劉洋君 李麗 陸曉丹

喉癌的發(fā)病率占頭頸部癌的第二位，患者的5年生存率較低，復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是喉癌患者死亡的主要原因，因此研究喉癌細(xì)胞的遷移與轉(zhuǎn)移機(jī)制具有重要意義[1,2]。微小RNA-370(MicroRNA-370，miR-370)是一種腫瘤抑制基因，可參與調(diào)控結(jié)腸癌、膠質(zhì)瘤等多種腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移等[3,4]。Shen等[5]研究表明，miR-370在結(jié)腸癌中下調(diào)表達(dá)，miR-370可靶向MDM4抑制結(jié)腸腫瘤的生長。干擾素刺激基因15(interferon stimulating gene 15，ISG15)是一種由Ⅰ型干擾素誘導(dǎo)的蛋白，屬于泛素樣蛋白超家族，其在多種惡性腫瘤中高度表達(dá)[6]。然而筆者發(fā)現(xiàn)miR-370與ISG15在喉癌細(xì)胞中的作用機(jī)制尚不清楚，因此，本研究通過探索過表達(dá)miR-370對喉癌細(xì)胞(LSC-1)增殖、遷移及侵襲的影響及其對ISG15的調(diào)控作用，以期尋找喉癌治療的新靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 人喉癌細(xì)胞LSC-1購于中國科學(xué)院細(xì)胞庫；DMEM培養(yǎng)基(貨號：SH40007.01)購自美國Hyclone公司；胎牛血清(貨號：F8245-100)、DMSO(貨號：D2650)購自Solarbio公司；miR-370過表達(dá)質(zhì)粒(miR-370 mimics)及其陰性對照(miR-NC)、ISG15過表達(dá)質(zhì)粒(ISG15)及其空載質(zhì)粒(pcDNA)、抑制ISG15表達(dá)(si-ISG15)及其陰性對照(si-NC)質(zhì)粒購自上海斯信生物科技有限公司；miR-370、ISG15、U6、GAPDH引物序列由上海吉瑪制藥有限公司設(shè)計合成；Matrigel膠(貨號：356234)購自美國BD公司，CCK-8試劑盒(貨號：C0037)、RIPA細(xì)胞裂解液(貨號：P0013B)購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Lipofectamine 2000(貨號：11668-027)、Trizol購自美國Invitrogen公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒(貨號：E1920)購自Promega公司；兔抗人ISG15(貨號：ab227541)、MMP-2(貨號：ab92536)、MMP-9(貨號：ab228402)抗體購自英國Abcam公司。M2型全波長酶標(biāo)儀購自美國MD公司；XDS-1B型顯微鏡購自上海光學(xué)儀器廠；ABI 7500熒光定量PCR儀購自Thermofisher。

1.2 標(biāo)本來源 喉癌組織與癌旁組織標(biāo)本各31例，來源于2017年7月至2020年10月在我院行手術(shù)治療的喉癌患者，年齡37～73歲，平均年齡(55.70±9.30)歲；手術(shù)過程中取喉癌組織與癌旁組織；分期：Ⅰ期9例，Ⅱ期12例，Ⅲ期7例，Ⅳ期3例。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)時熒光定量PCR(real-time quantification PCR，RT-qPCR)實(shí)驗(yàn)檢測miR-370和ISG15 mRNA水平:采用RT-qPCR法檢測喉癌組織與癌旁組織miR-370和ISG15 mRNA相對表達(dá)量，分別以U6、GAPDH為內(nèi)參，采用2-△△Ct法計算miR-370和ISG15 mRNA相對表達(dá)量。miR-370上游引物(5’-3’)：TGCTGGGGTGGAACCT，下游引物(5’-3’)：GAACATGTCTGCGTATCTC；U6上游引物(5’-3’)：GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT，下游引物(5’-3’)：CGCTTCAGAATTTGCGTGTCAT；ISG15上游引物(5’-3’)：CTCTGAGCATCCTGGTGAGGAA，下游引物(5’-3’)：AAGGTCAGCCAGAACAGGTCGT；GAPDH上游引物(5’-3’)：GTCTCCTCTGACTTCAACAGCG，下游引物(5’-3’)：ACCACCCTGTTGCTGTAGCCAA。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染:復(fù)蘇培養(yǎng)人喉癌細(xì)胞LSC-1，將LSC-1細(xì)胞接種于含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行傳代培養(yǎng)，待細(xì)胞生長至對數(shù)期時，取質(zhì)粒按照Lipofectamine 2000說明書轉(zhuǎn)染LSC-1細(xì)胞，將LSC-1細(xì)胞分為對照組、miR-NC組、miR-370 mimics組、si-NC組、si-ISG15組、miR-370 mimics+pcDNA組和miR-370 mimics+ISG15組，細(xì)胞轉(zhuǎn)染6 h后更換新鮮DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。檢測LSC-1細(xì)胞miR-370表達(dá)和ISG15蛋白表達(dá)以驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率。

