傅芮瑩 劉辛迪 梁遠(yuǎn)征 劉雪琳 王亮

作者單位：100730 北京 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院血液內(nèi)科

結(jié)外NK/T細(xì)胞淋巴瘤（extranodal NK/T-cell lymphoma，ENKTCL）是一種與EB病毒（epstein-barr virus，EBV）密切相關(guān)的惡性淋巴瘤，在我國占所有類型淋巴瘤的5%～10%［1］。早期ENKTCL的5年生存率達80%以上，但初治晚期及復(fù)發(fā)難治患者預(yù)后仍較差，有待探索新的治療靶點［2-3］。糖酵解代謝活躍是惡性腫瘤顯著的特征之一，既往研究表明，在ENKTCL患者中，治療前空腹血糖（fasting blood glucose，F(xiàn)BG）水平較高的患者治療緩解率較低，生存狀況更差［4］，而這可能與淋巴瘤細(xì)胞內(nèi)的Warburg效應(yīng)密切相關(guān)［5］。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是重要的基因表達調(diào)控因子，近年來研究證實lncRNA與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，其中多種lncRNA介導(dǎo)腫瘤糖酵解通路的激活［6-7］。本團隊前期研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA BCYRN1過表達與ENKTCL患者預(yù)后不良密切相關(guān)，且干擾BCYRN1可顯著抑制淋巴瘤細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［8］。但BCYRN1是否通過激活ENKTCL糖酵解而促進腫瘤增殖目前尚未明確?；诖?，本研究通過構(gòu)建過表達及干擾BCYRN1的ENKTCL細(xì)胞株，并檢測其葡萄糖的攝取水平、乳酸生成水平以及與糖酵解通路相關(guān)分子的表達水平，同時初步探索BCYRN1促進糖酵解激活的可能機制，以期為靶向代謝重編程治療ENKTCL提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

1.1.1 細(xì)胞及試劑耗材 人ENKTCL細(xì)胞株SNK-6由中山大學(xué)腫瘤防治中心貝錦新教授饋贈。RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清購自北京細(xì)工生物科技有限公司，IL-2購自Sigma-Aldrich公司，谷氨酰胺、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素購自美國Gibco公司；蛋白合成抑制劑放線菌酮（Cycloheximide，CHX）購自阿拉丁試劑（上海）有限公司，溶酶體抑制劑Leupeptin和溶酶體激活劑6-Aminonicotinamide（6-AN）購自MedChem-Express公司；Screen QuestTM比色法葡萄糖攝取檢測試劑盒、乳酸檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；反轉(zhuǎn)錄及qRT-PCR試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司，SYBR Green qPCR SuperMix購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司，定量PCR儀（ABI PRISM?7500 Sequence Detection System）、轉(zhuǎn)錄試劑盒（MEGAshortscriptTMT7）購自Invitrogen公司，PierceTMRNA 3′端生物素化試劑盒、M-PERTM哺乳動物蛋白抽提試劑購自Thermo Scientific公司；RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀（RIP）試劑盒購自廣州吉賽生物科技股份有限公司；抗PKM（1∶1 000）、HIF1A（1∶800）、SLC2A1（1∶1 000）、LDHA（1∶1 200）、PDK1（1∶1 000）、pAKT1（1∶800）、山羊抗兔IgG抗體等均購自武漢博士德生物技術(shù)公司，GAPDH抗體（1：10 000）購自Abcam公司。

1.1.2 臨床資料 收集2010—2021年于首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院住院的236例初治ENKTCL患者信息。所有患者均根據(jù)造血與淋巴組織腫瘤WHO分類（2016年版）［9］確診為ENKTCL，臨床資料完整，并接受以門冬酰胺酶為基礎(chǔ)的化療方案治療。其中，男性166例，女性70例；中位年齡46（12～86）歲；Ann-Arbor分期Ⅰ～Ⅱ期156例，Ⅲ～Ⅳ期80例；按照列線圖修正版風(fēng)險指數(shù)（nomogram-revised risk index，NRI）：低危42例，低中危28例，中高危70例，高危62例，極高危34例。所有患者均有FBG數(shù)值。選取32例早期初診患者的石蠟包埋組織（FFPE）用于后續(xù)實驗。本研究獲首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)（文件編號為TRECKY2020-022），因本研究全部采用匿名處理，不暴露患者隱私信息，故免除患者的知情同意。

