胡立強(qiáng)， 蘇 濤， 張 勇， 楊 浩， 陶怡然， 陶 澤*

(1)四川大學(xué)華西醫(yī)院衛(wèi)健委移植工程與移植免疫重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 成都 610041；2)四川大學(xué)華西醫(yī)院華西-加州預(yù)測(cè)干預(yù)醫(yī)學(xué)研究中心， 成都 610041)

當(dāng)前，新冠病毒由于其不同突變株的持續(xù)出現(xiàn)，導(dǎo)致疫情強(qiáng)勢(shì)反彈，截止2022年3月，全球感染新冠病毒的人數(shù)已達(dá)4.42億例，累計(jì)死亡人數(shù)已達(dá)598萬例。在抗擊新冠肺炎疫情的斗爭(zhēng)中，新冠病毒疫苗的研發(fā)在預(yù)防新型冠狀病毒感染、降低發(fā)病率和重癥率方面意義重大[1]。得益于新冠病毒的分離、全基因組序列、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和致病機(jī)制的快速解析，新冠病毒疫苗的研發(fā)緊隨其后迅速開展并不斷取得進(jìn)展[2, 3]。當(dāng)前，科研人員主要采用病毒滅活疫苗、重組蛋白疫苗、病毒載體疫苗和核酸疫苗等研發(fā)相關(guān)疫苗。截至2022年3月，中國(guó)已經(jīng)附條件上市的新冠疫苗已有5個(gè)(見Table 1)[4]。新冠病毒顯示出較好的免疫原性，尤其是其結(jié)合人靶細(xì)胞上的的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2(angiotension converting enzyme 2，ACE2)受體的刺突蛋白(spike protein)及其受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(receptor binding domain, RBD)，是免疫接種后的評(píng)估特異性抗體滴度的關(guān)鍵靶標(biāo)，也是制備生產(chǎn)各種檢查及治療性中和抗體的重要抗原[5-7]。由于突變株的周期性出現(xiàn)，快速評(píng)價(jià)刺突蛋白尤其是RBD的免疫原性并制備相關(guān)抗體，對(duì)于病毒的檢測(cè)、科學(xué)研究及疫苗和藥物開發(fā)都極為重要[8]。

Table 1 List of COVID-19 Vaccines Approved by The China Food and Drug Administration (CFDA)

得益于基因工程技術(shù)的快速發(fā)展，從全基因合成和重組蛋白質(zhì)的表達(dá)已較為成熟，能在較短時(shí)間內(nèi)表達(dá)制備相關(guān)抗原用于動(dòng)物免疫[9]。不同的表達(dá)系統(tǒng)由于蛋白質(zhì)折疊的微環(huán)境和翻譯后修飾的差異，對(duì)維持抗原天然結(jié)構(gòu)、活性和免疫原性方面有重要影響。因此，根據(jù)蛋白質(zhì)抗原的序列組成和翻譯后修飾特點(diǎn)，選擇合適的表達(dá)系統(tǒng)對(duì)于抗原的制備十分重要。目前，用于重組蛋白質(zhì)生產(chǎn)的表達(dá)系統(tǒng)主要包括大腸桿菌、酵母、昆蟲細(xì)胞和哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)。根據(jù)RBD的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，其具有較多的半胱氨酸，能形成多對(duì)二硫鍵，且具有2個(gè)潛在的N糖基化修飾位點(diǎn)和多個(gè)O糖基化位點(diǎn)[6]。而昆蟲細(xì)胞和哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)能夠促進(jìn)蛋白質(zhì)二硫鍵的形成和正確折疊，且糖基化系統(tǒng)較RBD天然修飾結(jié)構(gòu)更為接近，因此，較其他系統(tǒng)更適合用于RBD抗原的制備[10]。

本研究旨在比較昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)和哺乳細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)來源的重組RBD蛋白的特征，及其免疫小鼠后在小鼠體內(nèi)產(chǎn)生IgG抗體水平的變化情況。通過檢測(cè)2種表達(dá)系統(tǒng)來源的抗原和接種劑量對(duì)于誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生體液免疫反應(yīng)的能力，為針對(duì)新冠病毒RBD蛋白開發(fā)重組亞單位疫苗提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 BALB/c小鼠，雌性，8周齡，體重20 g左右。購自北京華阜康生物科技公司，飼養(yǎng)于華西醫(yī)院嚙齒類SPF 級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及實(shí)驗(yàn)操作符合動(dòng)物倫理委員會(huì)的要求。

