劉淦楠，朱桂賢*，王 旭，徐友春

（1.北京信息科技大學(xué) 儀器科學(xué)與光電工程學(xué)院，北京 100096；2.清華大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，北京 100084）

即時檢測（Point-of-care testing，POCT）[1]設(shè)備對實驗室基礎(chǔ)設(shè)施的依賴程度較低，具有檢測快速、操作簡單和無須專業(yè)操作人員的優(yōu)勢，可在中心實驗室以外使用[2-3]。現(xiàn)有POCT 裝置獲得最終結(jié)果所采用的信號檢測方法包括比色檢測、熒光檢測、化學(xué)發(fā)光檢測、光電化學(xué)發(fā)光檢測和光譜檢測等[4-6]。在這些檢測方法中，比色檢測最為簡單、實用，應(yīng)用也最為普遍，因為其很大程度上可由用戶直接肉眼判斷結(jié)果，如早早孕檢測試紙條等，而其他檢測方法通常會涉及到較復(fù)雜或昂貴的外接設(shè)備，即時檢測的實用性不夠[7]。

在比色檢測的裝置中，紙基微流控分析裝置（Paper-based microfluidic analytical devices，μPAD）即較為常見的試紙條，是最被廣泛采用的方案，其具有檢測結(jié)果可視化、檢測效率快、可在偏遠(yuǎn)地區(qū)應(yīng)用、操作簡單和穩(wěn)定性強(qiáng)等優(yōu)勢。比色檢測的最基本原理是待檢組分會跟底物反應(yīng)產(chǎn)生有顏色的物質(zhì)或顏色的變化，根據(jù)顏色深淺即可反推出待檢組分的濃度，實現(xiàn)半定量或定量檢測[8-10]。在需要對結(jié)果進(jìn)行半定量或定量分析時，肉眼識別帶來的誤差就較為顯著，在這類應(yīng)用中，將比色反應(yīng)的結(jié)果數(shù)字化很有必要。因此，當(dāng)前的μPADs 比色檢測方法中檢測結(jié)果均由數(shù)字化器件獲得，如掃描儀[11]、手機(jī)攝像頭[12-13]或分立的CMOS 攝像頭，最終結(jié)果傳輸?shù)絇C 或手機(jī)端分析展示。例如，Hou等[11]開發(fā)了一種基于比色檢測的WIFI掃描儀用來定量檢測血漿中葡萄糖濃度含量；成亞倩等[14]介紹了基于比色生物檢測技術(shù)在食品黃曲霉毒素（AFT）檢測中的研究進(jìn)展。

然而，現(xiàn)有基于比色檢測的POCT 系統(tǒng)往往都是專門設(shè)計的，無論是檢測單個指標(biāo)[15]還是實現(xiàn)對同一檢測物中的多指標(biāo)檢測[16]，儀器的通用性不夠。不同試紙條配套的檢測儀器不能互換。隨著POCT 檢測需求的不斷發(fā)展，積累的檢測裝置也不斷增加，對于資源效率的占用變大。如何開發(fā)一款通用型的分析儀，能適配多數(shù)基于比色法試紙條的即時檢測，成為一個需要研究人員發(fā)揮智慧來回答的命題。

本論文中提出了一種基于CMOS 攝像頭成像利用試紙條適配器來指征待檢試紙條基本信息的通用型比色分析儀，并將其應(yīng)用于2 種典型的生化、免疫試紙條的檢測中，即葡萄糖試紙條的半定量生化檢測和腸毒素的定性免疫檢測。該系統(tǒng)的核心是紙基檢測條的適配器和基于樹莓派控制板的小型便攜式檢測盒。用戶將檢測條插入檢測盒中，樹莓派攝像頭會拍攝試紙條，并根據(jù)適配器攜帶的基本信息確定檢測指標(biāo)是什么，檢測區(qū)域在哪兒及定量的標(biāo)準(zhǔn)曲線。適配器中含有線圈，其被提前寫入對應(yīng)的紙基檢測條或直接稱呼為試紙條的所有必要參數(shù)，插入分析儀時可被近場通信（Near Field Communication，簡稱NFC）模塊無線感應(yīng)。利用該適配器來確定檢測對象和攝像頭采集比色反應(yīng)的RGB 值，是實現(xiàn)通用型生化、免疫檢測的關(guān)鍵。血糖和腸毒素檢測試紙條的驗證實驗證明了以上方案的可行性。

