趙唱 賀欣

冠心病(coronary atherosclerotic heart disease)是臨床上心血管內(nèi)科最常見的疾病之一，發(fā)病率較高，由于其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，發(fā)病機(jī)制目前尚未完全闡明，大量研究發(fā)現(xiàn)冠心病發(fā)病受外界條件和遺傳基因兩大因素的共同影響，隨著基因測序等分子診斷技術(shù)的迅速發(fā)展，使得對冠心病個(gè)體化診斷和治療成為可能[1]。目前，其病因除了已探明的血脂異常、高血壓、吸煙和糖尿病等傳統(tǒng)的危險(xiǎn)因素，冠心病易感基因等分子水平的危險(xiǎn)因素研究也逐漸深入[1]。人體中葉酸代謝途徑的關(guān)鍵酶之一為亞甲基四氫葉酸還原酶(methylene tetrahydrofolate reductase，MTHFR)。研究顯示，編碼此酶的MTHFR 基因突變可增加冠心病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，MTHFR基因單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)與冠心病發(fā)病相關(guān)。目前，MTHFR基因常見的10個(gè)SNP位點(diǎn)有rs1801131、rs1801133、rs4846048、rs3737966、rs1537515、rs34733339、rs2274976、rs3834044、rs3737964和rs4846049。本文綜合考察上述10個(gè)SNP位點(diǎn)與冠心病相關(guān)性，為冠心病的發(fā)生提供更多理論依據(jù)，為冠心病的個(gè)體化防治提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2018年10月至2020年10月在醫(yī)院住院和門診就診的167例冠心病患者作為冠心病組，同時(shí)期收集172例健康體檢者作為對照組。冠心病組入組標(biāo)準(zhǔn)：患者均為經(jīng)冠狀動(dòng)脈造影結(jié)果確診；冠心病組患者之間無親緣關(guān)系；患者精神狀態(tài)良好，能夠正常交流。冠心病組排除標(biāo)準(zhǔn)：3個(gè)月內(nèi)服用過影響牛胱氨酸(Hcy)水平的葉酸、他汀類藥物患者；患有嚴(yán)重自身免疫系統(tǒng)疾病、內(nèi)分泌功能異?；颊?；合并腫瘤、血液病患者。對照組入組標(biāo)準(zhǔn)：本研究同時(shí)期，冠狀動(dòng)脈造影證實(shí)冠狀動(dòng)脈無明顯病變,在本院健康體檢者作為對照組。本試驗(yàn)經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),受試者均簽署知情同意書同意。

1.2 檢測指標(biāo) 收集受試者的性別、年齡、吸煙飲酒情況、高血壓病史等一般資料。并采集促凝血3 ml用于檢測Hcy、血糖、總膽固醇等生化指標(biāo)，同時(shí)采集EDTA抗凝血2 ml，用于提取人基因組DNA。

1.3 基因組DNA提取 應(yīng)用硅膜離心法從抗凝血中提取人白細(xì)胞中基因組DNA(德國QIAamp DNA Mini and Blood Mini提取試劑盒，批號(hào)：511106)，提取的DNA經(jīng)微量紫外分光光度檢測濃度和純度合格后，貯存于-80℃冰箱中。

1.4 SNP位點(diǎn)選擇 綜合文獻(xiàn)報(bào)道，選擇rs1801133(C677T)和 rs1801131(A1298G)位點(diǎn)，并在國家生物技術(shù)信息中心網(wǎng)站(The National Centerfor Biotechnology Information，NCBI；https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)搜索MTHFR基因編碼區(qū)、5’端調(diào)節(jié)序列、3’端調(diào)節(jié)序列等可能降低酶活性的SNP位點(diǎn),結(jié)合千人基因組計(jì)劃數(shù)據(jù)庫中，選擇最小等位基因頻率(minor allele frequency,MAF)>0.05的SNP位點(diǎn)，篩選出8個(gè)位點(diǎn)，共計(jì)研究10個(gè)SNP位點(diǎn)。

1.5 MTHFR基因型分型 以提取的受試者基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增MTHFR基因目的序列，通過測序檢測SNP多態(tài)性。50 μl PCR體系如下：PCR緩沖液Mix 25 μl,DNA 2 μl,濃度為10 μl的F、R游引物各1 μl,無RNase水補(bǔ)足至50 μl。PCR溫度：94℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s,56℃退火45 s,72℃延伸1 min,40個(gè)循環(huán)，72℃終延伸7 min;擴(kuò)增產(chǎn)物用毛細(xì)管電泳儀檢測目的條帶并進(jìn)行DNA測序。

2 結(jié)果

2.1 一般資料分析 冠心病組167例，平均年齡(55.16±14.35)歲；對照組172例，平均年齡(53.62±14.95)歲。冠心病組吸煙比例、高血壓比例、空腹血糖、Hcy、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、總膽固醇(TC)水平顯著高于對照組(P<0.05)，冠心病組高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)水平顯著低于對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 2組一般資料比較

