馬貴紅，賴龍昕，李蝶，馮穎琳，李筱，張志清，李樹紅，王彩霞，顧毅，馬翼，李美良*

1(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，四川 雅安，625014)2(綿陽鐘溝生態(tài)農(nóng)業(yè)科技有限公司，四川 綿陽，621000)3(四川潤兆漁業(yè)有限公司，四川 雅安，625000)

鐵蛋白是一種在生物體內(nèi)廣泛存在的水溶性貯鐵和解毒蛋白[1]，由蛋白質(zhì)外殼和鐵核兩部分組成。鐵核的主要成分是非均勻性磷酸鹽和鐵的復(fù)合物[2]，其最高可貯存4 500個(gè)鐵原子[3]。蛋白外殼是由24個(gè)亞基組成的呈4-3-2對(duì)稱的八面體結(jié)構(gòu)[4]，內(nèi)外直徑分別為8和12 nm[5]。蛋白外殼上存在的8條3倍和6條4倍(孔徑約為0.3～0.5 nm)通道，主要是用于鐵內(nèi)核與外部環(huán)境的物質(zhì)交換[6]。鐵蛋白的主要功能是維持生物體內(nèi)的鐵代謝平衡[7-8]及通過清除鐵介導(dǎo)的自由基來抑制Fenton反應(yīng)，從而保護(hù)細(xì)胞免受因各種環(huán)境脅迫而導(dǎo)致的細(xì)胞氧化性損傷[9-10]。不含礦化鐵核的鐵蛋白稱為脫鐵鐵蛋白[11]。脫鐵鐵蛋白可以通過還原釋放機(jī)制將鐵核釋放到外界環(huán)境或者由工程菌如大腸桿菌直接生產(chǎn)[12-13]。研究表明，上述2種脫鐵鐵蛋白均具有自組裝活性，即鐵蛋白在極酸/堿(pH≤2.0或pH≥10.0)條件下，蛋白殼亞基之間會(huì)發(fā)生解離，將pH值調(diào)至7.0左右時(shí)，解離的亞基又能自組裝成完整的鐵蛋白外殼。另外，由于良好的均一性、單分散性、熱穩(wěn)定性和生物相容性等，使其常用作智能的納米載體，用于藥物的遞送以及營養(yǎng)成分的封裝。

天然鐵蛋白本身可以作為一種吸收利用率極高的生物補(bǔ)鐵源。此外，一些學(xué)者基于鐵蛋白的可逆組裝特性以及環(huán)境響應(yīng)的通道“門控”特性(即擴(kuò)大鐵蛋白外殼上的通道)成功包埋了蘆丁、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、姜黃素、綠原酸和蝦青素等食品生物活性物質(zhì)，顯著提高了活性物質(zhì)的穩(wěn)定性、生物利用度及水溶性等，擴(kuò)大了鐵蛋白在食品工業(yè)以及食品營養(yǎng)領(lǐng)域的應(yīng)用[14]。不同于人重鏈鐵蛋白(human H-chain ferritin，HuHF)，日本囊對(duì)蝦鐵蛋白(Marsupenaeusjaponicusferritin，MjF)是一種潛在的可以去除污染食品系統(tǒng)中的重金屬離子的食物源蛋白，主要是由于2種鐵蛋白的半胱氨酸(Cys)殘基位置不同：HuHF的Cys殘基位于蛋白殼外，而MjF的Cys殘基位于蛋白殼內(nèi)。MjF能更好地結(jié)合鎘(Cd2+)及汞(Hg2+)等重金屬離子。因此，使用重組日本囊對(duì)蝦鐵蛋白(recombinantMarsupenaeusjaponicusferritin，rMjF)工程菌大批量純化重組蝦鐵蛋白是十分必要的。