1 實驗

1.1 材料和試劑

金黃色葡萄球菌腸毒素檢測盒（膠體金法）購自北京美正生物科技有限公司（中國北京），血糖試紙（葡萄糖脫氫酶法）和羅氏血糖儀購自羅氏診斷產(chǎn)品（上海）有限公司（中國上海），質(zhì)控血清購自RANDOX（Britain），所有溶液均使用磷酸緩沖鹽溶液（PBS）（0.1 M）制備。

1.2 葡萄糖比色法檢測

目前，葡萄糖、蛋白質(zhì)、pH、膽固醇和堿性磷酸酶的比色分析已在μPAD 上得到驗證[11]。相關(guān)檢測中，試紙條測試區(qū)出現(xiàn)的顏色強(qiáng)度與分析物的濃度呈現(xiàn)對應(yīng)關(guān)系，配套的閱讀器能根據(jù)顏色變化來對比標(biāo)準(zhǔn)曲線，最終獲得待檢指標(biāo)的定量或半定量的濃度數(shù)據(jù)。

本系統(tǒng)檢測葡萄糖濃度的方法是滴加樣品至血糖試紙條然后將試紙條放入適配器中，最后插進(jìn)檢測儀的檢測口中等待檢測結(jié)果。將質(zhì)控血清加入PBS 緩沖液中分別稀釋為：16、12、8、4、2、1 mmol/L 標(biāo)準(zhǔn)品溶液，然后取2 μL 標(biāo)準(zhǔn)品溶液加至試紙條的進(jìn)樣口，在反應(yīng)時間1 min 內(nèi)進(jìn)行檢測。

1.3 免疫試紙條檢測

本實驗中所用的免疫檢測試紙條采用的是標(biāo)準(zhǔn)的免疫層析技術(shù)。試紙條的檢測線（Test-line，簡稱T線）、質(zhì)控線（Control-line，簡稱C 線）處會產(chǎn)生顯色反應(yīng)。通過相應(yīng)的分析儀或目視判斷，就可對試紙條的檢測結(jié)果進(jìn)行定性判讀。其中C 線用來判斷檢測是否有效，T 線上的顯色深淺度用來判斷所檢測物的濃度含量[17]，如圖1（a）所示。

本論文構(gòu)建的系統(tǒng)也是基于以上基本原理來判讀試紙條檢測結(jié)果的，分析儀會拍攝試紙條的照片，然后根據(jù)適配器里的數(shù)據(jù)知道T 線和C 線的位置，根據(jù)該處是否有顏色變化來給出“陽性”或“陰性”的判讀結(jié)果，如圖1（b）所示。

圖1 免疫檢測結(jié)構(gòu)圖

1.4 檢測系統(tǒng)

本文設(shè)計的便攜式生化及免疫分析儀主要用于生化指標(biāo)的半定量檢測和免疫指標(biāo)的定性檢測。當(dāng)然，定性還是定量主要是由試紙條本身的特性決定的。滿足即時檢測需要的通用型分析儀需要具備體積小、可便攜方便、檢測速度快和精度穩(wěn)定性靈敏度好等特點。搭建的便攜式分析儀的整體外觀及內(nèi)部結(jié)果如圖2（a）和2（b）所示。當(dāng)然，為了實現(xiàn)信號的最終展示，該儀器除了能對試紙條的特定區(qū)域顏色進(jìn)行定量檢測外，還具備對獲得數(shù)據(jù)的存儲與分析，以及最終傳輸?shù)綑z測終端的功能。