1.2 方法

1.2.1 SNK-6細(xì)胞培養(yǎng) SNK-6細(xì)胞用含10%胎牛血清、80 ng/mL IL-2、2 mmoL/L谷氨酰胺及1%雙抗（100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素）的RPMI-1640培養(yǎng)基，置于37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，隔日更換新鮮培養(yǎng)液，待細(xì)胞融合率達到80%～90%時傳代。收集對數(shù)生長期細(xì)胞進行后續(xù)實驗。

1.2.2 質(zhì)粒構(gòu)建及細(xì)胞轉(zhuǎn)染BCYRN1基因（NR_001568.1）序列由蘇州泓迅生物科技股份有限公司合成，5′端添加 HindIII酶切位點，3′端添加 XhoI酶切位點，并將合成序列鏈接到pcDNA3.0載體，命名為OE-BCYRN1；以pcDNA3.0空載作為對照質(zhì)粒，命名為OE-CTRL。設(shè)計合成BCYRN1干擾序列5′-TAAGCGTAACTTCCCTCAAAG-3′，通過發(fā)夾結(jié)構(gòu)，在 5′端添加AgeI酶切位點，3′端添加EcoRI酶切位點，并將合成序列鏈接到pLKO.1-puro載體，命名為shBCYRN1；以pLKO.1-puro空載作為對照質(zhì)粒，命名為shCTRL。SNK-6細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染BCYRN1過表達質(zhì)粒（OE-BCYRN1組）、BCYRN1干擾質(zhì)粒（shBCYRN1組）以及相應(yīng)空白質(zhì)粒（OE-CTRL組和shCTRL組），以不做任何處理的細(xì)胞作為空白對照組（Control組）。轉(zhuǎn)染步驟依據(jù)LipofectamineTM2000試劑盒說明書進行。

1.2.3 葡萄糖攝取檢測及乳酸生成量檢測 采用Screen QuestTM比色法葡萄糖攝取檢測試劑盒進行葡萄糖攝取檢測。轉(zhuǎn)染72 h后，調(diào)整各組細(xì)胞密度為5×104/孔，接種于96孔培養(yǎng)板6 h后，每孔加入葡萄糖攝取緩沖液90 μL，孵育1 h；每孔加入10 μL的2-脫氧葡萄糖（2-DG）溶液，孵育40 min后去培養(yǎng)上清，加入25 μL的酸性裂解液，孵育20 min后加入50 μL的2-DG攝取工作液，室溫下避光孵育1 h，然后采用熒光酶標(biāo)儀在570 nm/610 nm處測定吸光比值。

采用乳酸檢測試劑盒進行乳酸生成量檢測。不同處理組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后收集上清。在空白管加入0.02 mL雙蒸水、1 mL酶工作液和0.2 mL顯色劑；在標(biāo)準(zhǔn)管加入3 mmol/L標(biāo)準(zhǔn)品、1 mL酶工作液和0.2 mL顯色劑；在測定管加入待測樣品、1 mL酶工作液和0.2 mL顯色劑。混勻后于37℃水浴鍋中反應(yīng)10 min，然后加入2 mL終止液，在波長530 nm處測定光密度（OD）值，計算絕對OD值=樣品測定OD值-空白OD值，然后代入由6 mmol/L的乳酸標(biāo)準(zhǔn)品繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算樣品的乳酸量。

1.2.4 qRT-PCR檢測基因表達水平 采用TRIzol試劑盒提取ENKTCL組織及SNK-6細(xì)胞中的總RNA。根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA，按照qRT-PCR試劑盒說明書進行反應(yīng)。PCR反應(yīng)條件如下：95℃5 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 32 s，40 個循環(huán)；融解曲線分析：60～95℃。每個樣本重復(fù)3次。引物序列如表1所示。以GAPDH作為BCYRN1基因的內(nèi)參，β-actin作為PKM2、HIF-1α、SLC2A1、LDHA、PDK1基因的內(nèi)參。采用2-△△Ct法計算目的基因的相對表達量。

表1 檢測基因的引物信息以及片段大小Tab.1 The primer information and fragment size for genes detected

1.2.5 Western blot檢測蛋白表達水平 收集各組SNK-6細(xì)胞，提取總蛋白，BCA試劑盒測定蛋白濃度。每個樣品上樣20 μg蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳、轉(zhuǎn)PVDF膜，5%脫脂奶粉-TBS封閉，分別加入相關(guān)一抗，4℃孵育過夜；次日25 mL TBST洗滌PVDF膜3次，每次5 min，加入二抗山羊抗兔IgG抗體（1∶20 000），室溫孵育40 min，25 mL TBST洗滌PVDF膜3次，每次7 min，然后顯影、拍照。以GAPDH作為內(nèi)參，用Image-Pro Plus 6.0軟件測定蛋白灰度值。