1.3.3 雙熒光素酶報告基因檢測實(shí)驗(yàn):根據(jù)生物信息學(xué)軟件預(yù)測顯示，miR-370與ISG15 3’UTR有結(jié)合區(qū)域，ISG15可能是miR-370的靶基因，根據(jù)二者結(jié)合序列區(qū)域，分別構(gòu)建野生型ISG15-3’UTR-WT和突變型ISG15-3’UTR-MUT質(zhì)粒，取上述質(zhì)粒分別與miR-370 mimics、miR-NC共轉(zhuǎn)染LSC-1細(xì)胞24 h，分為ISG15-3’UTR-WT+miR-NC組、ISG15-3’UTR-WT+miR-370 mimics組、ISG15-3’UTR-MUT+miR-370 mimics組和ISG15-3’UTR-MUT+miR-NC組，根據(jù)雙熒光素酶報告基因試劑盒測定熒光素酶活性。

1.3.4 細(xì)胞計數(shù)試劑盒8(CCK-8)法檢測細(xì)胞增殖:轉(zhuǎn)染后的各組LSC-1細(xì)胞接種至96孔板中，分別培養(yǎng)24、48、72 h后，每孔加入10 μl的CCK-8溶液，37℃繼續(xù)培養(yǎng)2 h后，在酶標(biāo)儀450 nm處檢測吸光度(OD)值，繪制細(xì)胞生長曲線。

1.3.5 Transwell小室檢測細(xì)胞遷移與侵襲:細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)：使用無血清的DMEM培養(yǎng)基將各組LSC-1細(xì)胞制備成4×105個/ml的細(xì)胞懸液，Transwell小室上室加入200 μl細(xì)胞懸液，下室加入600 μl含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，在37℃含5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h 后，下室用4%多聚甲醛固定20 min，0.5%結(jié)晶紫染色10 min，倒置顯微鏡觀察，隨機(jī)觀察6個視野的穿過微孔膜細(xì)胞數(shù)。細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)：Matrigel基質(zhì)膠溶解后均勻的鋪于Transwell小室上室，調(diào)整各組LSC-1細(xì)胞為4×105個/ml的細(xì)胞懸液，Transwell小室加入200 μl細(xì)胞懸液，下室加入600 μl含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后，其余步驟同遷移實(shí)驗(yàn)。

1.3.6 免疫印跡法(western blotting，WB)檢測ISG15、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá):轉(zhuǎn)染后LSC-1細(xì)胞在6孔板培養(yǎng)48 h，加入200 μl RIPA細(xì)胞裂解液與蛋白酶抑制劑的混合液裂解30min，離心取上清液，BCA法檢測蛋白濃度，取30 μg蛋白進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)膜后，5%脫脂奶粉封閉1 h，分別加入稀釋后的ISG15、MMP-2、MMP-9抗體和β-actin(1∶500)抗體，4℃孵育過夜，TBST洗滌，添加相應(yīng)二抗室溫孵育2 h，凝膠成像系統(tǒng)成像，使用Quantity One軟件分析條帶灰度值。