1.1.2 細(xì)胞株 HEK293-ACE2-OE穩(wěn)定細(xì)胞株購自北京博奧龍免疫技術(shù)有限公司，細(xì)胞培養(yǎng)基為DMEM+10%胎牛血清，含嘌呤霉素濃度為5 μg/mL，于37℃，5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中。

1.1.3 主要試劑及耗材 昆蟲細(xì)胞High Five表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)的RBD蛋白(bRBD)和人胚胎腎細(xì)胞293(HEK293)表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)的RBD蛋白(hRBD)，SARS-COV-2 Spike假病毒以及anti-Spike蛋白的抗體購自北京義翹神州公司，去糖基化試劑PNGase F酶購自Sigma-Aldrich公司，免疫佐劑 Quick Antibody-Mouse 3W購于北京博奧龍公司，小鼠抗His抗體購自成都正能生物公司，辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(H+L)購自北京中杉金橋生物公司，羊抗鼠IgG H&L (DyLight? 488)購自Abcam公司，TMB底物顯色劑購自購自Sigma-Aldrich公司，酶標(biāo)板購于康寧公司。

1.2 方法

1.2.1 SDS-PAGE凝膠電泳 SDS-PAGE配制分離膠濃度為12.75%，凝縮膠濃度為4%聚丙烯酰胺凝膠，將一定濃度的RBD蛋白樣品通過Bio-Rad系統(tǒng)電泳完畢后，取出凝膠進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色，顯示目的條帶并判斷分子量是否正確。

1.2.2 質(zhì)譜 4 μg蛋白質(zhì)樣本通過 MAbPac RP 柱(2.1 mm i.d. × 50 mm)(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA))在UltiMate 3000 色譜儀(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA)上脫鹽和分離。緩沖液 A (水配制 0.1% 甲酸)作為流動(dòng)相A，緩沖液 B (乙腈配制0.1% 甲酸)作為流動(dòng)相B，流速為400 μL/min。液相分離梯度是：15% B 在0 ～1.5 min，15% ～ 50% B 在1.5 ～ 4 min，50% B 在4 ～ 5.3 min，50% ～ 20% B在5.3 ～ 5.4 min，20% B在5.4 ～ 5.5 min。

經(jīng)色譜分離，樣本通過 Q Exactive Plus mass spectrometer質(zhì)譜儀 (Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA) 檢測(cè)。在17 500 分辨率下采MS，其他的關(guān)鍵儀器參數(shù)如下：噴霧電壓：3.8 kV；鞘氣流速：40 arb；S-lens為50%；自動(dòng)增益目標(biāo)值：3×106；最大離子注入時(shí)間：200 ms；譜圖疊加次數(shù)：1。MS 質(zhì)譜從總離子流圖(TICs)提取并通過 BioPharma Finder 4.0軟件 (Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA)解卷積。

1.2.3 RBD蛋白去糖基化 使用PNGase F蛋白酶去除蛋白質(zhì)的N-糖鏈，取100 μg凍干的蛋白質(zhì)，加入45 μL的超純水和5 μL的10×蛋白質(zhì)變性緩沖液，100℃加熱10 min。再加入10 μL的10×G7緩沖液(0.5 mol/L磷酸鹽，pH7.5)，10 μL的超純水以及10 μL的PNGase F。在37℃培養(yǎng)箱中反應(yīng)過夜，在100℃加熱2 min終止反應(yīng)。

1.2.4 RBD蛋白糖基化位點(diǎn)鑒定 重組RBD蛋白(100 μg)經(jīng)胰酶和胞內(nèi)蛋白酶Glu-C組合酶切后成肽段，然后通過兩性離子親水色譜(Zic-HILIC)對(duì)肽段進(jìn)行富集，提高糖肽豐度。利用階梯能量HCD碎裂質(zhì)譜(SCE-HCD-MS/MS)(Orbitrap Fusion Lumos mass spectrometer，Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA)對(duì)所獲肽段進(jìn)行檢測(cè)分析，并借助質(zhì)譜分析軟件Byonic對(duì)檢測(cè)的數(shù)據(jù)進(jìn)行綜合分析。每個(gè)樣本3個(gè)技術(shù)重復(fù)。

