李華祥，石瑀，羅志珊，高亞軍，王娟娟，肖玉娟，袁磊，饒勝其，楊振泉*

1(揚(yáng)州大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州，225127)2(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫，214122)3(廈門(mén)華廈學(xué)院 環(huán)境與公共健康學(xué)院，福建 廈門(mén)，361024)

牛樟樹(shù)(CinnamomumkanehiraeHay)屬于樟目、樟科、樟屬(Cinnamomum)，是一種常綠闊葉喬木，也是我國(guó)臺(tái)灣地區(qū)特有的樹(shù)種，同時(shí)也是樟芝的唯一天然宿主[1-2]。樟芝(Antrodiacamphorata，Antrodiacinnamomea或Taiwanofunguscamphoratus)，又名牛樟芝或牛樟菇，是一種食藥兩用真菌，屬于擔(dān)子菌門(mén)(Basidiomycota)、多孔菌科(Polyporaceae)、薄孔菌屬(Antrodia)，具有解酒、保肝、抗炎、抗癌、抗氧化、抗病毒、抗腫瘤、緩解疲勞、調(diào)節(jié)免疫等多種生物活性[3-6]，已成為目前食藥用菌研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一。出眾的生物活性使樟芝有著極大的市場(chǎng)需求，但野生樟芝子實(shí)體數(shù)量稀少、價(jià)格昂貴[7]。因此，大規(guī)模人工培養(yǎng)牛樟芝顯得尤為必要。其中，深層發(fā)酵技術(shù)由于具有周期短、效率高、成本低、易于規(guī)?；a(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)，已成為目前樟芝最主要的人工培養(yǎng)方式[8-10]。本文作者攻讀博士學(xué)位期間所在課題組首次報(bào)道了樟芝在深層發(fā)酵過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生無(wú)性節(jié)孢子的現(xiàn)象，并優(yōu)化了其產(chǎn)孢條件[11]。隨后，又發(fā)現(xiàn)以樟芝無(wú)性節(jié)孢子作為接種物進(jìn)行深層發(fā)酵，可有效縮短樟芝發(fā)酵周期，提高發(fā)酵過(guò)程可控性及活性物質(zhì)生產(chǎn)效率，并依此建立了基于無(wú)性孢子接種的樟芝快速發(fā)酵工藝[12-13]。

但是，樟芝深層發(fā)酵工藝在生產(chǎn)過(guò)程中仍然存在一些問(wèn)題，如作為種子的樟芝無(wú)性孢子產(chǎn)量較低，導(dǎo)致種子制備時(shí)間長(zhǎng)、成本高，限制了樟芝深層發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)效率[7,14]。此外，樟芝活性物質(zhì)產(chǎn)量低也是樟芝深層發(fā)酵生產(chǎn)效益的主要限制因素[14]。因此，提高樟芝深層發(fā)酵產(chǎn)孢量及活性物質(zhì)產(chǎn)量，是進(jìn)一步提高樟芝深層發(fā)酵工業(yè)化生產(chǎn)效率、降低生產(chǎn)成本的關(guān)鍵所在。目前，提高樟芝深層發(fā)酵產(chǎn)孢量及活性物質(zhì)產(chǎn)量的方法主要是優(yōu)化發(fā)酵條件(包括培養(yǎng)基組成及發(fā)酵工藝)及添加外源物質(zhì)[7]。如GENG等[11]以產(chǎn)孢量為檢測(cè)指標(biāo)，通過(guò)優(yōu)化培養(yǎng)基中的碳源、氮源及碳氮比，明確了樟芝只有在營(yíng)養(yǎng)匱乏的高碳氮比培養(yǎng)基中才能大量產(chǎn)孢，而在營(yíng)養(yǎng)豐富的低碳氮比培養(yǎng)基中幾乎不產(chǎn)孢；LU等[12]以總?cè)飘a(chǎn)量為檢測(cè)指標(biāo)，通過(guò)優(yōu)化培養(yǎng)基中碳源和氮源的種類(lèi)及含量，發(fā)現(xiàn)樟芝在營(yíng)養(yǎng)匱乏的培養(yǎng)基中不適于積累活性物質(zhì)。隨后，LI等[14]在綜合考慮產(chǎn)孢及產(chǎn)活性物質(zhì)的前體下，通過(guò)進(jìn)一步優(yōu)化培養(yǎng)基配方及發(fā)酵工藝，建立了一種基于無(wú)性孢子接種的樟芝深層循環(huán)發(fā)酵工藝，顯著縮短了生產(chǎn)周期，提高了樟芝深層發(fā)酵活性物質(zhì)的生產(chǎn)效率。