1.2.6 RNA pull-down實驗 BCYRN1正義鏈和反向互補序列逆轉(zhuǎn)錄后，純化RNA并進行生物素標(biāo)記。采用蛋白抽提試劑提取蛋白。將上述生物素標(biāo)記的RNA（50 pmoL）、無生物素標(biāo)記的RNA（50 pmoL）與鏈霉親和素磁珠（50 μL）在室溫下攪拌孵育15～30 min后，置于磁力架，收集磁珠。在磁珠中添加10 μL的10×蛋白-RNA結(jié)合緩沖液，30 μL的50%丙三醇，15 μL的活性蛋白（2 mg/mL）以及45 μL的無核酸酶純水，于4℃、10 r/min旋轉(zhuǎn)反應(yīng)過夜。收集磁珠，棄上清液。采用100 μL漂洗液清洗磁珠2～3次，加入50 μL洗脫液，渦旋混勻，37℃孵育30 min。反應(yīng)結(jié)束后，置于磁力架，收集上清，進行Western blot檢測。

1.2.7 RIP實驗 實驗分為shCTRL組和shBCYRN1組。轉(zhuǎn)染48 h后，每組收集1×107個細(xì)胞加入1 mL裂解液冰上裂解10 min，離心取上清。取100 μL上清作為陽性對照。剩余900 μL上清加入100 μL蛋白A/G磁珠，反應(yīng)10 min后置于磁力架并取上清。取200 μL蛋白A/G磁珠，洗滌后加入1 mL裂解液，充分混勻，然后分為2份，每份500 μL，分別標(biāo)記為RIP管和IgG管。向RIP管中加入5 μg PKM2抗體，IgG管中加入5 μg IgG抗體，反應(yīng)后收集磁珠。分別往RIP管和IgG管中加入350 μL裂解液和450 μL細(xì)胞裂解液，反應(yīng)結(jié)束后收集磁珠并將上述處理好的樣品，包括陽性對照、RIP管以及IgG管樣本，采用離心柱法提取總RNA。洗脫純化的RNA采用qRT-PCR進行檢測。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

計量數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，平均值來自至少3個獨立的實驗結(jié)果。呈正態(tài)分布的兩組計量資料比較采用獨立樣本t檢驗。多組比較采用單因素方差分析，若差異有統(tǒng)計學(xué)意義，則采用tukey檢驗進行多重比較。檢驗水準(zhǔn)為α=0.05。生存數(shù)據(jù)采用SPSS 20軟件進行分析，采用log-rank檢驗其統(tǒng)計學(xué)差異。圖像處理采用GraphPad Prism 5。對于ENKTCL患者，無進展生存（progression-free survival，PFS）時間從診斷之日開始計算，直至疾病進展、死亡或末次隨訪日期。

2 結(jié)果

2.1 FBG及BCYRN1表達水平與ENKTCL患者預(yù)后密切相關(guān)

根據(jù)文獻［4］，將FBG＞5.6 mmol/L定義為高血糖組，F(xiàn)BG≤5.6 mmol/L定義為正常血糖組。入組的236例初診ENKTCL中，根據(jù)基線FBG水平，高血糖組49例，正常血糖組187例，兩組患者的基線資料具有可比性（P＞0.05）。Kaplan-Meier生存曲線顯示，正常血糖組5年P(guān)FS率高于高血糖組（63.7%vs32.1%，log-rankP＜0.001），見圖1A。根據(jù)32例早期ENKTCL患者病理組織中BCYRN1的表達水平進行排序，選擇中位值1.72作為截斷值，并分為BCYRN1高表達組（＞1.72）及BCYRN1低表達組（≤1.72），每組16例。兩組患者的性別、年齡等基線資料具有可比性（P＞0.05）。Kaplan-Meier生存曲線顯示，BCYRN1高表達組3年P(guān)FS率低于低表達組（26.1%vs82.5%，log-rankP=0.014），見圖1B。上述結(jié)果提示FBG水平與ENKTCL患者預(yù)后相關(guān)，BCYRN1高表達與患者預(yù)后較差相關(guān)。

