耿顯勝，葉碧歡，張威，陳友吾，舒金平，林明

(1.中國林業(yè)科學研究院 亞熱帶林業(yè)研究所，浙江 杭州 311400；2.浙江省林業(yè)科學研究院，浙江 杭州 310023）

榧樹Torreya grandis是紅豆杉科Taxaceae 榧樹屬Torreya常綠針葉樹種，也是國家二級保護植物[1]。榧樹自然變異類型或單株中選出的優(yōu)良栽培品種香榧T.grandis‘Merrillii’是我國東南部的重要經(jīng)濟樹種，在當?shù)亓謽I(yè)經(jīng)濟中發(fā)揮著重要作用[2-3]。香榧種子不僅富含蛋白質(zhì)、氨基酸、不飽和脂肪酸、角鯊烯、植物甾醇、生育酚、煙酸等營養(yǎng)物質(zhì)和生物活性成分，而且風味獨特、香氣誘人，深受中國消費者歡迎，具有很高的經(jīng)濟價值[1,4-7]。香榧的種植面積和堅果年產(chǎn)量均不大，產(chǎn)品供不應求，市場價格高達120～200 元·kg-1，是目前價格最高的干果之一[2-3,8]。據(jù)統(tǒng)計，浙江省諸暨市趙家鎮(zhèn)和東白湖鎮(zhèn)每年生產(chǎn)香榧堅果1 000 多噸，年收入約4 億元人民幣[3,8]。目前，中國有超過5 萬農(nóng)民以種植香榧和生產(chǎn)香榧堅果作為主要的經(jīng)濟收入來源，香榧已成為農(nóng)民發(fā)家致富的潛力樹種[3,8]。

癭螨Eriophyoidea 是植食性螨類中經(jīng)濟重要性僅次于葉螨Tetranychoidea 的一類害螨[9]。癭螨不僅直接刺吸危害植物，危害造成蟲癭、毛氈、水皰、叢生、器官變色和卷曲畸形、器官脫落等癥狀，同時還能傳播植物病毒病，造成間接危害。我國危害香榧的癭螨最早報道于1988 年[10]，而浙江省香榧受癭螨危害的報道最早是在2002 年[11]。目前，浙江省的各香榧產(chǎn)區(qū)均發(fā)現(xiàn)有癭螨危害，癭螨已成為香榧的主要害蟲。癭螨群聚于香榧葉片上吸取細胞汁液和葉綠體，輕則造成葉片失綠呈黃褐色，影響葉片的光合作用，重則引起大量落葉，甚至整株樹木死亡[11-12]。如何高效地防控癭螨，保障香榧林的健康經(jīng)營，成為生產(chǎn)中需要解決的一個關(guān)鍵問題。

癭螨由于個體小，形態(tài)結(jié)構(gòu)簡單，用于分類的外部形態(tài)特征少，并且有些形態(tài)特征存在同塑性進化（Homoplastic evolution）現(xiàn)象，這給傳統(tǒng)的形態(tài)學鑒定帶來了困難和挑戰(zhàn)[9,13-14]?；诜肿由飳W的鑒定技術(shù)具有鑒定速度快、精確度高、重復性好、對樣品完整性要求低等特點，已成為物種鑒定的重要方法[15-16]。而將形態(tài)學數(shù)據(jù)與分子生物學數(shù)據(jù)相結(jié)合的鑒定方法，已成為癭螨物種鑒定最有效的方法[9,13-14,17]。本研究擬采用形態(tài)學鑒定法對香榧癭螨進行物種鑒定，采用林間生物測定法測定了4 種殺螨劑和1 種捕食螨的防治效果，以期為香榧癭螨的物種鑒定及高效防控提供參考和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 香榧癭螨的形態(tài)學鑒定

2020 年6 月，于浙江省杭州市富陽區(qū)癭螨危害的香榧林（30°2′2" N，119°42′32" E），用枝剪剪取香榧枝條，裝于自封袋內(nèi)，帶回實驗室。從枝條上剪取香榧葉片，置于VHX-5000 超景深三維顯微鏡下觀察，初步確定葉片上存在大量的癭螨。使用毛筆挑取葉片上的癭螨，制備成玻片標本，用于形態(tài)學鑒定和繪圖。