此外SHEN等[15]研究了在培養(yǎng)基中添加牛樟、沉水樟及香樟等不同樟樹(shù)水提物對(duì)樟芝胞內(nèi)多糖抗炎活性的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)添加沉水樟(Cinnamomummicranthum)、土肉桂(Cinnamomumosmophloeum)及蘭嶼肉桂(Cinnamomumkotoense)水提物可增加樟芝胞內(nèi)多糖的抗炎活性；CHANG等[16]研究了在培養(yǎng)基中添加牛樟樹(shù)精油、香樟樹(shù)精油、香杉精油及紅檜精油對(duì)牛樟芝菌絲體生長(zhǎng)及子實(shí)體形成的影響，發(fā)現(xiàn)牛樟樹(shù)精油能夠有效地促進(jìn)牛樟芝菌絲體生長(zhǎng)；LU等[17]研究了在培養(yǎng)基中添加香樟樹(shù)的水提取物、甲醇提取物、石油醚提取物及乙酸乙酯提取物對(duì)樟芝產(chǎn)三萜的影響，結(jié)果表明香樟樹(shù)水提物可促進(jìn)樟芝菌絲生長(zhǎng)，而香樟樹(shù)石油醚提取物可顯著增加樟芝總?cè)飘a(chǎn)量；李一凡等[18]研究了平皿培養(yǎng)時(shí)在瓊脂培養(yǎng)基中添加生長(zhǎng)素、細(xì)胞分裂素等植物激素及木質(zhì)素對(duì)樟芝菌絲體生長(zhǎng)的影響，發(fā)現(xiàn)牛樟樹(shù)粉末對(duì)樟芝菌絲體的生長(zhǎng)有一定的促進(jìn)作用，但直接添加牛樟樹(shù)粉末不利于樟芝菌絲體的分離，故此法不適用于深層發(fā)酵。

上述研究結(jié)果表明樟樹(shù)中確實(shí)含有對(duì)樟芝生長(zhǎng)及產(chǎn)活性物質(zhì)有利的化合物，但前人多以對(duì)樟芝菌絲生長(zhǎng)及活性物質(zhì)的影響為研究目標(biāo)，所添加的物質(zhì)也多為樟屬(Cinnamomum)中其他樹(shù)種的提取物。關(guān)于在深層發(fā)酵培養(yǎng)基中添加牛樟樹(shù)提取物對(duì)樟芝無(wú)性產(chǎn)孢影響的研究，目前鮮見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。因此，本文首先比較了在深層發(fā)酵培養(yǎng)基中添加牛樟樹(shù)不同溶劑(甲醇、乙酸乙酯、石油醚及水)提取物對(duì)樟芝無(wú)性產(chǎn)孢的影響，明確能顯著促進(jìn)樟芝無(wú)性產(chǎn)孢的牛樟樹(shù)提取物組分，再考察該提取物對(duì)樟芝生長(zhǎng)及產(chǎn)活性物質(zhì)的影響，最終獲得既能顯著促進(jìn)樟芝產(chǎn)孢，又能促進(jìn)樟芝活性物質(zhì)積累的牛樟樹(shù)提取物，為提高樟芝深層發(fā)酵種子制備效率及工業(yè)化生產(chǎn)效益提供理論依據(jù)并奠定實(shí)踐基礎(chǔ)，具有較大的開(kāi)發(fā)價(jià)值及良好的應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

樟芝(Antrodiacamphorate)菌株購(gòu)自“美國(guó)菌種保藏中心”(American Type Culture Collection，ATCC)，編號(hào)為ATCC 200183，由江南大學(xué)生物工程學(xué)院許正宏教授惠贈(zèng)，現(xiàn)保存于揚(yáng)州大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院食品微生物應(yīng)用與控制實(shí)驗(yàn)室；牛樟樹(shù)木屑(50年以上樹(shù)齡)，福建皓天生物科技有限公司；PDA培養(yǎng)基，生工生物工程(上海)股份有限公司；葡萄糖、酵母粉、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、鹽酸等常規(guī)試劑，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，純度均為分析純。