圖1 ENKTCL患者的生存曲線Fig.1 Survival curves of ENKTCL patients

2.2 BCYRN1表達影響SNK-6細(xì)胞對葡萄糖的攝取和乳酸生成的水平

與Control組和shCTRL組比較，shBCYRN1組SNK-6細(xì)胞對葡萄糖的攝取量顯著降低（均P＜0.05），見圖2A；乳酸生成水平也顯著降低（均P＜0.05），見圖2B。提示BCYRN1參與了ENKTCL對葡萄糖代謝的途徑，尤其是糖酵解途徑。

圖2 干擾BCYRN1表達對SNK-6細(xì)胞葡萄糖攝取和乳酸生成能力的影響Fig.2 Effects of interference with BCYRN1 expression on glucose uptake and lactate production of SNK-6 cells

2.3 BCYRN1表達影響ENKTCL糖酵解通路關(guān)鍵分子的表達水平

采用qRT-PCR檢測糖酵解通路常見關(guān)鍵分子的表達情況，結(jié)果顯示，OE-BCYRN1組SNK-6細(xì)胞中BCYRN1表達量較Control組和OE-CTRL組顯著增高（均P＜0.001），而shBCYRN1組表達量較Control組和shCTRL組顯著降低（均P＜0.001），見圖3A，提示細(xì)胞轉(zhuǎn)染成功。如圖3B-F所示，與Control組及OE-CTRL組或shCTRL組比較，糖酵解關(guān)鍵分子PKM2、HIF-1α、SLC2A1、LDHA和PDK1的基因表達量在OE-BCYRN1組中顯著升高（均P＜0.05），而在shBCYRN1組中顯著降低（均P＜0.01），提示過表達BCYRN1可顯著上調(diào)糖酵解通路相關(guān)分子的基因表達水平。

圖3 qRT-PCR檢測SNK-6細(xì)胞中BCYRN1及糖酵解關(guān)鍵分子的基因表達水平Fig.3 Gene expression levels of BCYRN1 and key glycolysis molecules in SNK-6 cells detected by qRT-PCR

在蛋白表達層面，Western blot檢測結(jié)果如圖4所示，OE-BCYRN1組中PKM2、HIF-1α、SLC2A1、LDHA、PDK1、p-AKT蛋白表達水平均顯著高于Control組和OE-CTRL組（均P＜0.01），而shBCYRN1組各分子的蛋白表達水平則顯著低于Control組和shCTRL組（均P＜0.05），提示過表達BCYRN1可顯著上調(diào)糖酵解通路相關(guān)分子的蛋白表達水平。

圖4 Western blot檢測SNK-6細(xì)胞中糖酵解關(guān)鍵分子的蛋白表達水平Fig.4 Protein expression levels of key glycolysis molecules in SNK-6 cells detected by Western blot

2.4 BCYRN1可減少溶酶體對PKM2的降解而增強PKM2蛋白的穩(wěn)定性

應(yīng)用蛋白合成抑制劑（CHX）分別處理不同組別 SNK-6細(xì)胞0 h、3 h、6 h，然后采用Western blot檢測PKM2的蛋白表達水平。如圖5A，C所示，在0 h時，PKM2在OE-BCYRN1組中的蛋白表達量高于OE-CTRL組，而在shBCYRN1組中的表達量低于shCTRL組；經(jīng)CHX處理3 h或6 h后，所有組別PKM2的蛋白表達量均較0 h明顯降低，提示在抑制蛋白合成后，現(xiàn)存PKM2蛋白會通過某種途徑發(fā)生降解。如圖5B，D所示，與各自對照組相比，OE-BCYRN1組中PKM2的降解比例顯著降低（均P＜0.05），而shBCYRN1組中PKM2的降解比例顯著升高（均P＜0.05），提示BCYRN1可減少PKM2的降解，從而起到穩(wěn)定PKM2蛋白的作用。

在shBCYRN1組中添加溶酶體抑制劑（Leupeptin）、OE-BCYRN1組添加溶酶體激活劑（6-AN）分別處理0 h、4 h、8 h。結(jié)果顯示，處理4 h和8 h后，shBCYRN1+Leupeptin組PKM2蛋白的降解比例均較shBCYRN1組明顯下降（均P＜0.01），見圖5E～F；OE-BCYRN1+6-AN組PKM2蛋白的降解比例均較OE-BCYRN1組顯著增加（均P＜0.001），見圖5G～H，提示PKM2蛋白通過溶酶體途徑進行降解。

圖5 BCYRN1通過減少溶酶體對PKM2的降解而增強PKM2蛋白穩(wěn)定性Fig.5 BCYRN1 enhanced PKM2 protein stability by reducing lysosomal degradation of PKM2