1.2 香榧癭螨的系統(tǒng)發(fā)育分析

顯微鏡下使用毛筆挑取香榧葉片上的癭螨，置于含180 μL Buffer GL 的2 mL 離心管內(nèi)，每管挑30 頭癭螨，共挑3 管。依據(jù)通用型基因組提取試劑盒（TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0,TaKaRa）的方法提取基因組總DNA。

以提取的總DNA 為模板，采用3 對引物（表1）擴增28S rDNA、18S rDNA 和COI基因片段。28S rDNA和18S rDNA 基因片段PCR 擴增的反應體系為：2×PCR Mix 10 μL，10 μmol·L-1的正、反向引物各0.5 μL，DNA模板1 μL，加ddH2O 補足20 μL。PCR 擴增的反應條件為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性35 s，55 ℃退火35 s，72 ℃延伸40 s，共35 個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。COI基因片段PCR 擴增的反應體系和條件參考Xue 等[18]的方法，具體的反應體系為：2×PCR Mix 12.5 μL，10 μmol·L-1的正、反向引物各1 μL，DNA 模板2 μL，加ddH2O補足25 μL。PCR 擴增的反應條件為：96 ℃預變性3 min；95 ℃變性10 s，46 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共35 個循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。PCR 產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳分析，PCR 擴增為陽性的產(chǎn)物送鉑尚生物技術(shù)有限公司測序。測序序列使用DNAMAN 9.0 進行多重序列比對分析，并使用NCBI（National Center for Biotechnology Information）數(shù)據(jù)庫進行在線比對分析，下載與候選序列具有很高同源性的GenBank 序列。

表1 本研究使用的引物序列Table 1 Primer sequences

使用PhyloSuite v.1.2.2 軟件對癭螨總科26 個物種/憑證樣本的28S rDNA-18S rDNA 序列聯(lián)合構(gòu)建貝葉斯系統(tǒng)發(fā)育樹[19]，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹時使用的外群為葉螨總科Tetranychoidea 的神澤葉螨Tetranychus kanzawai。構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹的具體方法和參數(shù)設(shè)置參見Geng 等[20]的方法和參數(shù)設(shè)置。構(gòu)建好的系統(tǒng)發(fā)育樹使用FigTree v.1.4.3及Adobe Illustrator CS6 查看和美化。

1.3 香榧癭螨防控技術(shù)研究

1.3.1 供試藥劑和捕食螨 15% 噠螨靈（廣西田園生化股份有限公司），3%甲維·虱螨脲和5%阿維菌素（浙江世佳科技有限公司），21%阿維·螺螨酯（浙江永農(nóng)生物科學有限公司）；加州新小綏螨Neoseiulus californicus（福建福州冠農(nóng)生物科技有限公司）。

1.3.2 化學農(nóng)藥林間防治效果測定 2021 年10 月15 日，在浙江省衢州市衢江區(qū)選取冷杉納氏癭螨Nalepella abiesis危害的12 年生香榧人工林（29°07′16" N，118°58′21" E）開展林間防治效果測定。參考農(nóng)藥使用說明書推薦的施用濃度，用自來水將15%噠螨靈、3% 甲維·虱螨脲、5%阿維菌素和21%阿維·螺螨酯4 種化學農(nóng)藥分別配制成高濃度（1 500 倍、1 000 倍、1 000 倍和2 500 倍）和推薦濃度（3 000 倍、2 000 倍、2 000 倍和5 000 倍）2 個濃度梯度。采用噴霧法施藥，每個處理噴霧4 株香榧，每株香榧的平均噴霧量為5 L。試驗以噴霧清水為對照處理。噴霧前和噴霧后7 d，每株香榧從東南西北4 個方向各剪取1 個枝條，帶回實驗室。每個枝條上取新葉和老葉各1 片，在VHX-5000 顯微鏡下統(tǒng)計施藥前后每片葉子上冷杉納氏癭螨的蟲口數(shù)量，計算每個處理的蟲口減退率和防治效果。蟲口減退率和防治效果的計算公式如下：