2.2 Hard-Weinberg 平衡檢驗(yàn) 通過基因測序得到的10個(gè)SNP位點(diǎn)等位基因，采用擬和優(yōu)度檢驗(yàn)，分別檢驗(yàn)2組等位基因觀測值與預(yù)期值吻合程度，Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)結(jié)果顯示，冠心病組和對照組基因型觀測值[observedheterozygote frequency,O(HET)]與預(yù)期值[expected heterozygote frequency,E(HET)]差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，表明本研究中167例冠心病患者和172例健康體檢者處于Hard-Weinberg 平衡狀態(tài)，10個(gè)SNP位點(diǎn)可以入選本研究。見表2。

表2 各SNP位點(diǎn)Hardy-Weinberg檢驗(yàn)

2.3 MTHFR基因10 個(gè)SNP與冠心病單位點(diǎn)關(guān)聯(lián)分析 在rs1801133位點(diǎn)，冠心病組T等位基因頻率顯著高于對照組(χ2=6.409，P=0.011)，基因型分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=8.054，P=0.018),rs4846049位點(diǎn)冠心病組T等位基因頻率顯著高于對照組(χ2=4.212，P=0.040)，基因型分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=7.019，P=0.030)，其余位點(diǎn)rs4846048、rs3737966、rs1537515、rs34733339、rs2274976、rs1801131、rs3834044和rs37379642組間等位基因頻率和基因型分布差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見表3。

表3 冠心病組與對照組等位基因頻率比較 例(%)

2.4 連鎖不平衡分析 MTHFR基因10 個(gè)SNP位點(diǎn)應(yīng)用Haploview軟件進(jìn)行連鎖不平衡分析，分析結(jié)果顯示，10 個(gè)SNP位點(diǎn)存在連鎖不平衡現(xiàn)象，出現(xiàn)2個(gè)區(qū)塊(Block)，分別為由rs4846048、rs3737966、rs1537515組成的區(qū)塊1(Block1)和由rs4846049、rs2274976、rs1801131、rs1801133組成的區(qū)塊2(Block2)各位點(diǎn)之間存在明顯連鎖不平衡現(xiàn)象，其 D’均>0.9 且 r2均>1/3。Haploview軟件進(jìn)一步分析顯示，10個(gè)SNP位點(diǎn)共構(gòu)成7種單倍型，分別為區(qū)塊1構(gòu)成的GCC、ACC、GTA單倍型和區(qū)塊2構(gòu)成的TGAT、GAAC、GACC、GGAC。見圖1、2。

圖1 MTHFR 基因SNP位點(diǎn)連鎖不平衡圖(D’值);圖上部是所選SNP在基因上的定位，下部是10個(gè)SNP位點(diǎn)的Haploview 連鎖不平衡圖

2.5 基因位點(diǎn)單倍體型與冠心病Logistic回歸分析 單倍型Logistic回歸分析以是否患有冠心病為因變量，以性別、年齡、空腹血糖、三酰甘油、總膽固醇、HDL、LDL、Hcy、BMI、高血壓、吸煙史、飲酒史、單倍型作為自變量，建立Logistic回歸模型。Logistic回歸分析結(jié)果顯示，Block2中的TGAT單倍型冠心病組與對照組存在顯著差異,TGAT單倍型患冠心病風(fēng)險(xiǎn)是GGAC單倍型的2.512倍。TGAT單倍型(P=0.030)、空腹血糖(P<0.001)、三酰甘油(P=0.005)、HDL-C(P=0.005)、LDL-C(P=0.001)、Hcy(P=0.001)、高血壓(P=0.014)是患冠心病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。見表4。

圖2 MTHFR 基因位點(diǎn)連鎖不平衡圖(r2值);圖上部是所選SNP在基因上的定位，下部是10個(gè)SNP位點(diǎn)的Haploview 連鎖不平衡圖

表4 基因位點(diǎn)單倍體型與冠心病Logistic回歸分析

3 討論

冠心病作為一種常見的心血管疾病，其病因復(fù)雜，相關(guān)研究探索了遺傳因素對冠心病患病影響[2,3]。但不同種族的受試者冠心病與遺傳易感位點(diǎn)相關(guān)性結(jié)論并不一致[4-6]。MTHFR 基因定位于人基因組1p36.3，由10 個(gè)內(nèi)含子和11個(gè)外顯子組成，其基因大小為2.2kb，編碼的的蛋白為亞甲基四氫葉酸還原酶，此酶是葉酸代謝途徑的關(guān)鍵酶，當(dāng)該酶發(fā)生突變時(shí)，其酶活性降低，影響Hcy復(fù)甲基化代謝途徑。MTHFR 基因變異程度較高，常見的突變類型有6種錯(cuò)義突變、1種 5’末端剪接位點(diǎn)處的突變和 1 種無義突變。