對(duì)于鐵蛋白，常用柱層析進(jìn)行進(jìn)一步分離和純化，如張晨曦等[15]和丁炳文等[16]通過Sephacryl S-500(300)凝膠過濾層析及DEAE陰離子交換層析純化鐵蛋白。由于凝膠過濾層析、陰離子交換層析、親和層析等柱層析技術(shù)耗時(shí)長、過程繁瑣、成本高，因此很大程度上限制了其批量化生產(chǎn)。硫酸銨的水溶液具有極高的離子強(qiáng)度，可以使蛋白質(zhì)與H2O隔絕，降低蛋白質(zhì)的溶解度[17]。蛋白分子間的疏水作用會(huì)使其相互聚集形成沉淀，從而促使蛋白和其他雜質(zhì)(如糖類等)分離[18-19]。此外硫酸銨還具有易溶解、價(jià)格低、純物質(zhì)易獲得、對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定和飽和溶液的密度相對(duì)較低等優(yōu)點(diǎn)[20]。飽和硫酸銨鹽析是重組鐵蛋白分離純化的一個(gè)重要步驟。本研究對(duì)重組蝦鐵蛋白的粗提取液進(jìn)行20%～40%飽和度的(下同)硫酸銨處理(先采用20%飽和硫酸銨處理，收集上清液后將硫酸銨的飽和度提升至40%，收集沉淀復(fù)溶)后并結(jié)合透析、超濾等技術(shù)，成功制備出純的rMjF，為rMjF的應(yīng)用研究提供一定的參考價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

含日本囊對(duì)蝦(Marsupenaeusjaponicus)鐵蛋白質(zhì)粒(pET-3a)的大腸桿菌[BL21(DE-3)]由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)趙廣華老師實(shí)驗(yàn)團(tuán)隊(duì)于2019年10月提供，于-80 ℃冰箱中凍存保藏。

1.2 儀器與設(shè)備

Scientz-ⅡD超聲細(xì)胞破碎儀，寧波新芝生物科技股份有限公司；高速冷凍離心機(jī)，長沙湘智離心機(jī)儀器有限公司；高溫高壓滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械有限公司；-80℃超低溫冰箱，美國Thermo公司；SW-CJ1F超凈工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司；電泳儀、垂直電泳槽、凝膠成像系統(tǒng)，美國Bio-Rad公司；JEM 1200EX透射電子顯微鏡(transmission electron microscope，TEM)，日本JEOL公司；Zetasizer Nano ZS納米粒度儀，英國Malvern公司；YC-2層析冷柜，北京博醫(yī)康公司；Stirred Cell 8050/8003超濾裝置，美國Minipore公司；CPA225D十萬分之一電子天平，德國Sartorius公司；Nicoletl iS10傅里葉變換紅外光譜儀，美國Thermo公司；ULUP-IV-10T超純水儀，四川優(yōu)普超純科技有限公司；Vivaflow 200超濾膜包，德國Sartorius公司；TY-80A水平脫色搖床，江蘇科析儀器有限公司；WD-9406膠片觀測(cè)燈，北京六一儀器廠；THZ-98AB恒溫震蕩培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 含rMjF大腸桿菌的培養(yǎng)與破碎

參考DENG等[21]和MASUDA等[22]的方法，做一些改動(dòng)。將凍存于-80 ℃的條件下的菌種活化，并將活化后的菌種接種于含氨芐青霉素(50.0 mg/mL)LB培養(yǎng)基(由超純水配制)中。在37 ℃，180 r/min，pH=7.5的條件下，培養(yǎng)至OD600為0.6左右，采用200 μmol/L 異丙基β-D-硫代半乳糖苷誘導(dǎo)表達(dá)8 h，在溫度為4 ℃，轉(zhuǎn)速為10 000 r/min的條件下，離心10 min收集菌體。將收集的菌體再次懸于超純水中進(jìn)行超聲細(xì)胞破碎(功率250 W，超聲破碎30 min，開2 s，關(guān)3 s)，至菌液完全澄清。