1.3.3 加州新小綏螨室內(nèi)和林間捕食效果測定 在室內(nèi)使用培養(yǎng)皿搭建水阻隔平臺，進行加州新小綏螨室內(nèi)捕食實驗。采集冷杉納氏癭螨危害的香榧葉片，在顯微鏡下統(tǒng)計葉片上癭螨的數(shù)量，之后將葉片放置于培養(yǎng)皿中，接入加州新小綏螨，實驗共用9 片香榧葉片。接螨后的水阻隔平臺放置于人工氣候箱內(nèi)。人工氣候箱的設(shè)置為：溫度25℃，相對濕度85%，光照強度2 000 lx，光周期12D:12L。48 h 后統(tǒng)計香榧葉片上的冷杉納氏癭螨數(shù)量，計算捕食率。捕食率的計算公式如下：

捕食率=被捕食的癭螨數(shù)量÷癭螨總數(shù)×100%

2021 年10 月15 日，在浙江省衢州市衢江區(qū)選取冷杉納氏癭螨危害的12 年生香榧人工林開展林間防治效果測定。每株香榧樹上掛5 袋加州新小綏螨（3 000 頭·袋-1），實驗重復4 次。釋放捕食螨前和7 d 之后，每株香榧從東南西北4 個方向各剪取1 個枝條，帶回實驗室。依據(jù)1.3.2 的方法統(tǒng)計葉片上害螨的蟲口數(shù)量，使用1.3.2 的公式計算蟲口減退率和防治效果。

1.4 數(shù)據(jù)處理

獲得的實驗數(shù)據(jù)使用Excel 2010 和SPSS 23.0 進行分析處理。使用SPSS 23.0 對數(shù)據(jù)進行描述性統(tǒng)計、方差齊性檢驗和方差分析。方差分析時，需要對蟲口減退率和防治效果的原始數(shù)據(jù)做反正旋轉(zhuǎn)換。

2 結(jié)果與分析

2.1 香榧癭螨的形態(tài)學鑒定

室內(nèi)顯微觀察發(fā)現(xiàn)，香榧葉片上存在大量的癭螨。癭螨的卵和若蟲存在于葉片的背面，成蟲活動能力強于若蟲，主要存在于葉片的背面，但腹面也有分布。癭螨使用刺吸式口器吸食香榧葉片的汁液和葉綠體，造成受害部位初期呈白色失綠狀，后期呈黃褐色。大量癭螨聚集在香榧葉片上危害，輕則造成葉片發(fā)黃且失去光澤，嚴重者引起葉片脫落，甚至整株樹木死亡。

經(jīng)形態(tài)學鑒定，危害香榧的癭螨為冷杉納氏癭螨。該癭螨隸屬于植羽癭螨科Phytoptidae 納氏癭螨屬Nalepella。冷杉納氏癭螨的主要鑒別特征為：體紡錘形；喙斜下伸，口針略彎曲；須肢端部平截，須肢背膝節(jié)剛毛不分叉；背盾板具前葉突，背瘤發(fā)達，圓柱形，背毛3 根，包括1 根短的內(nèi)頂毛和2 根長的背毛；足6 節(jié)，具模式剛毛，羽狀爪完整，9 支，爪端球明顯，足I 脛節(jié)上具小刺，基節(jié)剛毛3 對；大體無亞背毛，腹剛毛俱全，如圖1。

圖1 冷杉納氏癭螨成螨的形態(tài)特征Figure 1 The morphological characteristics of adult N.abiesis

2.2 香榧癭螨的系統(tǒng)發(fā)育分析

PCR 擴增結(jié)果表明，3 對引物都能夠擴增出特異性條帶，并且擴增條帶的大小與預期大小一致（圖2），初步確定3 對引物能夠特異性擴增出癭螨的28S rDNA、18S rDNA 和COI基因片段。對擴增產(chǎn)物進行測序和序列分析，得到癭螨28S rDNA的460 bp 序列、18S rDNA 的807 bp 序列和COI基因的658 bp序列。

圖2 PCR 擴增冷杉納氏癭螨28S rDNA、18S rDNA 和COI 基因片段Figure 2 PCR amplification of 28S rDNA,18S rDNA,and COI fragment from genomic DNA extracted from N.abiesis on T.grandis ‘Merrillii’