2 結(jié)果

2.1 miR-370、ISG15在喉癌組織中的表達(dá) 癌旁組織中miR-370表達(dá)水平為(1.05±0.12)，ISG15 mRNA表達(dá)水平為(1.01±0.14)；喉癌組織中miR-370表達(dá)水平為(0.43±0.07)，ISG15 mRNA表達(dá)水平為(2.51±0.47)，癌旁組織與喉癌組織miR-370、ISG15 mRNA表達(dá)水平比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 miR-370與ISG15靶向關(guān)系 數(shù)據(jù)庫預(yù)測發(fā)現(xiàn)，miR-370與ISG15 mRNA 3’UTR區(qū)有結(jié)合位點(diǎn)。雙熒光素酶報告基因檢測結(jié)果顯示，miR-370 mimics與野生型ISG15質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染LSC-1細(xì)胞后，熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)。表明miR-370與ISG15存在靶向關(guān)系。見表1，圖1。

表1 雙熒光素酶報告基因檢測結(jié)果

圖1 miR-370與ISG15 mRNA結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測結(jié)果

2.3 過表達(dá)miR-370對LSC-1細(xì)胞ISG15表達(dá)及增殖、遷移與侵襲的影響 轉(zhuǎn)染miR-370 mimics后，與對照組和miR-NC組相比，miR-370 mimics組LSC-1細(xì)胞增殖、遷移、侵襲能力與ISG15、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，miR-370表達(dá)顯著升高(P<0.05)。表明過表達(dá)miR-370可顯著抑制LSC-1細(xì)胞增殖、遷移與侵襲。見圖2，表2。

圖2 過表達(dá)miR-370對LSC-1細(xì)胞ISG15表達(dá)及增殖、遷移與侵襲的影響；A 過表達(dá)miR-370對LSC-1細(xì)胞增殖的影響；B 3組LSC-1細(xì)胞ISG15、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)電泳圖(1 對照組；2 miR-NC組；3 miR-370 mimics組)；C 3組LSC-1細(xì)胞遷移與侵襲(結(jié)晶紫染色×400)

表2 過表達(dá)miR-370對LSC-1細(xì)胞ISG15蛋白表達(dá)、遷移與侵襲的影響

2.4 抑制ISG15表達(dá)對LSC-1細(xì)胞增殖、遷移與侵襲的影響 LSC-1細(xì)胞轉(zhuǎn)染si-ISG15質(zhì)粒后，與對照組和si-NC組相比，si-ISG15組LSC-1細(xì)胞增殖、遷移、侵襲能力和ISG15、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，表明下調(diào)ISG15表達(dá)可顯著抑制LSC-1細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。見表3，圖3。

表3 抑制ISG15表達(dá)對LSC-1細(xì)胞遷移與侵襲的影響

圖3 抑制ISG15表達(dá)對LSC-1細(xì)胞增殖、遷移與侵襲的影響；A 抑制ISG15表達(dá)對LSC-1細(xì)胞增殖的影響；B 3組LSC-1細(xì)胞ISG15、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)電泳圖(1 對照組；2 si-NC組；3 si-ISG15組)；C 3組LSC-1細(xì)胞遷移與侵襲圖(結(jié)晶紫染色×400)

2.5 過表達(dá)ISG15可逆轉(zhuǎn)過表達(dá)miR-370對LSC-1細(xì)胞增殖、遷移與侵襲的抑制作用 將ISG15過表達(dá)質(zhì)粒與miR-370 mimics質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染LSC-1細(xì)胞后，LSC-1細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力顯著升高，主要表現(xiàn)為ISG15、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)水平顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。表明過表達(dá)ISG15可部分逆轉(zhuǎn)過表達(dá)miR-370對LSC-1細(xì)胞增殖、遷移與侵襲的抑制作用。見圖4，表4。

表4 過表達(dá)miR-370基礎(chǔ)上過表達(dá)ISG15對LSC-1細(xì)胞遷移與侵襲的影響

圖4 過表達(dá)ISG15可逆轉(zhuǎn)過表達(dá)miR-370對LSC-1細(xì)胞增殖、遷移與侵襲的抑制作用;A 過表達(dá)miR-370基礎(chǔ)上過表達(dá)ISG15對LSC-1細(xì)胞增殖的影響; B 3組LSC-1細(xì)胞ISG15、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)電泳圖(1 miR-370 mimics組；2 miR-370 mimics+pcDNA組；3 miR-370 mimics+ISG15組);C 3組LSC-1細(xì)胞遷移與侵襲圖(結(jié)晶紫染色×400)