MTHFR基因常見的SNP位點(diǎn)有 rs1801133、rs1801131、rs4846048、rs4846049等，而目前MTHFR基因SNP位點(diǎn)與冠心病相關(guān)性研究主要集中于rs18011331和rs1801133兩個(gè)位點(diǎn)。既往研究發(fā)現(xiàn)MTHFR rs1801133多態(tài)性對漢族MTHFR酶活性及冠心病的影響最大[7-9]，相關(guān)研究顯示，不同種族的rs1801133等位基因分布具有差異性[10,11]。rs1801133位點(diǎn)位于MTHFR基因第4 外顯子，在基因序列上T突變?yōu)镃，纈氨酸突變?yōu)楸彼?，并產(chǎn)生Hinf I 酶切位點(diǎn)，改變亞甲基四氫葉酸還原酶活性降低,人體蛋氨酸循環(huán)障礙,導(dǎo)致高Hcy血癥，而高Hcy 血癥被認(rèn)為是心腦血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[12-14]。本研究結(jié)果顯示，冠心病組T 等位基因頻率為54.49%，顯著高于對照組的44.77%，且2組不同基因型分布具有顯著差異，這與湖南省和廣西省等我國南方漢族人群中相關(guān)研究[15,16]結(jié)論一致。

對于MTHFR基因另一常見SNP位點(diǎn)rs1801131，研究結(jié)論并不一致。李亞萍等[17]研究顯示，河南地區(qū)漢族人群中rs1801131位點(diǎn)T等位基因攜帶者患靜脈血栓的風(fēng)險(xiǎn)更高。但周麗萍等[18]研究認(rèn)為，CC基因型及C等位基因頻率顯著高于健康對照組。番云華等[19]研究結(jié)果顯示MTHFRA1298C(rs1801131)與高同型半胱氨酸血癥無相關(guān)性。本研究結(jié)果顯示,rs1801131位點(diǎn)等位基因頻率和3種基因型分布在冠心病組與對照組中差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

對于其他6個(gè)SNP位點(diǎn)，定位于MTHFR基因3’ UTR的rs4846049位點(diǎn)與冠心病相關(guān)性研究較少，侯榮耀等[20]研究表明此位點(diǎn)與腦血管疾病相關(guān)，攜帶T等位基因受試者腦血管疾病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)顯著增高，TT基因型也使缺血性卒中發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)顯著增高，本研究中此位點(diǎn)冠心病組T 等位基因頻率顯著高于對照組(P<0.05)，基因型分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明本地區(qū)rs4846049位點(diǎn)是冠心病易感性位點(diǎn)。

rs2274976位點(diǎn)的突變位點(diǎn)為G1793A，此位點(diǎn)對于冠心病影響尚存在不同觀點(diǎn)，李振華等[21]研究顯示，MTHFR基因G1793A多態(tài)性與血清Hcy水平有相關(guān)性,血清Hcy水平AA突變型顯著高于GG野生型，但施翎等[22]研究顯示，AA型突變型未出現(xiàn)血漿Hcy水平升高的風(fēng)險(xiǎn)。本研究顯示，冠心病組與對照組G1793A等位基因和基因型分布無差異。而rs4846048、rs3737966、rs1537515、rs34733339、rs3834044和rs3737964冠心病組與對照組等位基因和基因型分布差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

對10個(gè)SNP位點(diǎn)進(jìn)一步的單倍型分析顯示，分別為由rs4846048、rs3737966、rs1537515組成的區(qū)塊1和由rs4846049、rs2274976、rs1801131、rs1801133組成的區(qū)塊2，各位點(diǎn)之間存在明顯連鎖不平衡現(xiàn)象。10個(gè)SNP位點(diǎn)共構(gòu)成7種單倍型，分別為區(qū)塊1構(gòu)成的GC、AC、GT單倍型和區(qū)塊2構(gòu)成的GACT、GGAC、GAAT、AGAC。Logistic回歸分析顯示，區(qū)塊1構(gòu)成的3種單倍型并不是冠心病的危險(xiǎn)因素，而區(qū)塊2構(gòu)成的單倍型GACT，是發(fā)生冠心病的危險(xiǎn)性單倍型，TGAT單倍型患冠心病風(fēng)險(xiǎn)是AGAC單倍型的2.512倍。目前筆者發(fā)現(xiàn)MTHFR基因rs1801133等單一的SNP與冠心病相關(guān)性研究較多，但MTHFR基因多SNP位點(diǎn)構(gòu)成的單倍型與冠心病相關(guān)性報(bào)道較少，隨著分子生物學(xué)和高通量基因測序等技術(shù)的進(jìn)步，長片段基因測序成本將大大降低，更有利于多位點(diǎn)的單倍型研究。

本研究結(jié)論還需通過擴(kuò)大樣本量、對多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)一步行相關(guān)功能研究、選擇不同人群及種族，排除其他干擾因素，進(jìn)一步控制偏倚將會(huì)獲取更客觀、確鑿的論證，為探索MTHFR基因 SNP對冠心病的影響，早期進(jìn)行MTHFR基因多SNP位點(diǎn)檢測，為指導(dǎo)冠心病個(gè)體化治療提供依據(jù)，為冠心病的預(yù)防與治療提供新方向。