該便攜式分析儀的工作流程是：將待測試紙條放入適配器中再插進(jìn)儀器檢測口；系統(tǒng)中的樹莓派處理器驅(qū)動攝像頭、NFC 模塊和LED 光源，NFC 芯片通過射頻信號自動識別試紙條卡盒上的線圈目標(biāo)對象（圖2（c））并獲取相關(guān)數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)經(jīng)I2C 的連接方式傳輸?shù)綐漭蛇M(jìn)行處理。攝像頭拍攝照片后，系統(tǒng)根據(jù)NFC 傳輸?shù)臄?shù)據(jù)判定試紙條類型，并根據(jù)相應(yīng)的類型選擇對應(yīng)的檢測區(qū)域，葡萄糖的顏色反應(yīng)結(jié)果（圖2（d））及質(zhì)控線C 和檢測線T 的數(shù)據(jù)經(jīng)過內(nèi)部算法得出定性、定量的結(jié)果。檢測結(jié)果保存在SD 卡中，可方便后續(xù)處理。儀器可通過USB 連接上位機(jī)進(jìn)行數(shù)據(jù)傳遞，上位機(jī)PC 端也可控制儀器執(zhí)行檢測操作。

圖2 檢測系統(tǒng)整體結(jié)構(gòu)圖

2 結(jié)果和討論

2.1 通用型分析儀的整體設(shè)計方案

便攜式生化、免疫分析儀設(shè)計之初的檢測對象即為用于生化檢測及免疫檢測的試紙條，旨在通過提取試紙上的顏色信息進(jìn)而實現(xiàn)對被檢測物量化的功能。該分析儀的構(gòu)建涉及到電子、機(jī)械和生化方面的專業(yè)知識，屬于結(jié)構(gòu)簡單但功能齊全的光機(jī)電一體化設(shè)備。首先，系統(tǒng)需利用光源及樹莓派攝像頭對檢測試紙條上的顏色信息進(jìn)行提取。其次，由于樹莓派攝像頭中CMOS 圖像傳感器可以直接將光信號轉(zhuǎn)換成數(shù)字電信號，并且NFC 通信接收的數(shù)據(jù)也為數(shù)字信號，因此無須對信號進(jìn)行處理。接著，系統(tǒng)中央處理器需通過提取到的有效數(shù)據(jù)進(jìn)行運算，完成對檢測條信息量化的過程。最后，需要輸出單元將量化信息進(jìn)行輸出。因此整個系統(tǒng)按功能可分為以下3 個部分，信號采集、數(shù)據(jù)運算和人機(jī)交互。

信號采集部分包括檢測區(qū)域顯色區(qū)域、NFC 標(biāo)簽的信號采集；數(shù)據(jù)處理部分是將采集到的數(shù)字信號傳輸?shù)街醒胩幚砥?，對?shù)據(jù)進(jìn)行分析并實現(xiàn)定量計算；人機(jī)交互部分則是利用顯示屏等輸出設(shè)備將檢測結(jié)果以不同形式進(jìn)行傳遞。其中信號采集部分作為系統(tǒng)信號的來源，對信號提取的優(yōu)劣程度直接影響到檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，是整個檢測系統(tǒng)中較為關(guān)鍵的部分。

2.2 生化及免疫指標(biāo)檢測系統(tǒng)硬件設(shè)計

本文開發(fā)的便攜式檢測儀是一款具有快速準(zhǔn)確、攜帶方便和高精度等特性的儀器。本儀器選用Raspberry Pi Zero W 主控系統(tǒng)，其體積僅有60mm×30mm×5 mm，擁有1 GHz 單核CPU 和512 MB 的RAM，具有性能強(qiáng)、體積小和低功耗的特點，同時保持了高度的集成性能和簡易的開發(fā)特性。其硬件組成包括嵌入式系統(tǒng)，光電檢測模塊，NFC 模塊，供電模塊，信號采集處理模塊等。系統(tǒng)采用了樹莓派800 萬像素攝像頭來獲得最原始的圖片信息，當(dāng)然單一的CMOS 攝像頭成像面積有限，若想實現(xiàn)更大區(qū)域的信號檢測，采用CMOS 陣列采集信號是一個技術(shù)選擇。拍照檢測系統(tǒng)硬件整體設(shè)計如圖3 所示。