1.2.5 小鼠分組與免疫 選擇8周齡的雌性Balb/c小鼠，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，隨機(jī)分為8個(gè)實(shí)驗(yàn)組和1個(gè)對(duì)照組，每組3只，準(zhǔn)備免疫。取昆蟲細(xì)胞表達(dá)來源(bRBD)和人源細(xì)胞表達(dá)來源(hRBD)的蛋白質(zhì)作為抗原，以10 μg和20 μg 2個(gè)劑量，與等體積免疫佐劑Quick Antibody-Mouse 3W充分混合，采用后腿肌肉注射方法。初次免疫14 d，用同樣的劑量和方法進(jìn)行第2次免疫。初次免疫后，第2、4、6、8、12、24周，各組3只小鼠斷尾取血，血液樣品靜置后4℃，3 500 r/min離心20 min分離血清，并分裝-80 ℃保存待檢測(cè)使用。

1.2.6 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)ELISA 血清樣本以比例用含1%BSA的1×PBS緩沖液稀釋，稀釋好的樣品按100 μL/孔加入已包被RBD蛋白酶標(biāo)板，37℃孵育2 h，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照組，其只加含1%BSA的1×PBS，陽性對(duì)照抗Spike蛋白抗體，PBST(1 L PBS+1.25 mL 40% Tween20)緩沖液洗板3次，加入HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗(1∶5 000稀釋)，100 μL/孔，37℃孵育40 min；洗板3次；避光加入TMB顯色液，顯色5 min，加入終止液，50 μL/孔；酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)下的吸光度值(A450)。

1.2.7 流式細(xì)胞術(shù) HEK293-ACE2-OE細(xì)胞用胰酶消化，并用培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。調(diào)整細(xì)胞數(shù)目至4×105/管，分組，加入帶his標(biāo)簽的重組RBD蛋白(2.5 μg/mL)，室溫作用1 h，800 g離心4 min，PBS洗2次，加入小鼠抗His抗體(1∶200稀釋)，室溫孵育1 h，PBS洗2次后加入熒光二抗驢抗小鼠IgG H&L (Alexa Fluor? 488)，37℃孵育0.5 h，PBS洗2次后重懸細(xì)胞，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。以PBS組處理的細(xì)胞為對(duì)照。

1.2.8 中和試驗(yàn) HEK293-ACE2-OE細(xì)胞按照1×104個(gè)/100 μL/孔接種到96孔板，培養(yǎng)過夜，SARS-COV-2 SPIKE假病毒按10 μL/孔與免疫后小鼠的血清樣品(4W，10 μg組的血清樣品，預(yù)先1∶10稀釋)37℃孵育1 h，健康小鼠血清作為對(duì)照組。隨后，加入96孔板中感染HEK293-ACE2-OE細(xì)胞，6 ～ 8 h后更換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。HEK293-ACE2-OE細(xì)胞含有熒光素酶基團(tuán)，在感染假病毒 48 h后，可通過檢測(cè)熒光素酶的活性判定感染效率。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用Graphpad Prism 8.3軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析處理，每組3個(gè)血清樣品重復(fù)，采用單因素方差分析(one-way ANOVA)對(duì)不同稀釋比例下的三組血清樣品的中和作用進(jìn)行比較，P< 0.05標(biāo)記為：“*”，P< 0.001標(biāo)記為：“***”。