1.3.2 rMjF的分離與純化

將破碎液進(jìn)行加熱處理(65 ℃，10 min)，待熱敏蛋白變性后，離心(10 000 r/min，4 ℃，5 min)，收集上清液進(jìn)行飽和硫酸銨處理。分別采用20%～40%(先采用20%飽和硫酸銨處理，收集上清液后將硫酸銨的飽和度提升至40%，收集沉淀用水溶解)、20%～60%(先采用20%飽和硫酸銨處理，收集上清液后將硫酸銨的飽和度提升至60%，收集沉淀用水溶解)和20%～40%～60%(將采用20%～40%飽和硫酸銨收集的沉淀用60%飽和硫酸銨溶液溶解)飽和硫酸銨復(fù)合處理rMjF。然后，將含目標(biāo)蛋白的硫酸銨溶液置于超純水中進(jìn)行透析(透析袋截留分子質(zhì)量為300 kDa，每隔8 h更換1次透析液，共進(jìn)行3次)除去硫酸銨。將透析后的液體經(jīng)0.22 μm(聚醚砜材質(zhì))的濾膜進(jìn)一步澄清，然后用膜包(截留分子質(zhì)量50 kDa)超濾濃縮，最后進(jìn)行冷凍干燥保存。

1.3.3 純度鑒定

參考劉文營[12]的方法，并做出一定的改進(jìn)。采用十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)(濃縮膠的濃度為5%，分離膠的濃度為12%，80 V運(yùn)行20 min后轉(zhuǎn)為120 V)測(cè)定rMjF的純度及其亞基的分子質(zhì)量。

1.3.4 粒徑的測(cè)定

參考丁炳文等[16]的方法，進(jìn)行rMjF的粒徑測(cè)定。使用馬爾文粒度儀(Zetasizer Nano ZS；美國賽默飛)在25 ℃下進(jìn)行粒徑測(cè)試。

1.2.5 紫外掃描測(cè)定

參考張晨曦等[15]的方法，進(jìn)行rMjF的紫外光譜表征。使用紫外掃描儀掃描220 ～400 nm下的紫外-可見光光譜。

1.3.6 納米結(jié)構(gòu)觀測(cè)

參考張晨曦等[15]的方法，進(jìn)行rMjF的納米結(jié)構(gòu)觀察。純化樣品用20.0 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH=7.5)稀釋至一定濃度后，將其放置于碳涂層銅柵上，用20 g/L醋酸鈾酰染色3 min，透射電子顯微鏡在80 kV處對(duì)其進(jìn)行成像。

1.3.7 傅里葉-紅外光譜對(duì)rMjF二級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定

參考丁炳文等[16]的方法，進(jìn)行rMjF的紅外光譜測(cè)定。將純化的鐵蛋白溶液進(jìn)行冷凍干燥，然后與充分干燥的KBr混合研磨后制片，以充分干燥的KBr為空白背景。具體參數(shù)設(shè)定如下：紅外光譜儀分辨率為4 cm-1，掃描次數(shù)為32次。之后結(jié)合PeakFit v 4.12軟件對(duì)蛋白質(zhì)的特征吸收帶酰胺Ⅰ帶進(jìn)行rMjF二級(jí)結(jié)構(gòu)分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)樣品做3次平行，數(shù)據(jù)結(jié)果取平均值，之后使用Origin 9.0軟件進(jìn)行圖表制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 rMjF的分離純化

鐵蛋白是一種耐熱蛋白，其受熱展開的過渡溫度(Tm)約為70 ℃，遠(yuǎn)高于一般蛋白質(zhì)的Tm(50 ℃以下)，且有研究表明鐵蛋白外殼可以在80 ℃的高溫下持續(xù)10 min不變性[23]。所以本實(shí)驗(yàn)通過65 ℃加熱10 min 處理rMjF破碎液去除部分不耐熱雜蛋白，之后進(jìn)行飽和硫酸銨處理。鐵蛋白經(jīng)過飽和硫酸銨處理后，存在于20%飽和度的硫酸銨的上清液中，同時(shí)存在于60%飽和度的硫酸銨的沉淀中[4,15]?；诖耍緦?shí)驗(yàn)將熱處理后的rMjF粗提液上清液均分為3份，分別緩慢添加硫酸銨固體，使溶液中硫酸銨的最終飽和度達(dá)到20%、40%和60%，靜置30 min后，分別取其上清液和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳分析。