圖3 系統(tǒng)硬件整體設(shè)計

2.3 系統(tǒng)軟件設(shè)計

樹莓派開發(fā)系統(tǒng)基于Linux 操作系統(tǒng)，本系統(tǒng)軟件使用Python 語言開發(fā)，調(diào)用了OpenCV 軟件庫完成樹莓派攝像頭實時拍照應(yīng)用。系統(tǒng)軟件設(shè)計的工作流程為在系統(tǒng)上電后首先對系統(tǒng)進(jìn)行初始化工作，接著進(jìn)入試紙條類型判別程序，當(dāng)NFC 芯片接收器檢測到試紙條上的不同線圈時，就會分別進(jìn)入相應(yīng)的檢測程序，系統(tǒng)拍下試紙條相應(yīng)區(qū)域的照片后，對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，將最終檢測結(jié)果輸出。在進(jìn)行葡萄糖試紙條的數(shù)據(jù)分析處理時，用到的最關(guān)鍵的比色分析算法為分別檢測出試紙條白色背景區(qū)域和顏色反應(yīng)區(qū)域的RGB 值，然后計算出背景的B 值減去反應(yīng)區(qū)域的B 值為a，背景的G 值減去反應(yīng)區(qū)域的G 值為b，將計算出的（a—b）的值與濃度進(jìn)行匹配。要讓系統(tǒng)的各個功能模塊互相協(xié)作實現(xiàn)檢測任務(wù)，需要對其行為進(jìn)行安排，根據(jù)檢測任務(wù)的需求，設(shè)計出整體的程序流程圖如圖4所示，使得各個功能模塊可以按照設(shè)計好的邏輯順序?qū)崿F(xiàn)所需功能。其中根據(jù)比色分析算法設(shè)計了摳背景模塊，防止程序誤判斷設(shè)計了防干擾多次確認(rèn)模塊。

圖4 主程序結(jié)構(gòu)流程圖

2.4 顏色采集效果的評估

為了測試儀器拍照功能是否能夠穩(wěn)定且一致，首先用儀器連續(xù)拍攝了10 張位置固定的標(biāo)準(zhǔn)色塊的照片（圖5（a）），并觀察其RGB 值是否有較大的波動。通過照片和RGB 值數(shù)據(jù)可以看出，搭建的儀器可以穩(wěn)定輸出圖像，同一個RGB 值的圖片差異性較?。▓D5（b）），因此利用該儀器獲得定量數(shù)據(jù)的可行性很高。

圖5 重復(fù)性實驗結(jié)果圖

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

為了獲得準(zhǔn)確和可重復(fù)的檢測結(jié)果，獲得高質(zhì)量的圖像是前提。分辨率為800 萬像素的樹莓派攝像頭滿足了這種需求。通過分析在穩(wěn)定的照明條件下獲得的拍攝照片（圖6）發(fā)現(xiàn)，血糖濃度與各個濃度下的試紙條顏色強(qiáng)度之間存在明顯的相關(guān)性。

檢測葡萄糖時，由于存在攝像頭拍照時的環(huán)境干擾等因素，選擇通過對同一試紙條進(jìn)行連續(xù)6 次拍照來獲得平均信號來降低系統(tǒng)性誤差。通過重復(fù)實驗發(fā)現(xiàn)，試紙條背景區(qū)域的顏色值與檢測區(qū)域中的顏色值波動有較高關(guān)聯(lián)性（圖6（a）），因此通過背景區(qū)域的顏色通道與檢測區(qū)域的顏色通道相計算可有效提高穩(wěn)定性。如圖6（b）所示，檢測區(qū)域中的RGB 通道值與背景板區(qū)域的RGB 通道值與血糖濃度呈現(xiàn)一定的相關(guān)性，通過比較幾種歸一化的方法，最終選擇了相對誤差較小的計算數(shù)據(jù)（（b—t）B—（b—t）G）來繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。如圖6（c）所示，相關(guān)計算的顏色值與葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度的關(guān)系具有良好的非線性相關(guān)性，R2為0.994 9（圖6（c））。人體正常的血糖濃度范圍為：3.9~6.1 mmol/L，該檢測系統(tǒng)的檢測范圍（1~12 mmol/L）覆蓋了正常的血糖范圍，因此可檢測異常血糖的需要。該實驗初步驗證了本論文所構(gòu)建的系統(tǒng)檢測葡萄糖濃度的可行性。