DNAMAN 9.0 多重序列比對結(jié)果表明，3 個樣品間18S rDNA 的同源性為99.75%，而3 個樣品間28S rDNA和COI 基因片段的同源性為100%。測序序列經(jīng)NCBI 數(shù)據(jù)庫比對，未在GenBank 中找到同源性很高的癭螨物種序列。本研究獲取了冷杉納氏癭螨28S rDNA、18S rDNA 和COI基因序列，將這些序列提交到GenBank（登錄號分別為：OM701792、OM717253 和OM692372）。

使用癭螨總科26 個物種/憑證樣本的28S rDNA-18S rDNA 串聯(lián)序列采用貝葉斯推斷法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，建樹時28S rDNA 和18S rDNA 使用的核苷酸替換模型都是GTR+I+G。從貝葉斯系統(tǒng)發(fā)育樹的拓撲結(jié)構(gòu)可以看出，26 個癭螨總科的物種/憑證樣本分成3 個分支，本研究的冷杉納氏癭螨與三毛癭螨屬Trisetacus、納氏癭螨屬Nalepella、博氏癭螨屬Boczekella和Setoptus屬的7 個物種/憑證樣本形成Clade I 分支，該分支所有物種/憑證樣本都屬于植羽癭螨科，表明這4 個屬間的親緣關(guān)系很近（圖3）。分析Clade I 包含物種的寄主植物，所有8個癭螨物種/憑證樣本的寄主植物都是裸子植物門的針葉樹種，表明寄生在親緣關(guān)系近的寄主植物上的癭螨物種也具有較近的親緣關(guān)系。Clade II 分支包含癭螨科Eriophyidae 和羽爪癭螨科Diptilomiopidae 的16 個物種/憑證樣本，表明癭螨科和羽爪癭螨科物種間的親緣關(guān)系很近（圖3）。Clade III 分支包含植羽癭螨科的2 個物種，這2 個物種都采集于俄羅斯，并且其寄主均為草本的莎草科Cyperaceae 植物（圖3）。

圖3 基于28S rDNA 和18S rDNA 序列聯(lián)合構(gòu)建的貝葉斯系統(tǒng)發(fā)育樹Figure 3 Bayesian inference phytogenic tree based on 28S rDNA and 18S rDNA sequences

2.3 冷杉納氏癭螨防控技術(shù)研究

經(jīng)室內(nèi)顯微觀察，浙江省衢州市衢江區(qū)實驗林的香榧葉片上也存在大量的冷杉納氏癭螨（圖4）。由表2 可知，防治前其蟲口密度在16.84～30.84 頭·片葉-1，防治后其蟲口密度降低到3.41～18.31 頭·片葉-1。施藥和釋放加州新小綏螨后冷杉納氏癭螨蟲口密度和蟲口減退率的方差分析結(jié)果表明，不同處理間差異顯著（P＜0.05）。所有9 種處理與對照處理間的差異都達到顯著水平（P＜0.05），表明所有的處理均能顯著降低香榧葉片上癭螨的蟲口密度。高濃度和推薦濃度的15%噠螨靈、5%阿維菌素和21% 阿維·螺螨酯施用后，各處理的蟲口密度差異均不顯著（P＞0.05）（表2），表明這3種農(nóng)藥在推薦濃度下即可明顯降低香榧葉片上的癭螨的蟲口密度；施用高濃度（1 000 倍）和推薦濃度的3% 甲維·虱螨脲后，蟲口密度差異顯著（P＜0.05）（表2），表明該藥劑在高濃度時對香榧葉片上癭螨的蟲口密度的降低作用更明顯。

圖4 香榧葉片上的冷杉納氏癭螨Figure 4 N.abiesis on T.grandis ‘Merrillii’ leaf

防治效果表明，9 種處理的防治效果在55.93%～88.70%（表2），其中21%阿維·螺螨酯和15% 噠螨靈在推薦濃度下的防治效果在87.00%以上，高于5%阿維菌素和3%甲維·虱螨脲的防治效果，也顯著高于（P＜0.05）捕食螨的防治效果。因此，21%阿維·螺螨酯和15%噠螨靈對冷杉納氏癭螨的防治效果更好。

