoxicity assay kits; (G) The secretion levels of IL-1β, IL-18, IL-6 and TNF-α in culture medium were assessed by ELISA kits. ns, no significance, *P<0.05, **P<0.01,***P<0.001,****P<0.0001. n=3

3 討論

PASMCs在PAH的病情發(fā)展中扮演重要角色。PASMCs的異常遷移、增殖和凋亡等均會(huì)促使肺動(dòng)脈發(fā)生不可逆重構(gòu)，導(dǎo)致PAH發(fā)生[22]。在PAH病人體內(nèi)，血清IL-1β[23]、IL-6[24]、IL-8[24]、TNF-α[24]等水平以及PASMCs中IL-18表達(dá)均顯著上升[24]，而用抑制劑阻斷相關(guān)炎癥因子能顯著遏制PAH病情進(jìn)展[25]。最近，Zhang等人[8]發(fā)現(xiàn)，在患有缺氧性PAH的病人和小鼠體內(nèi)，其肺動(dòng)脈中膜有明顯的焦亡發(fā)生，體現(xiàn)在IL-18, 胱天蛋白酶1和高遷移率族蛋白1(high mobility group box 1, HMGB1)等焦亡相關(guān)因子的表達(dá)明顯升高，而對(duì)PAH小鼠注射胱天蛋白酶1抑制劑，其PAH的病情進(jìn)展顯著緩和，證明細(xì)胞因子驅(qū)動(dòng)的炎癥過(guò)程以及PASMCs焦亡與PAH的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。另外，異氟醚作為一種常用的吸入性麻醉劑，被報(bào)道在PAH和肺心病等疾病中發(fā)揮有利作用[26]，但機(jī)制未知。本研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)人PASMCs進(jìn)行缺氧處理，其焦亡水平顯著上升(Fig. 1)，這與前人研究結(jié)果一致，而異氟醚處理可顯著減輕缺氧PASMCs焦亡(Fig. 1)，提示異氟醚的心肺保護(hù)效應(yīng)可能與抑制PASMCs焦亡有關(guān)。

細(xì)胞焦亡的發(fā)生機(jī)制復(fù)雜，胞內(nèi)ROS生成過(guò)多導(dǎo)致的氧化還原異常與NLRP3炎性體激活和焦亡發(fā)生最為密切。Wu等人[27]發(fā)現(xiàn)，尼古丁可通過(guò)ROS依賴性的方式激活血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)的NLRP3炎性小體，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞焦亡和動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展，而當(dāng)細(xì)胞用ROS抑制劑NAC處理后，這些效應(yīng)被顯著抵消。甲基蓮心堿可通過(guò)抗氧化效應(yīng)，清除胞內(nèi)過(guò)多生成的ROS，阻斷LPS-ATP誘導(dǎo)的NLRP3/caspase-1信號(hào)通路激活，進(jìn)而抑制內(nèi)皮細(xì)胞焦亡[28]。與此類似，香煙煙霧提取物(CSE)可通過(guò)NLRP3/caspase-1通路誘導(dǎo)人支氣管上皮細(xì)胞焦亡。而阻斷胞內(nèi)的ROS生成，NLRP3炎性體活化以及細(xì)胞焦亡均明顯減弱，提示CSE的促上皮細(xì)胞焦亡效應(yīng)須ROS參與[29]。另外，異氟醚被發(fā)現(xiàn)有清除細(xì)胞內(nèi)ROS的功能。Yao等人[30]報(bào)道稱，對(duì)腦動(dòng)脈閉塞的小鼠進(jìn)行異氟醚亞麻醉，其小膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元活性顯著增強(qiáng)，腦損傷明顯恢復(fù)。從機(jī)制而言，異氟醚可通過(guò)減少胞內(nèi)ROS含量，阻斷ROS依賴的p38 MAPK/NF-κB信號(hào)通路激活，減輕細(xì)胞炎癥和凋亡。Yin等人[31]研究發(fā)現(xiàn)，異氟醚可通過(guò)清除肺泡巨噬細(xì)胞內(nèi)過(guò)多生成的ROS，抑制NLRP3炎性體和胱天蛋白酶1活性，以及細(xì)胞焦亡發(fā)生，進(jìn)而改善家兔急性肺損傷。類似的，Li等人[32]發(fā)現(xiàn)，異氟醚亞麻醉可通過(guò)降低中性粒細(xì)胞內(nèi)過(guò)量的ROS，抑制NF-κB核轉(zhuǎn)位和MAPK通路激活，進(jìn)而減少胞內(nèi)NO/ONOO-釋放和肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞蛋白質(zhì)滲出，改善肺功能。本文的研究發(fā)現(xiàn)，缺氧PASMCs內(nèi)ROS水平顯著升高，而經(jīng)異氟醚處理，ROS水平降低。另外，用ROS抑制劑NAC預(yù)處理PASMCs，異氟醚減輕PASMCs焦亡的效應(yīng)被進(jìn)一步放大(Fig. 2)，證實(shí)異氟醚可通過(guò)減少PASMCs內(nèi)ROS含量，改善缺氧PASMCs的功能障礙，這與先前的報(bào)道也基本相符。