2.5 BCYRN1通過與PKM2蛋白直接相互作用調(diào)控其蛋白穩(wěn)定性

采用RNA pull-down實驗驗證PKM2蛋白是否與正義或反義BCYRN1基因相結(jié)合。Western blot檢測結(jié)果顯示，PKM2蛋白與正義BCYRN1基因相結(jié)合，與反義BCYRN1基因不結(jié)合；干擾BCYRN1表達后，相結(jié)合的PKM2蛋白相應(yīng)減少（P=0.006），見圖6A～B。進一步采用RIP實驗驗證BCYRN1基因與PKM2蛋白的直接相互作用。qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，經(jīng)PKM2抗體沉淀下來的基因可檢測到BCYRN1的存在，在干擾BCYRN1表達的SNK-6細(xì)胞中，RIP實驗檢測到的PKM2水平也顯著降低（P=0.007），見圖6C。上述結(jié)果提示，BCYRN1基因可與PKM2蛋白發(fā)生直接相互作用。

圖6 RNA pull-down和RIP實驗證實BCYRN1與PKM2蛋白直接相互作用Fig.6 RNA pull-down and RIP experiments confirmed direct interaction between BCYRN1 and PKM2 protein

3 討論

惡性腫瘤無論氧氣充足與否均選擇糖酵解途徑，消耗大量葡萄糖并生成乳酸，這一現(xiàn)象被稱為Warburg效應(yīng)或有氧糖酵解［10］。研究表明，干擾腫瘤細(xì)胞的Warburg效應(yīng)能顯著抑制細(xì)胞增殖和侵襲轉(zhuǎn)移效應(yīng)［5］。與既往研究［4］結(jié)果相似，本研究亦在236例ENKTCL患者中證實了高水平FBG與不良預(yù)后的相關(guān)性，且其機制可能與淋巴瘤細(xì)胞內(nèi)的Warburg效應(yīng)密切相關(guān)。因此，揭示ENKTCL發(fā)生發(fā)展過程中調(diào)控Warburg效應(yīng)的關(guān)鍵分子，不僅有利于尋找ENKTCL演變過程中關(guān)鍵的分子標(biāo)志，為早期診斷提供幫助，也可為ENKTCL的預(yù)防和治療開辟新的途徑。

大量研究已證實lncRNA與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［11-12］。本團隊前期研究發(fā)現(xiàn)lncRNA BCYRN1在耐藥ENKTCL組織中高表達且與不良預(yù)后顯著相關(guān)，且可通過促進自噬進而介導(dǎo)ENKTCL對門冬酰胺酶化療耐藥［8］。本研究在32例早期初診ENKTCL組織中同樣證實了BCYRN1高表達水平與較差的PFS密切相關(guān)，說明BCYRN1可能是ENKTCL潛在的預(yù)后生物標(biāo)志物和治療靶點。然而，BCYRN1促進ENKTCL增殖及介導(dǎo)耐藥的機制較復(fù)雜，既往有研究顯示lncRNA可介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞糖酵解激活［6-7］。為了進一步探索BCYRN1是否影響ENKTCL的糖代謝，本研究首先將SNK-6細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒和shBCYRN1質(zhì)粒，然后檢測不同組別SNK-6細(xì)胞的葡萄糖攝取能力及乳酸生成能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在干擾BCYRN1的SNK-6細(xì)胞中葡萄糖的攝取能力降低，乳酸生成能力也顯著受影響，提示BCYRN1可能參與了ENKTCL的糖酵解激活作用。