2 結(jié)果

2.1 昆蟲源和人源受體結(jié)合區(qū)蛋白的鑒定

新冠病毒Spike蛋白的S1亞基包含受體結(jié)合域，負(fù)責(zé)病毒對(duì)受體的識(shí)別與結(jié)合[10]。本文選擇了RBD蛋白作為免疫原，測(cè)試其是否能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體。目前，RBD蛋白主要是由昆蟲細(xì)胞或者人胚胎腎細(xì)胞293表達(dá)。為了比較2種不同表達(dá)體系生產(chǎn)得到的Spike蛋白激發(fā)免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗體的效果，首先對(duì)昆蟲細(xì)胞表達(dá)來源(bRBD)和人源細(xì)胞表達(dá)來源(hRBD)的Spike蛋白理化性質(zhì)進(jìn)行分析鑒定。SDS-PAGE結(jié)果正如Fig.1A所示。2種不同表達(dá)體系生產(chǎn)的Spike蛋白分子量不同，hRBD分子量為35 kD左右，bRBD分子量為30 kD左右。在PNGase F蛋白酶去除了2種RBD蛋白的N-糖鏈后，其條帶趨于一致。而進(jìn)一步通過質(zhì)譜分析，鑒定出bRBD和hRBD準(zhǔn)確分子量分別為29 kD和32 kD(Fig. 1B)。這些結(jié)果提示，2種來源的Spike蛋白可能發(fā)生了一定程度的蛋白質(zhì)翻譯后修飾。有研究表明，Spike蛋白高度糖基化，在誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體及免疫應(yīng)答等過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。對(duì)2種來源的RBD蛋白的糖基化情況進(jìn)行鑒定。重組RBD蛋白經(jīng)酶切成肽段后，經(jīng)Zic-HILIC進(jìn)行富集；隨后，利用SCE-HCD-MS/MS對(duì)所獲肽段進(jìn)行比較分析。結(jié)果顯示，bRBD和hRBD上鑒定出的N-糖基化位點(diǎn)不盡相同，但與ACE2受體結(jié)合的區(qū)域均含有2個(gè)糖基化位點(diǎn)(N331和N343)(Fig. 1C,D)。以上結(jié)果表明，2種表達(dá)系統(tǒng)下的RBD蛋白均能夠發(fā)生糖基化修飾，與天然RBD更為接近，可能更適合作為RBD抗原用于機(jī)體免疫。

Fig.1 The physicochemical properties of bRBD and hRBD proteins (A) The molecular weight of hRBD, hRBD-G, bRBD and bRBD-G were detected by SDS-PAGE. (B) The accurate molecular weight of bRBD and hRBD were determined by mass spectrometry. (C) and (D) Glycosylation site analysis of bRBD and hRBD, respectively. The recombinant Spike protein (100 μg) was digested by trypsin and Glu-C, and then enriched by ZIC-HILIC, and were further detected and analyzed by SCE-HCD-MS/MS, subsequently the data were analyzed by Byonic software. Three replicates were assayed for each sample

2.2 昆蟲源和人源受體結(jié)合區(qū)蛋白與血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2過表達(dá)細(xì)胞的結(jié)合

新冠病毒主要通過RBD蛋白與宿主肺泡上皮細(xì)胞上的ACE2受體高親和力結(jié)合而侵入細(xì)胞[12]。通過流式細(xì)胞術(shù)可以比較昆蟲細(xì)胞來源和HEK293細(xì)胞來源的RBD蛋白對(duì)ACE2受體的結(jié)合情況。已知HEK293-ACE2-OE細(xì)胞過表達(dá)ACE2受體，2.5 μg/mL的bRBD和hRBD蛋白質(zhì)與該細(xì)胞結(jié)合1 h，因重組bRBD和hRBD蛋白質(zhì)帶有His標(biāo)簽，所以通過孵育anti-his抗體和對(duì)應(yīng)的熒光二抗，可以檢測(cè)bRBD和hRBD蛋白質(zhì)與細(xì)胞ACE2受體的結(jié)合情況。流式結(jié)果(Fig.2)顯示，bRBD和hRBD與HEK293-ACE2-OE細(xì)胞的結(jié)合率分別為88.5%和92.7%，提示這2種來源的RBD均可與細(xì)胞表面表達(dá)的ACE2受體結(jié)合，表明昆蟲細(xì)胞來源和HEK293細(xì)胞來源的RBD蛋白具備感染ACE2過表達(dá)細(xì)胞的能力。

Fig.2 The binding of bRBD and hRBD to ACE2-overexpressing cells HEK293-ACE2-overexpressing cells were digested with trypsin, and prepared as cell suspensions. bRBD and hRBD (2.5 μg/mL) were incubated with 4×105 cells for 1 hour at room temperature. After incubated with the primary antibody against 6-his for 1 hour and the secondary antibody (goat anti-mouse IgG, DyLight 550) for 0.5 hour, the cell bindings were analyzed by flow cytometry. (A) The binding of bRBD to HEK293-ACE2-overexpressing cells. (B)The binding of hRBD to HEK293-ACE2-overexpressing cells