R404A高速冷凍離心機(jī)、移液槍/槍頭，Eppendorf(德國(guó))；DHZ-DA 型恒溫?fù)u床，太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；MS-100恒溫金屬浴，杭州奧盛有限公司；pH計(jì)，廈門(mén)開(kāi)普瑞生物科技有限公司；真空冷凍干燥機(jī)(2.5 L)，LABCONACO(美國(guó))；SW-CJ-2F超凈工作臺(tái)，蘇州華宇；LV150 N光學(xué)顯微鏡，日本尼康；MDF-U5386S超低溫冰箱/普通冰箱，SANYO(日本)。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 斜面培養(yǎng)基

本文所用斜面培養(yǎng)基為商用PDA培養(yǎng)基。

1.2.2 種子培養(yǎng)基[19]

葡萄糖20 g/L，酵母粉1 g/L，KH2PO43 g/L，MgSO41.5 g/L，pH 4.5，121 ℃滅菌20 min后，冷卻備用。

1.2.3 發(fā)酵培養(yǎng)基[19]

葡萄糖20 g/L，酵母粉10 g/L，KH2PO43 g/L，MgSO41.5 g/L，pH 4.5，121 ℃滅菌20 min后，冷卻備用。

1.3 牛樟樹(shù)提取物的制備

1.3.1 有機(jī)溶劑提取物

參照文獻(xiàn)[20]的方法并稍作修改。稱取20 g樣品，按料液比1∶20(g∶mL)分別加入甲醇、乙酸乙酯或石油醚，超聲30 min后，振蕩提取3 h，用4層紗布過(guò)濾并收集濾液。重復(fù)上述提取操作3次，將濾液合并后蒸干并稱重。所得干物質(zhì)用適量體積的去離子水復(fù)溶，使得提取物最終質(zhì)量濃度為50 mg/mL(母液)，保存于-20 ℃冰箱中備用。

1.3.2 水提取物

參照文獻(xiàn)[20]的方法并稍作修改。稱取20 g樣品，按料液比1∶20(g∶mL)加入去離子水，90 ℃水浴提取3 h，用4層紗布過(guò)濾并收集濾液。重復(fù)上述提取操作3次，將濾液合并后濃縮烘干并稱重。所得干物質(zhì)用適量體積的去離子水復(fù)溶，使得提取物最終質(zhì)量濃度為50 mg/mL(母液)，保存于-20 ℃冰箱中備用。

1.4 樟芝種子制備

1.4.1 原代種子制備

用接種鏟將培養(yǎng)好的樟芝斜面菌絲體接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中并用轉(zhuǎn)子通過(guò)磁力攪拌打碎，26 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)12～14 d后，發(fā)酵液用4層無(wú)菌紗布過(guò)濾，濾液即為孢子懸浮液，即樟芝原代種子。

1.4.2 發(fā)酵種子制備

將原代種子按1.0×106個(gè)/mL的接種量接入種子培養(yǎng)基中，26 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)10 d后，發(fā)酵液用4層無(wú)菌紗布過(guò)濾，所得濾液即為樟芝發(fā)酵種子，可用于樟芝發(fā)酵生產(chǎn)接種或種子制備發(fā)酵接種。

1.5 樟芝搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)

將樟芝發(fā)酵種子按1.0×106個(gè)/mL的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，26 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)10～12 d。

1.6 牛樟樹(shù)提取物的添加

將1.3中配制好的牛樟樹(shù)提取物母液用直徑0.45 μm的微孔濾膜過(guò)濾除菌后，根據(jù)所需添加濃度吸取相應(yīng)體積的牛樟樹(shù)提取物加入滅菌冷卻后的種子培養(yǎng)基中，搖勻，再按1.4.2中的方法進(jìn)行接種及發(fā)酵培養(yǎng)即可。以添加相同體積去離子水為對(duì)照組。

1.7 檢測(cè)方法

1.7.1 生物量的檢測(cè)

將發(fā)酵培養(yǎng)物用4層紗布過(guò)濾，收集濾渣，75 ℃烘干至恒重，稱重并計(jì)算生物量。

1.7.2 孢子數(shù)的檢測(cè)

將發(fā)酵培養(yǎng)物用4層紗布過(guò)濾，收集濾液，吸取50 μm濾液并用血球計(jì)數(shù)板在顯微鏡下計(jì)數(shù)，并計(jì)算產(chǎn)孢量。

1.7.3 胞內(nèi)多糖的檢測(cè)