3 討論

多項報道顯示，miRNAs參與調(diào)節(jié)喉癌細(xì)胞增殖、凋亡和腫瘤細(xì)胞耐藥性等過程，與喉癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，miR-370為抑癌基因，其異常表達(dá)與卵巢癌、乳腺癌、膠質(zhì)瘤等腫瘤的發(fā)生有關(guān)[7-9]。有研究顯示，喉鱗狀細(xì)胞癌(LSCC)組織中miR-370表達(dá)下調(diào)，miR-370可能靶向FoxM1抑制Hep2細(xì)胞增殖[10]。本研究結(jié)果顯示，喉癌組織中LSC-1中miR-370表達(dá)下調(diào)，與先前報道[7,8]一致。本研究將miR-370過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染LSC-1細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，與對照組和miR-NC組相比，miR-370 mimics組LSC-1細(xì)胞增殖、遷移、侵襲能力與MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)水平顯著降低，表明過表達(dá)miR-370可顯著抑制LSC-1細(xì)胞增殖、遷移與侵襲，提示miR-370可能在喉癌中發(fā)揮抑癌作用。此外，研究顯示，miR-370還可抑制胃癌、肝癌等腫瘤細(xì)胞的遷移與侵襲[9]，與本研究結(jié)果一致。錢麗麗等[10]研究表明，在腫瘤壞死因子(TNF)-α誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞中，miR-370可靶向叉頭框基因(Fox)抑制肝癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。

miRNAs通過對下游靶蛋白的調(diào)控而參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖與遷移是腫瘤生成與轉(zhuǎn)移的重要基礎(chǔ)，本研究通過生物信息學(xué)軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)，miR-370與ISG15有結(jié)合位點(diǎn)。ISG15作為一個IFN刺激蛋白，其單體及共價修飾蛋白在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，在多數(shù)腫瘤中，ISG15上調(diào)表達(dá)，且與腫瘤的惡性程度和不良預(yù)后有關(guān)[11,12]。研究表明，在胰腺導(dǎo)管腺癌(PDAC)細(xì)胞中，敲低ISG15表達(dá)，可抑制細(xì)胞增殖和集落形成，導(dǎo)致CD8+腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞數(shù)量增加和胰腺腫瘤生長減少[13]。本研究結(jié)果顯示，LSC-1細(xì)胞中轉(zhuǎn)染si-ISG15質(zhì)粒以下調(diào)ISG15表達(dá)后，LSC-1細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力和MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)顯著降低，表明下調(diào)ISG15表達(dá)可顯著抑制LSC-1細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。另有研究顯示，ISG15在結(jié)腸癌組織中高表達(dá)，ISG15上調(diào)與結(jié)腸癌患者預(yù)后不良密切相關(guān)，ISG15表達(dá)上調(diào)可促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的體外遷移和增殖，而ISG15表達(dá)下調(diào)可抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，此外，下調(diào)ISG15可以增強(qiáng)曲美替尼對結(jié)腸癌細(xì)胞的抗癌作用[14]。本研究經(jīng)過雙熒光素酶報告基因檢測顯示，miR-370與ISG15存在靶向關(guān)系。另外本研究也顯示，在LSC-1細(xì)胞中，miR-370的上調(diào)可抑制ISG15表達(dá)，且過表達(dá)ISG15可部分逆轉(zhuǎn)過表達(dá)miR-370對LSC-1細(xì)胞增殖、遷移與侵襲的抑制作用。Liu等[15]研究表明，miR-370可靶向調(diào)控ISG15表達(dá)，調(diào)控肝癌細(xì)胞對IFN-α的敏感性，也證實(shí)了miR-370與ISG15存在靶向關(guān)系。以上這些結(jié)果表明miR-370可通過靶向抑制ISG15表達(dá)，影響LSC-1細(xì)胞增殖、遷移與侵襲。

綜上所述，過表達(dá)miR-370可通過靶向抑制ISG15表達(dá)而抑制人喉癌細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲，本研究僅對相關(guān)機(jī)制進(jìn)行了初步研究，具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。