2.3 不同劑量昆蟲源和人源受體結(jié)合區(qū)蛋白免疫產(chǎn)生IgG抗體水平的比較

為了評(píng)估昆蟲源和人源RBD蛋白作為抗原刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體效果，bRBD和hRBD蛋白質(zhì)分別作為抗原免疫小鼠，設(shè)置10 μg和20 μg 2個(gè)劑量，與等體積免疫佐劑Quick Antibody-Mouse 3W充分混合，后腿肌肉注射。初次免疫14 d，相同方法進(jìn)行二次免疫。將初次免疫后采集的第2、4、6、8、12和24周小鼠的血清，使用ELISA法檢測(cè)血清抗體滴度。結(jié)果正如Fig. 3所示，bRBD和hRBD蛋白質(zhì)均引起小鼠免疫反應(yīng)。在第1針重組蛋白免疫后2周，小鼠血清IgG抗體即全部轉(zhuǎn)陽。第2針加強(qiáng)免疫后，小鼠血清IgG抗體水平升高, 且直到24周依然維持在較高濃度。同一表達(dá)系統(tǒng)的抗原，相同時(shí)間點(diǎn)下，10 μg和20 μg的2個(gè)抗原免疫劑量，產(chǎn)生的血清抗體滴度均無明顯差異，未呈現(xiàn)劑量依賴型。上述結(jié)果提示，本文采用的免疫劑量10 μg可能已是較大的免疫劑量，足以引起強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答。而在相同時(shí)間點(diǎn)和劑量下，bRBD和hRBD蛋白質(zhì)誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體滴度也無明顯差異。結(jié)果表明，通過bRBD和hRBD蛋白質(zhì)作為抗原免疫小鼠，均能產(chǎn)生高滴度抗Spike蛋白R(shí)BD特異性抗體。

Fig.3 Anti-RBD antibody titers of mice immunized with different doses of antigens Balb/c mice are immunized intramuscularly with 10 μg and 20 μg per mouse of RBD proteins, which were mixed with Quick Antibody adjuvant previously, and blood samples were collected from the tail at 2, 4, 6, 8, 12 and 24 weeks after the primary immunization. (A)-(F) The anti-RBD antibody titers in the serum were measured by ELISA

2.4 昆蟲源和人源受體結(jié)合區(qū)蛋白免疫產(chǎn)生的抗體水平隨時(shí)間變化趨勢(shì)比較

通過ELISA檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)的血清抗體，觀察到用本實(shí)驗(yàn)的免疫方式，bRBD和hRBD抗原均能使小鼠產(chǎn)生抗Spike蛋白的IgG抗體，且小鼠血清抗體在初次免疫后第2周就全部轉(zhuǎn)陽，抗體濃度在隨后2周內(nèi)迅速上升，于第4周達(dá)到高峰，隨后開始下降，從第12到24周抗體濃度下降趨于平緩，在第24周仍然可以檢測(cè)到抗體，且抗體濃度高于第2周。以血清同在1∶64 000稀釋比例，展示各組小鼠體內(nèi)抗體水平隨時(shí)間的變化，結(jié)果正如Fig.4所示。由結(jié)果可見，bRBD和hRBD均能夠有效誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體，且二者誘導(dǎo)產(chǎn)生的血清抗體變化趨勢(shì)相似，抗體效價(jià)隨時(shí)間變化的趨勢(shì)均在第4周就達(dá)到最高，之后開始下降。但從第4周起，bRBD抗原免疫的小鼠血清中的抗體濃度略高于hRBD抗原免疫的小鼠。這些結(jié)果表明，利用昆蟲細(xì)胞來源和HEK293細(xì)胞來源的RBD蛋白均能夠有效誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體，且能夠持續(xù)較長(zhǎng)時(shí)間。