按照文獻(xiàn)[19]的方法采用稱重法測(cè)定樟芝胞內(nèi)多糖含量。即準(zhǔn)確稱取干燥并粉碎后的菌粉2 g于10 mL比色管中，加10 mL去離子水，95 ℃水浴提取1 h，重復(fù)提取3次，將上清液轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中，濃縮至10 mL后加30 mL無(wú)水乙醇4 ℃靜置過(guò)夜，8 000 r/min，離心10 min，將沉淀75 ℃烘干后稱重，即為粗多糖的質(zhì)量。

1.7.4 總?cè)坪康臋z測(cè)

按照文獻(xiàn)[19]的方法采用香草醛-高氯酸法測(cè)定樟芝菌絲體中總?cè)坪俊＜聪纫札R墩果酸為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再精確稱取干燥并粉碎后的菌粉100 mg于2 mL EP管中，加入1 mL甲醇，50 Hz超聲30 min后振蕩提取1 h，8 000 r/min離心10 min后，吸取上清液100 μL于10 mL具塞試管中，水浴蒸干，加0.3 mL現(xiàn)配制的質(zhì)量濃度為50 g/L的香草醛-冰醋酸溶液和1 mL的高氯酸，60 ℃反應(yīng)20 min，冰水冷卻，加10 mL冰醋酸，搖勻，在550 nm下測(cè)定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算總?cè)频暮俊?/p>

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析

本文所有實(shí)驗(yàn)組均設(shè)置至少3個(gè)生物重復(fù)，所有數(shù)據(jù)均采用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”的形式展示，用Origin Pro 8.0軟件進(jìn)行繪圖，用SPSS PASW Statistics 18.0軟件進(jìn)行差異顯著性分析，差異顯著水平為P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同牛樟樹(shù)提取物對(duì)樟芝深層發(fā)酵無(wú)性產(chǎn)孢的影響

為了考察不同牛樟樹(shù)提物對(duì)樟芝深層發(fā)酵無(wú)性產(chǎn)孢的影響，我們按1.6中的方法在發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加終質(zhì)量濃度為50 μg/mL的牛樟樹(shù)甲醇提取物、乙酸乙酯提取物、石油醚提取物及水提物，并從發(fā)酵第6天開(kāi)始每天取樣測(cè)定產(chǎn)孢量，以不添加任何牛樟樹(shù)提取物組為空白對(duì)照，結(jié)果如圖1所示。

圖1 不同牛樟樹(shù)提取物對(duì)樟芝深層發(fā)酵無(wú)性產(chǎn)孢的影響Fig.1 Effects of different extracts of Cinnamomum kanehirae Hay on sporulation in Antrodia cinnamomea注：“CK”表示空白對(duì)照，即不添加任何牛樟樹(shù)提取物(下同)；所有牛樟樹(shù)提取物的添加質(zhì)量濃度均為50 μg/mL

由圖1可知，4種牛樟樹(shù)提取物中，只有牛樟樹(shù)水提物對(duì)樟芝無(wú)性產(chǎn)孢有顯著促進(jìn)作用，并使樟芝深層發(fā)酵最大產(chǎn)孢量較對(duì)照提高了41.2%；而牛樟樹(shù)有機(jī)溶劑(甲醇、乙酸乙酯、石油醚)提取物對(duì)樟芝無(wú)性產(chǎn)孢則表現(xiàn)為明顯抑制作用，其中尤以牛樟樹(shù)石油醚提取物的抑制作用最為突出。因此，我們選擇牛樟樹(shù)水提物作進(jìn)一步研究。

2.2 不同濃度牛樟樹(shù)水提物對(duì)樟芝深層發(fā)酵無(wú)性產(chǎn)孢的影響

接下來(lái)，我們以產(chǎn)孢量為檢測(cè)指標(biāo)，對(duì)牛樟樹(shù)水提物添加質(zhì)量濃度在20～100 μg/mL進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果如圖2和圖3所示。