由圖1可知，rMjF由分子質(zhì)量約為20 kDa的單亞基組成，與WANG等[24]對(duì)非重組的MjF的亞基分子質(zhì)量基本一致。經(jīng)過飽和度20%、40%和60%的硫酸銨處理后，rMjF分別存在于飽和硫酸銨溶液的上清液、沉淀和沉淀中，與前人的研究基本一致[4,15]。雜蛋白存在于經(jīng)20%飽和硫酸銨處理后的沉淀中，這可能是由于rMjF的硫酸銨溶解度曲線符合典型的蛋白質(zhì)的硫酸銨溶解度曲線[25]，即rMjF可以在低飽和度的硫酸銨溶液中溶解度增加(鹽溶)，在高飽和度的硫酸銨溶液中溶解度降低(鹽析)。所以可以采用20%飽和硫酸銨處理去除沉淀中部分雜蛋白，然后通過提升其上清液(硫酸銨的飽和度為20%)的飽和度進(jìn)一步提純r(jià)MjF。

圖1 不同飽和度的硫酸銨處理rMjF粗提物的SDS-PAGE電泳圖Fig.1 SDS-PAGE electrophoresis of rMjF crude extract treated with ammonium sulfate at different saturation注：泳道1-20%飽和硫酸銨處理的上清液；泳道2-20%飽和硫酸銨處理的沉淀；泳道3-40%飽和硫酸銨處理的上清液；泳道4-40%飽和硫酸銨處理的沉淀；泳道5-60%飽和硫酸銨處理的上清液；泳道6-60%飽和硫酸銨處理的沉淀

采用考馬斯亮藍(lán)測(cè)定經(jīng)60%、20%～40%、20%～60%和20%～40%～60%飽和硫酸銨處理的粗提液中蛋白濃度，與熱處理后的粗提液對(duì)比，蛋白濃度分別減少了29.67%、49.7%、36.94%和48.81%。結(jié)果表明，rMjF粗提液經(jīng)過飽和硫酸銨復(fù)合處理會(huì)大大降低雜蛋白的含量。凌雪萍等[26]通過采用50%～80%的飽和硫酸銨處理乳鐵蛋白也得到了相同的結(jié)論。由圖2可知，粗提上清液經(jīng)20%～40%、20%～60%和20%～40%～60%飽和硫酸銨處理后，結(jié)合透析、超濾等技術(shù)，三者rMjF純度都很高，即經(jīng)過飽和硫酸銨復(fù)合處理結(jié)合非柱層析技術(shù)可以有效純化rMjF。PALOMBARINI等[4]也通過20%～40%飽和硫酸銨處理結(jié)合其他非柱層析技術(shù)成功純化了重組人重鏈鐵蛋白。

圖2 梯度飽和硫酸銨處理rMjF粗提物后的SDS-PAGE電泳圖Fig.2 SDS-PAGE of rMjF crude extract treated with gradient saturated ammonium sulfate注：泳道1-粗提液經(jīng)20%～40%飽和硫酸銨雙重處理后，經(jīng)透析、超濾后的蛋白質(zhì)；泳道2-粗提液經(jīng)20%～60%飽和硫酸銨雙重處理后，經(jīng)透析、超濾的蛋白質(zhì)；泳道3-粗提液經(jīng)20%～40%～60%飽和硫酸銨的三重處理后，經(jīng)透析、超濾的蛋白質(zhì)