Nrf2是一種堿性亮氨酸拉鏈(leucine zippers, bZIP)轉(zhuǎn)錄因子，屬于CNC(Cap′N′ Collar)家族。生理情況下，Nrf2活性被Keap1抑制，其核轉(zhuǎn)位受阻。而病理情況下，Nrf2與Keap1發(fā)生解離，核轉(zhuǎn)位增加，與核內(nèi)ARE結(jié)合后，有助于清除胞內(nèi)ROS，并促進(jìn)多種細(xì)胞保護(hù)因子的轉(zhuǎn)錄[33]。葛等人[20]通過(guò)低氧誘導(dǎo)建立PAH大鼠模型，發(fā)現(xiàn)用Nrf2激活劑萊菔硫烷灌胃，可顯著促進(jìn)大鼠肺動(dòng)脈組織中Nrf2核轉(zhuǎn)位，升高丙二醛(MDA)水平和超氧化物歧化酶(SOD)活性，改善肺血管重構(gòu)和右心肥大，提示Nrf2是防治PAH的有效靶點(diǎn)。He等人[34]通過(guò)在SD大鼠中構(gòu)建缺氧性PAH模型，發(fā)現(xiàn)茯苓酸可顯著改善肺動(dòng)脈血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)，肺血管重塑以及右心肥厚。就機(jī)制而言，茯苓酸可以通過(guò)Nrf2-Keap1-ARE通路，清除PASMCs中過(guò)多生成的ROS，抑制細(xì)胞的異常增殖和凋亡。另外，Abramo等人研究發(fā)現(xiàn)，在Nrf2敲除(Nrf2-/-)的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞內(nèi)，其線粒體ROS的生成量顯著增加[35]。沒(méi)食子酸，一種廣泛分布于植物中的活性酚酸，可通過(guò)Nrf2依賴性的方式減少巨噬細(xì)胞內(nèi)ROS生成，抑制NLRP3炎性小體激活和細(xì)胞焦亡[36]。本研究發(fā)現(xiàn)，異氟醚可以通過(guò)促進(jìn)缺氧PASMCs內(nèi)Nrf2的核轉(zhuǎn)位，增加HO-1的表達(dá)(Fig. 3)，阻斷Nrf2或HO-1時(shí)，異氟醚減少PASMCs內(nèi)ROS生成的效應(yīng)被顯著抵消，并且Nrf2沉默可顯著抵消異氟醚的抗焦亡效應(yīng)(Fig. 4)，這說(shuō)明異氟醚可通過(guò)激活Nrf2/HO-1通路，清除胞內(nèi)過(guò)多的ROS，緩解PASMCs焦亡。綜上所述，本研究在體外較深入地挖掘了異氟醚緩解缺氧PASMCs焦亡的分子機(jī)制及其與氧化還原反應(yīng)之間的聯(lián)系，而類似的現(xiàn)象是否也在PAH動(dòng)物模型中存在，仍須進(jìn)一步設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)探討。