由圖2可知，牛樟樹(shù)水提物對(duì)樟芝深層發(fā)酵產(chǎn)孢的影響呈濃度依賴性，且最佳添加質(zhì)量濃度為60 μg/mL；當(dāng)添加質(zhì)量濃度低于60 μg/mL時(shí)，牛樟樹(shù)水提物對(duì)樟芝產(chǎn)孢的促進(jìn)效果隨濃度的增加而增加；當(dāng)添加質(zhì)量濃度高于60 μg/mL時(shí)，牛樟樹(shù)水提物對(duì)樟芝產(chǎn)孢的促進(jìn)效果隨濃度的增加而減少；在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加終質(zhì)量濃度為60 μg/mL的牛樟樹(shù)水提物時(shí)，樟芝最大產(chǎn)孢量可達(dá)76.26×106個(gè)/mL，較不添加牛樟樹(shù)水提物的對(duì)照組提高了58%，效果非常顯著。由圖3可知，在培養(yǎng)基中添加最終質(zhì)量濃度為60 μg/mL的牛樟樹(shù)水提物發(fā)酵所產(chǎn)生樟芝孢子與不添加牛樟樹(shù)水提物的對(duì)照組相比，在形態(tài)上并無(wú)顯著差異，但產(chǎn)孢量(孢子濃度)明顯增加。

圖2 不同濃度的牛樟樹(shù)水提物對(duì)樟芝深層發(fā)酵無(wú)性產(chǎn)孢的影響Fig.2 Effects of different concentrations of water extract of Cinnamomum kanehirae Hay on sporulation for Antrodia cinnamomea in submerged fermentatioin

a-CK；b-60 μg/mL圖3 樟芝深層發(fā)酵所產(chǎn)無(wú)性孢子Fig.3 The asexual spore of Antrodia cinnamomea from submerged fermentatioin注：圖中均為發(fā)酵原液稀釋4倍后，放大640倍(16×40)的光學(xué)顯微鏡照片

此外，從圖2的結(jié)果還可以看出，在此發(fā)酵條件下，所有實(shí)驗(yàn)組產(chǎn)孢量均在發(fā)酵10 d時(shí)達(dá)到最大值。由于本研究的主要目的是提高樟芝深層發(fā)酵的種子制備效率，即為了獲取樟芝無(wú)性孢子。因此，選擇在產(chǎn)孢量達(dá)到最大值時(shí)結(jié)束發(fā)酵并收集孢子最為合理，故后續(xù)相關(guān)的生物量、胞內(nèi)多糖產(chǎn)量及總?cè)飘a(chǎn)量等指標(biāo)，我們均采用發(fā)酵10 d的樟芝菌絲體樣品進(jìn)行測(cè)定。

2.3 添加牛樟樹(shù)水提物對(duì)樟芝深層發(fā)酵產(chǎn)活性物質(zhì)的影響

為了明確牛樟樹(shù)水提物除了促進(jìn)樟芝無(wú)性產(chǎn)孢以外，對(duì)樟芝的生長(zhǎng)及活性物質(zhì)積累是否也有影響，我們對(duì)在培養(yǎng)基中添加了終質(zhì)量濃度為60 μg/mL牛樟樹(shù)水提物且發(fā)酵10 d的樟芝菌絲體樣品的生物量、胞內(nèi)多糖產(chǎn)量及總?cè)飘a(chǎn)量進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果如表1所示。

表1 牛樟樹(shù)水提物對(duì)樟芝深層發(fā)酵產(chǎn)活性物質(zhì)的影響Table 1 Effect of water extract of Cinnamomum kanehirae Hay on producing bioactive substances in Antrodia cinnamomea

由表1可知，添加牛樟樹(shù)水提物能顯著促進(jìn)樟芝生長(zhǎng)及產(chǎn)活性物質(zhì)。其中，生物量由4.89 g/L增加到6.18 g/L，提高了26%左右；總?cè)飘a(chǎn)量由25.18 mg/L增加至34.65 mg/L，提高了35%左右。但促進(jìn)效果最為顯著的胞內(nèi)多糖。添加牛樟樹(shù)水提物后，樟芝菌絲體中的胞內(nèi)多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)由11.17%增加至33.51%，提高了200%以上；胞內(nèi)多糖產(chǎn)量則由546.22 mg/L增加至2 070.92 mg/L，提高了270%左右，產(chǎn)量是原來(lái)的3.7倍。可見(jiàn)，牛樟樹(shù)水提物除了能顯著促進(jìn)樟芝無(wú)性產(chǎn)孢以外，還能顯著促進(jìn)樟芝菌絲體生長(zhǎng)及活性物質(zhì)的積累，可謂一舉多得。