表2 施藥和釋放天敵前后香榧葉片上冷杉納氏癭螨的蟲口密度和防治效果Table 2 Population density of N.abiesis on T.grandis ‘Merrillii’ leaves before and after chemical control and natural enemy release

室內(nèi)捕食螨的捕食效果表明，加州新小綏螨對冷杉納氏癭螨的卵、若螨和成螨均具有捕食功能，加州新小綏螨對9 張葉片上癭螨的捕食率為95.45%～100%。林間釋放加州新小綏螨時，其蟲口減退率和防治食效果僅為26.25%和55.93%，低于室內(nèi)測定結(jié)果，也低于4 種化學農(nóng)藥的林間測定結(jié)果。很有可能是香榧葉片上冷杉納氏癭螨的蟲口密度太大，釋放加州新小綏螨難以捕食掉所有的害螨。因此，生產(chǎn)中應將捕食螨與化學農(nóng)藥聯(lián)合使用，先施用21%阿維·螺螨酯或15%噠螨靈，將蟲口密度降低下來，然后再釋放加州新小綏螨。

3 結(jié)論與討論

本研究采用形態(tài)學結(jié)合分子生物學的方法對香榧癭螨進行物種鑒定，明確了危害香榧的癭螨為冷杉納氏癭螨，研究結(jié)果可為冷杉納氏癭螨的快速鑒定提供參考。系統(tǒng)發(fā)育分析表明，冷杉納氏癭螨與三毛癭螨屬、納氏癭螨屬、博氏癭螨屬和Setoptus屬的7 個物種/憑證樣本間親緣關(guān)系近，而所有8 個癭螨物種/憑證樣本的寄主植物都是裸子植物門Gymnospermae 的針葉樹種，揭示癭螨物種的進化與寄主植物相關(guān)聯(lián)。

香榧是一種壽命很長的四季常綠的針葉樹種[2]，長壽命和冬季不落葉的特性為冷杉納氏癭螨的寄生提供了穩(wěn)定的環(huán)境條件。冷杉納氏癭螨個體微小，人眼難以觀察到，加上早期的危害癥狀不明顯，這為冷杉納氏癭螨通過種苗或嫁接繁殖體遠距離傳播和擴散創(chuàng)造了條件。自2002 年首次在浙江省發(fā)現(xiàn)冷杉納氏癭螨危害以來，該害螨在浙江省迅速擴散和蔓延。目前，浙江省的絕大多數(shù)種植區(qū)的香榧都遭受癭螨的危害。癭螨危害致使香榧葉片失綠，嚴重者葉片大量脫落，甚至整株死亡[11,17]。如何高效地防控冷杉納氏癭螨，成為生產(chǎn)中需要解決的一個關(guān)鍵問題。本研究通過林間生物測定法，測定了4 種殺螨劑和1 種捕食螨在林間的防治效果。4 種化學農(nóng)藥中，21%阿維·螺螨酯和15%噠螨靈在推薦濃度下的防治效果均超過87.00%，高于另外2 種化學農(nóng)藥。因此，21%阿維·螺螨酯和15%噠螨靈的防治效果更好。生產(chǎn)中可以將這2 種化學農(nóng)藥交替使用，防止冷杉納氏癭螨產(chǎn)生抗藥性。另外，本研究選擇在香榧果實采收后施藥，避免了化學農(nóng)藥對香榧果實的污染，保障了可食用林產(chǎn)品的品質(zhì)。

加州新小綏螨對冷杉納氏癭螨的卵、若螨和成螨均具有捕食功能，其在林間的防治效果為55.93%。生產(chǎn)中應將加州新小綏螨與化學農(nóng)藥聯(lián)合使用，先施用化學農(nóng)藥降低冷杉納氏癭螨的蟲口密度，然后再釋放加州新小綏螨，利用捕食螨主動搜尋獵物的功能，將葉片上殘存的害螨清除掉，從而達到高效防控冷杉納氏癭螨的目的。

致謝：本研究中癭螨物種的形態(tài)學鑒定得到廣西大學王國全教授和貴州大學乙天慈教授的幫助，謹此致謝。