2.2 不同飽和度硫酸銨處理后的rMjF納米粒徑表征

由圖3可知，經(jīng)過20%～40%和20%～60%飽和硫酸銨復(fù)合處理提純的rMjF與傳統(tǒng)層析(60%硫酸銨處理結(jié)合柱層析技術(shù))的rMjF體積分布表明，rMjF球體的粒徑約為12 nm，這與鐵蛋白外殼徑12 nm 基本一致。但與傳統(tǒng)的層析處理相比，經(jīng)20%～40%和20%～60%飽和硫酸銨復(fù)合處理提純的rMjF會(huì)發(fā)生一定的團(tuán)聚現(xiàn)象。由圖3的插圖可以看出,經(jīng)20%～40%～60%飽和硫酸銨的三重處理提純的rMjF團(tuán)聚現(xiàn)象更嚴(yán)重。然而，目前對(duì)于硫酸銨復(fù)合處理引起鐵蛋白團(tuán)聚的具體原因尚不清楚，需要之后進(jìn)一步研究。為了減少鐵蛋白的團(tuán)聚，本實(shí)驗(yàn)對(duì)粗提液采用20%～40%飽和硫酸銨雙重處理提純的rMjF進(jìn)行表征。

圖3 不同飽和度硫酸銨處理后的蛋白粒徑圖Fig.3 Protein particle size diagram after ammonium sulfate treatment with different saturation注：右上角的插圖為粗提液經(jīng)20%～40%～60%飽和硫酸銨的三重處理提純的蛋白粒徑圖

2.3 rMjF納米結(jié)構(gòu)觀察

由圖4可知，傳統(tǒng)層析與未層析(20%～40%飽和硫酸銨處理)純化的rMjF均具有較好的分散性及其粒徑的均一性。蛋白腔內(nèi)存在黑色的鈾核，這主要是因?yàn)閞MjF是脫鐵鐵蛋白，經(jīng)乙酸鈾染色后，乙酸鈾會(huì)通過其外殼上的通道進(jìn)入蛋白內(nèi)部使腔內(nèi)呈現(xiàn)黑色[27]。

a-層析制備的rMjF；b-非層析制備的rMjF圖4 純化后rMjF的TEM圖Fig.4 TEM images of purified rMjF

2.4 rMjF的紫外光譜分析

利用紫外掃描層析與未層析(20%～40%飽和硫酸銨處理)純化的rMjF。由圖5可知，rMjF的最大吸收峰位于280 nm，這主要是由于蛋白質(zhì)分子中存在含共軛雙鍵的氨基酸(如酪氨酸、色氨酸等芳香族氨基酸)，這些氨基酸在280 nm處有吸收峰。脫鐵之前的鐵蛋白由于鐵核的存在會(huì)干擾光譜的吸收沒有吸收峰[12]，此結(jié)果進(jìn)一步表明rMjF是脫鐵鐵蛋白。

圖5 rMjF的紫外掃描圖Fig.5 UV scan of rMjF

2.5 紅外光譜分析rMjF二級(jí)結(jié)構(gòu)

圖6 rMjF的紅外光譜圖Fig.6 Infrared spectra of rMjF

圖7 rMjF紅外光譜酰胺Ⅰ帶擬合圖Fig.7 Infrared spectra rMjF amide Ⅰ bands fitting figure

表1 酰胺Ⅰ帶擬合峰對(duì)應(yīng)的二級(jí)結(jié)構(gòu)[31]Table 1 Amide Ⅰ bands corresponding to the secondary structure

表2 紅外光譜酰胺Ⅰ帶擬合數(shù)據(jù)Table 2 Fitting data of amide I bands of infrared spectrum

3 結(jié)論

本研究對(duì)經(jīng)過熱處理(65 ℃，10 min)后rMjF的粗提液進(jìn)行20%～40%飽和硫酸銨處理，并結(jié)合透析、超濾等非柱層析技術(shù)，成功制備出純的rMjF。相較于離子交換層析等柱層析技術(shù)，本實(shí)驗(yàn)中rMjF分離純化技術(shù)成本較低,易于操作,適用于工業(yè)化大批量生產(chǎn),未來可考慮將rMjF作為納米載體裝載生物活性成分或者將其作為食品原料中重金屬離子的吸附蛋白。大批量生產(chǎn)rMjF具有重要意義和廣闊的開發(fā)前景。