2.4 牛樟樹(shù)水提物促產(chǎn)孢子的發(fā)酵性能研究

為了進(jìn)一步確定牛樟樹(shù)水提物促進(jìn)樟芝無(wú)性產(chǎn)孢的應(yīng)用價(jià)值，我們將添加牛樟樹(shù)水提物(60 μg/mL)促進(jìn)產(chǎn)生的樟芝無(wú)性孢子(以下簡(jiǎn)稱“促產(chǎn)孢子”)與相同條件下不添加牛樟樹(shù)水提物發(fā)酵產(chǎn)生的樟芝無(wú)性孢子(以下簡(jiǎn)稱“對(duì)照孢子”)的發(fā)酵性能(包括產(chǎn)孢性能和產(chǎn)活性物質(zhì)性能)進(jìn)行比較，以明確牛樟樹(shù)水是否會(huì)對(duì)樟芝孢子的種子活力產(chǎn)生負(fù)面影響。

首先，我們將“促產(chǎn)孢子”與“對(duì)照孢子”按1.0×106個(gè)/mL的接種量接入種子培養(yǎng)基中，26 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)12 d。期間，從第6天開(kāi)始，每天取樣進(jìn)行孢子計(jì)數(shù)，以考察“促產(chǎn)孢子”與“對(duì)照孢子”的產(chǎn)孢性能，結(jié)果如圖4所示。

圖4 牛樟樹(shù)水提物促進(jìn)產(chǎn)生的樟芝無(wú)性孢子深層發(fā)酵的產(chǎn)孢性能Fig.4 Sporulation performance of Antrodia cinnamomea spores induced by water extract of Cinnamomum kanehirae Hay注：“促產(chǎn)孢子”表示在種子培養(yǎng)基中添加最終質(zhì)量濃度為60 μg/mL的牛樟樹(shù)水提物，按1.0×106 個(gè)/mL的接種量接入樟芝原代孢子，26 ℃、150 r/min培養(yǎng)10 d后，所產(chǎn)生收集的樟芝無(wú)性孢子；“對(duì)照孢子”表示將樟芝原代種子按1.0×106 個(gè)/mL的接種量接入種子培養(yǎng)基中，26 ℃、150 r/min培養(yǎng)10 d后，所產(chǎn)生收集的樟芝無(wú)性孢子

由圖4可知，“促產(chǎn)孢子”的產(chǎn)孢速度及最大產(chǎn)孢量均顯著高于“對(duì)照孢子”，其最大產(chǎn)孢量65.63×106個(gè)/mL較“對(duì)照孢子”的50.88×106個(gè)/mL提高了28%左右。此結(jié)果說(shuō)明樟芝“促產(chǎn)孢子”在深層發(fā)酵中的產(chǎn)孢性能顯著優(yōu)于“對(duì)照孢子”。

此外，我們還將“促產(chǎn)孢子”與“對(duì)照孢子”按1.0×106個(gè)/mL的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，26 ℃、150 r/min 培養(yǎng)。由之前的研究結(jié)果[19]可知，本文所用樟芝菌株在該條件下發(fā)酵時(shí)，樟芝胞內(nèi)多糖及總?cè)频然钚晕镔|(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)均在發(fā)酵10 d時(shí)達(dá)到最大值，因此，選擇在第10天時(shí)結(jié)束發(fā)酵，并對(duì)樣品的生物量、胞內(nèi)多糖產(chǎn)量及總?cè)飘a(chǎn)量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如表2所示。

表2 牛樟樹(shù)水提物促進(jìn)產(chǎn)生的樟芝無(wú)性孢子深層發(fā)酵的產(chǎn)活性物質(zhì)性能Table 2 Bioactive substances production performance of Antrodia cinnamomea spores induced by water extract of Cinnamomum kanehirae Hay in submerged fermentatioin

由表2可知，樟芝“促產(chǎn)孢子”發(fā)酵產(chǎn)生的生物量及總?cè)飘a(chǎn)量與“對(duì)照孢子”相比無(wú)顯著差異；但“促產(chǎn)孢子”發(fā)酵的樟芝菌絲體中的胞內(nèi)多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)及胞內(nèi)多糖產(chǎn)量較“對(duì)照孢子”提高了39%和46%左右，分別為20.51%和1 432.84 mg/L。上述結(jié)果表明樟芝“促產(chǎn)孢子”在深層發(fā)酵中的生長(zhǎng)及產(chǎn)三萜性能與“對(duì)照孢子”無(wú)顯著差異，但“促產(chǎn)孢子”在深層發(fā)酵中產(chǎn)胞內(nèi)多糖的性能顯著優(yōu)于“對(duì)照孢子”。