Fig.4 Changes of anti-RBD IgG titers in the serum of mice immunized with different antigens and different doses over time Balb/c mice are immunized intramuscularly with 10 and 20 μg per mouse of RBD proteins (A, bRBD and B, hRBD), which were mixed with Quick Antibody adjuvant previously. After the primary immunization, serum samples were collected from the tail vein every 2 weeks for 24 weeks, and then diluted at 1:64 000. The anti-RBD antibody titers in the serum were measured by ELISA

2.5 昆蟲源和人源受體結(jié)合區(qū)蛋白免疫產(chǎn)生的抗體中和作用比較

為了探究昆蟲源和人源的RBD蛋白誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生的特異性抗體是否具有保護(hù)作用，本文將免疫后的小鼠血清用于抗體中和試驗(yàn)。SARS-COV-2 Spike假病毒在感染ACE2過表達(dá)的HEK293細(xì)胞之前，與一定稀釋比例的血清進(jìn)行預(yù)孵育1 h，在感染細(xì)胞48 h時(shí)，通過熒光素酶活性檢測(cè)來表征病毒的感染效率，從而評(píng)估免疫后小鼠血清的病毒中和效果。結(jié)果癥如Fig.5所示，當(dāng)稀釋比例為1∶500時(shí)，Control、bRBD和hRBD組的熒光素酶的活性比率分別為92.4%，15.3%和24.8%；當(dāng)1∶1000時(shí)，這一比率分別為105.1%，36.6%和26.6%；當(dāng)1∶2000時(shí)，分別為93.6%，56.7%和47.3%；而當(dāng)1∶4000時(shí)，分別為91.1%，87.8%和64.1%。其中，當(dāng)稀釋比例在1∶2000以下時(shí)，bRBD和hRBD組與Control組有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P< 0.05)，而bRBD和hRBD組之間無明顯差異。這些結(jié)果初步表明，昆蟲源和人源的RBD蛋白免疫小鼠后產(chǎn)生的特異性抗體，均具有保護(hù)ACE2陽性細(xì)胞免受SARS-COV-2 Spike假病毒感染的作用。

Fig.5 The protection of the sera from the immunized mice to HEK293-ACE2-overexpressing cells from SARS-CoV-2 infection The SARS-CoV-2 Spike pseudovirus was preincubated with serum from the immunized mice at a certain dilution ratio for 1 h, then incubated with HEK293-ACE2-overexpressing cells. After infection for 48 h at 37 ℃, The viral infectivity was detected by the luciferase assay system. The data were analyzed by one-way ANOVA test for multiple comparisons using Graphpad Prism 8.3 software. ***, P< 0.001; *, P< 0.05; NS, P> 0.05

3 討論

新冠病毒自2019年底爆發(fā)以來，全世界范圍內(nèi)的疫情大流行已持續(xù)2年多[13]。由于病毒快速傳播和周期性的突變，已發(fā)現(xiàn)在新冠病毒入侵人體過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用的RBD蛋白上也產(chǎn)生了系列突變，最新出現(xiàn)的奧密克戎變異株在RBD蛋白上是突變數(shù)目高達(dá)15個(gè)，但仍然保留了與人類細(xì)胞ACE2受體的結(jié)合能力[14]。在當(dāng)前疫情反復(fù)外加新突變株不斷出現(xiàn)的背景下，疫苗和中和抗體等治療藥物，仍然是抗擊疫情的重要策略[15]。因此，評(píng)估抗原的免疫原性、快速制備相關(guān)抗體用于病毒檢測(cè)、科學(xué)研究及疫苗和藥物的開發(fā)在今后的防疫工作中非常重要。