圖6 葡萄糖重復(fù)性實驗及標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.6 葡萄糖試紙條的檢測

為了進(jìn)一步評估構(gòu)建的分析儀的實用性，測試了血清樣本中的葡萄糖含量，并將結(jié)果和標(biāo)準(zhǔn)吸光光度法的儀器測量出的結(jié)果進(jìn)行比較。檢測葡萄糖時，在葡萄糖檢測條中加入2 μL 待測樣品，試紙滴加血樣后30~60 s 中內(nèi)，將試紙放入對應(yīng)的適配器，然后插入檢測儀中讀取結(jié)果，如圖7（a）所示。通過檢測16 組樣品，自研分析儀的檢測結(jié)果與商用化羅氏血糖儀的檢測結(jié)果進(jìn)行比對。2 種檢測方法獲得的結(jié)果如圖7（b）所示，2 組數(shù)據(jù)的相關(guān)性非常好。兩組結(jié)果的線性回歸關(guān)系為y=0.693 45+0.856 58x，相關(guān)系數(shù)R2=0.951 2。當(dāng)然，該系統(tǒng)獲得的實驗誤差（如圖7（c）所示）略高于羅氏血糖儀測量的誤差，表明基于RGB 通道（0 到255）檢測血糖濃度的方法還存在改進(jìn)空間，但已經(jīng)初步滿足血糖檢測的實際需要。見表1。

圖7 葡萄糖檢測圖

表1 葡萄糖濃度檢測的重復(fù)性（N=6）

2.7 腸毒素免疫試紙條的檢測

本論文所開發(fā)通用型分析儀的另一個應(yīng)用領(lǐng)域即為免疫檢測。擬利用該分析儀獲取免疫試紙條的T 線信號值，用于直接定性判讀或半定量分析。

該測試的檢測對象為用于金黃色葡萄球菌分泌的腸毒素的側(cè)向流免疫檢測試紙條，該試紙條可檢測金黃色葡萄球菌產(chǎn)生的腸毒素A、B、C、D、E 的檢測。測試時，我們?nèi)?00 μL 腸毒素溶液與100 μL PBS 緩沖液混合搖勻，制備成待檢液，吸取200 μL 待檢液至試劑盒里的金標(biāo)微孔中充分混勻，室溫孵育8 min 后，將檢測條置于試紙條卡盒中，儀器將自動進(jìn)行判別檢測類型，并通過判斷灰度值閾值讀取檢測線RGB 數(shù)據(jù)，并給出最終的判讀結(jié)果（圖8）。

圖8 金黃色葡萄球菌腸毒素檢測條檢測結(jié)果

3 結(jié)束語

本文設(shè)計了一種以Raspberry Pi 為運算、控制核心，以pi camera 來拍照，以PN532 NFC 芯片來讀取試紙條數(shù)據(jù)類型的通用型生物、免疫比色分析儀。該分析儀已經(jīng)被成功應(yīng)用于血糖生化檢測和腸毒素免疫檢測，理論上也具備實現(xiàn)其他類似的生化或免疫檢測的可行性。其中，對于血糖的檢測限為0.64 mmol/L，低于正常血糖范圍（3.9~6.1 mmol/L）。這種基于比色檢測的通用型分析儀極大地簡化了即時檢測對于硬件設(shè)備的需求，可進(jìn)一步發(fā)展來適配多種類型試紙條的定量或定性檢測。該分析儀結(jié)構(gòu)簡單、體積小巧和成本低，非常符合即時檢測的需要。

本論文所構(gòu)建的系統(tǒng)及初步測試結(jié)果為后續(xù)研發(fā)更符合實際應(yīng)用需要的檢測設(shè)備奠定了一定的基礎(chǔ)。該分析儀在應(yīng)用于實際檢測前還有很多需要改進(jìn)的地方，如數(shù)據(jù)采集和數(shù)據(jù)處理的算法還有優(yōu)化空間；檢測硬件還有提升空間，如采用CMOS 陣列來達(dá)到更大視場范圍內(nèi)的多區(qū)域并行檢測，以提升檢測通量。