綜上所述，樟芝“促產(chǎn)孢子”在深層發(fā)酵過(guò)程中的發(fā)酵性能要顯著優(yōu)于“對(duì)照孢子”，優(yōu)勢(shì)主要體現(xiàn)在產(chǎn)孢性能及產(chǎn)胞內(nèi)多糖性能上，究其原因及機(jī)理，尚有待于進(jìn)一步研究。

本研究結(jié)果較具實(shí)際意義及應(yīng)用價(jià)值。因?yàn)橥ǔＧ闆r下，樟芝產(chǎn)孢和產(chǎn)多糖的最適條件是不一致的：營(yíng)養(yǎng)匱乏的培養(yǎng)基更適合樟芝產(chǎn)孢，營(yíng)養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基更適合樟芝產(chǎn)多糖[11-12]。因此，人們通常根據(jù)發(fā)酵目的不同而采用不同的培養(yǎng)基配方。即，制備種子(樟芝無(wú)性孢子)時(shí)采用營(yíng)養(yǎng)較為匱乏的培養(yǎng)基，如本文所使用的“種子培養(yǎng)基”，碳氮比約為20∶1；發(fā)酵生產(chǎn)時(shí)通常采用營(yíng)養(yǎng)較為豐富的培養(yǎng)基，如本文所使用的“發(fā)酵培養(yǎng)基”，碳氮比約為2∶1。但樟芝在營(yíng)養(yǎng)匱乏的種子培養(yǎng)基中，生物量及三萜、多糖等活性物質(zhì)含量通常較低[19]。因此，在制備樟芝種子的發(fā)酵過(guò)程中，收集完孢子后剩下的樟芝菌絲體通常顯得很“雞肋”，直接丟棄比較可惜，但用來(lái)提取活性物質(zhì)又因?yàn)楫a(chǎn)量太低、提取成本太高而受到限制。本研究結(jié)果很好地解決了這個(gè)“雞肋”問(wèn)題，只需在種子培養(yǎng)基中添加微量(60 μg/mL)的牛樟樹(shù)水提物，便可在顯著提高樟芝孢子產(chǎn)量的同時(shí)，使得樟芝胞內(nèi)多糖產(chǎn)量也提高至原來(lái)的3.7倍，效果極其顯著。

3 結(jié)論

本文首先比較了牛樟樹(shù)4種溶劑(甲醇、石油醚、乙酸乙酯、水)提取物對(duì)樟芝深層發(fā)酵無(wú)性產(chǎn)孢的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)只有牛樟樹(shù)水提物對(duì)樟芝產(chǎn)孢呈現(xiàn)出顯著促進(jìn)作用；隨后，我們對(duì)牛樟樹(shù)水提物的添加濃度進(jìn)行了優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)其最佳添加質(zhì)量濃度為60 μg/mL；在最佳添加濃度下，牛樟樹(shù)水提物可使樟芝深層發(fā)酵產(chǎn)孢量較對(duì)照提高58%左右，同時(shí)生物量提高26%左右，三萜產(chǎn)量提高35%左右，多糖產(chǎn)量則提高270%左右；最后，本文對(duì)添加牛樟樹(shù)水提物促進(jìn)產(chǎn)生的樟芝孢子(簡(jiǎn)稱“促產(chǎn)孢子”)的發(fā)酵性能進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)“促產(chǎn)孢子”在產(chǎn)孢性能及產(chǎn)胞內(nèi)多糖性能方面均顯著優(yōu)于不添加牛樟樹(shù)水提物發(fā)酵產(chǎn)生的樟芝孢子，其中最大產(chǎn)孢量及胞內(nèi)多糖產(chǎn)量較對(duì)照分別提高了28%及46%左右。本研究結(jié)果解決了制備樟芝孢子時(shí)所產(chǎn)生樟芝菌絲體的“雞肋”問(wèn)題，同時(shí)也顯著提高了樟芝深層發(fā)酵生產(chǎn)的效益，可謂變廢為寶，一舉多得。此外，本研究成果操作方便、成本低廉、材料來(lái)源廣泛，容易推廣及規(guī)?；?，具有較大開(kāi)發(fā)價(jià)值及良好的應(yīng)用前景。