在上述實驗中觀察到BCYRN1影響ENKTCL糖代謝后，本研究進一步探索BCYRN1是否影響糖酵解通路常見關(guān)鍵分子PKM2、HIF-1α、SLC2A1、LDHA和PDK1的表達。丙酮酸激酶（pyruvate kinase，PK）是糖酵解過程中的關(guān)鍵酶，作為PK最常見的兩個亞型之一，PKM2在腫瘤細(xì)胞中高表達［13］。PKM2是腫瘤代謝的關(guān)鍵酶，特異性地表達于多種腫瘤細(xì)胞系，抑制PKM2表達可降低腫瘤細(xì)胞攝取葡萄糖的能力，同時增加氧氣的消耗，以及降低乳酸的生成水平［14］。PKM2還可與HIF-1α結(jié)合并在轉(zhuǎn)錄水平活化SLC2A1、LDHA、PDK1等糖酵解相關(guān)基因的表達［15］。本研究在探討B(tài)CYRN1與PKM2等糖酵解關(guān)鍵酶的相關(guān)性中發(fā)現(xiàn)，SNK-6細(xì)胞過表達BCYRN1后，無論是基因?qū)用孢€是蛋白表達層面，與糖酵解相關(guān)的關(guān)鍵酶PKM2、HIF-1α、SLC2A1、LDHA及PDK1等表達均上調(diào)；相應(yīng)地，在干擾BCYRN1后，這些關(guān)鍵酶表達下調(diào)，這一結(jié)果提示BCYRN1可能介導(dǎo)了ENKTCL的糖酵解激活。翻譯后修飾對腫瘤細(xì)胞內(nèi)PKM2的表達水平和活性亦具有調(diào)節(jié)作用。既往研究顯示，乙?；竝CAF可乙酰化修飾PKM2的K305位點，該位點乙?；揎椇罂梢种芇KM2的激酶活性，進而通過溶酶體途徑進行降解［16-17］。此外，PKM2的多個位點發(fā)生磷酸化能改變其穩(wěn)定性［18-19］。本研究采用CHX抑制細(xì)胞內(nèi)的蛋白合成后，發(fā)現(xiàn)PKM2呈現(xiàn)時間依賴性降解，而過表達BCYRN1后能減慢PKM2蛋白的降解速度，提示BCYRN1可以穩(wěn)定PKM2蛋白。后續(xù)的溶酶體抑制及激活實驗也證實PKM2通過溶酶體途徑進行降解。因此推測，BCYRN1可能通過減少溶酶體對PKM2的降解而起到穩(wěn)定PKM2蛋白的作用。此外，本研究通過RNA pull-down和RIP實驗證實BCYRN1基因與PKM2蛋白直接結(jié)合而發(fā)揮穩(wěn)定PKM2蛋白的作用。

近年來腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment，TME）在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用受到高度重視［20］。細(xì)胞毒性T細(xì)胞等效應(yīng)T細(xì)胞的增殖和細(xì)胞因子的產(chǎn)生高度依賴于糖酵解，因此在較低葡萄糖水平和高乳酸濃度條件下這些細(xì)胞并不活躍。Treg細(xì)胞較少依賴糖酵解，主要依賴氧化磷酸化產(chǎn)生能量［21-22］。因此，TME中較高濃度的乳酸可降低效應(yīng)T細(xì)胞功能而不影響Treg細(xì)胞功能。本研究發(fā)現(xiàn)，表達BCYRN1的SNK-6細(xì)胞較shBCYRN1組對葡萄糖的攝取更高，且產(chǎn)生更高水平的乳酸，這可能造成TME中葡萄糖的相對缺乏及酸性環(huán)境，從而抑制機體的抗腫瘤免疫，最終造成免疫逃逸。PKM2通過其在Warburg效應(yīng)中的作用調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的代謝和功能。在腫瘤細(xì)胞中，PKM2二聚體可以移位到細(xì)胞核中穩(wěn)定HIF-1α并誘導(dǎo)糖酵解基因的表達［14］。PKM2還可進入到線粒體中，介導(dǎo)BCL-2的磷酸化和穩(wěn)定化，進而促進癌細(xì)胞適應(yīng)氧化應(yīng)激［23］。此外，PKM2通過誘導(dǎo)趨化因子，如CCL8、CCL2和CXCL1等因子的釋放，促進腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞和髓源性抑制細(xì)胞向TME募集［24］。這些細(xì)胞通過誘導(dǎo)Treg細(xì)胞和抑制NK細(xì)胞功能發(fā)揮免疫抑制功能，從而創(chuàng)造腫瘤免疫抑制微環(huán)境。本研究發(fā)現(xiàn)BCYRN1可以通過多種途徑上調(diào)PKM2的表達并增強PKM2蛋白的穩(wěn)定性，因此靶向BCYRN1或許可以通過調(diào)節(jié)糖酵解代謝改善機體的抗ENKTCL免疫，從而增強化療敏感性。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)BCYRN1過表達可以在一定程度上降低溶酶體對PKM2的降解，從而起到增強PKM2蛋白穩(wěn)定性的作用并最終促進PKM2激活ENKTCL糖酵解途徑。但是BCYRN1如何穩(wěn)定PKM2蛋白，BCYRN1與PKM2相互作用的具體位點以及ENKTCL過表達BCYRN1的具體作用機制等仍有待進一步闡明。

利益沖突：所有作者均不存在利益沖突。