相較于滅活疫苗、減毒活疫苗和病毒載體疫苗，重組亞單位疫苗具有安全性高、不良反應(yīng)小且整個(gè)生產(chǎn)過程無活病毒參與，便于規(guī)?；a(chǎn)和運(yùn)輸?shù)膬?yōu)點(diǎn)[16]。目前，中國(guó)已有1款批準(zhǔn)上市的重組RBD蛋白疫苗及2款進(jìn)入臨床研究的重組RBD蛋白疫苗[17]。重組亞單位疫苗的開發(fā)中選擇何種表達(dá)系統(tǒng)是一個(gè)難點(diǎn)，目前，仍未有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)用于比較疫苗生產(chǎn)的不同表達(dá)系統(tǒng)。常用的重組蛋白質(zhì)生產(chǎn)表達(dá)系統(tǒng)主要有細(xì)菌、酵母、哺乳動(dòng)物細(xì)胞和昆蟲細(xì)胞，它們各具優(yōu)缺點(diǎn)[18]。例如，原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的蛋白質(zhì)缺乏足夠的翻譯后修飾，可能減弱疫苗抗原蛋白的免疫原性；而酵母、昆蟲及哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)在進(jìn)行大量蛋白質(zhì)生產(chǎn)的成本較高。在中國(guó)，已上市的重組RBD蛋白疫苗ZF2001使用的是哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，進(jìn)入1期臨床試驗(yàn)的AdimrSC-2f(NCT04522089)使用的是桿狀病毒-昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，進(jìn)入III期臨床試驗(yàn)的由四川大學(xué)研制的重組疫苗(未命名，NCT04640402)，使用的是昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)[6]。

大量證據(jù)表明，新冠病毒Spike蛋白作為糖蛋白，其糖基化情況可能與病毒的感染以及引起宿主的免疫應(yīng)答相關(guān)[19-22]。前期研究發(fā)現(xiàn)，Spike蛋白具有22個(gè)N-糖基化修飾位點(diǎn)和17個(gè)O-糖基化修飾位點(diǎn)[23, 24]。哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的RBD蛋白(hRBD)為復(fù)合型糖鏈，含157種N-糖苷，而昆蟲細(xì)胞表達(dá)的RBD蛋白(bRBD)的糖鏈修飾為高甘露糖型，含38種N-糖苷[23, 25]。說明哺乳動(dòng)物細(xì)胞和昆蟲細(xì)胞生產(chǎn)的RBD蛋白存在糖基化修飾的差異，而這種差異是否會(huì)影響到該類重組RBD疫苗的免疫應(yīng)答效果仍有待進(jìn)一步研究。有意思的是，最近研究發(fā)現(xiàn)，RNA疫苗編碼的抗原蛋白在宿主的糖基化機(jī)制中可能會(huì)被糖基化修飾，進(jìn)而影響關(guān)鍵的抗原表位，導(dǎo)致機(jī)體無法產(chǎn)生有效的免疫反應(yīng)[26]。

因此，本文對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞和昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)來源的RBD蛋白免疫小鼠后的IgG抗體水平進(jìn)行對(duì)比研究。首先，對(duì)2種RBD蛋白的理化性質(zhì)及糖基化位點(diǎn)進(jìn)行了驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)hRBD和bRBD的N-糖基化位點(diǎn)盡管不同，但是與ACE2受體結(jié)合區(qū)域的2個(gè)糖基化位點(diǎn)(N331和N343)一致，而N331和N343糖基化位點(diǎn)已經(jīng)被報(bào)道與新冠病毒的感染密切相關(guān)[19, 27]。隨后，將2種RBD蛋白免疫小鼠，持續(xù)6個(gè)月監(jiān)測(cè)小鼠血清中RBD特異性抗體濃度，發(fā)現(xiàn)2種RBD蛋白均能夠快速引起小鼠的免疫反應(yīng)，且具有良好的免疫持久性，在初次免疫后半年內(nèi)仍可以在血清中檢測(cè)到特異性抗體。值得注意的是，從第4周起，bRBD抗原免疫的小鼠血清中的特異性抗體濃度略高于hRBD抗原免疫的小鼠，這或許與二者不同的糖基化程度有關(guān)，需要后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)。最后，本文利用中和試驗(yàn)初步探究了2種RBD蛋白免疫小鼠后產(chǎn)生的特異性抗體是否具有保護(hù)作用。結(jié)果顯示，哺乳動(dòng)物細(xì)胞和昆蟲源RBD免疫產(chǎn)生的特異性抗體均能夠有效抑制SARS-COV-2 Spike假病毒的感染，但2種RBD蛋白組未見明顯差異。

綜上所述，利用哺乳動(dòng)物細(xì)胞和昆蟲源RBD免疫小鼠能夠產(chǎn)生較高水平的特異性IgG抗體以及較好的免疫保護(hù)作用，為后續(xù)針對(duì)RBD蛋白的重組亞單位疫苗的開發(fā)選擇選擇何種表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)抗原提供參考依據(jù)。