王 攆 ，張豐盛 ，張勇平, ，宋少莉, ，楊 紅，王明偉,

1.上海師范大學化學與材料科學學院，上海 200234；

2.復旦大學附屬腫瘤醫(yī)院核醫(yī)學科，復旦大學上海醫(yī)學院腫瘤學系，上海 200032；

3.復旦大學生物醫(yī)學影像研究中心，上海 200032；

4.上海分子影像探針工程技術研究中心，上海 200032

中醫(yī)藥在抗腫瘤和抗病毒等方面歷史悠久，為了應對腫瘤和新型病毒對人類健康的威脅，中藥活性成分一直是新藥研發(fā)和創(chuàng)制的重要來源之一［1-2］。毛蘭素是名貴中藥材石斛的主要活性成分之一，它和其衍生物具有明顯的抗腫瘤活性，已經(jīng)成為抗癌藥物的重要研究方向［3-6］。Zhao等［7］設計合成了多種毛蘭素衍生物，發(fā)現(xiàn)其在體外對多種腫瘤細胞具有較強的抗增殖活性，比如乙氧基毛蘭素（ethoxylerianin，EBT）。Lam等［8］報道了一種毛蘭素衍生物ZJU-6，具有較強的抗增殖、促凋亡和抗血管生成的作用。然而，目前毛蘭素等中藥活性成分及其衍生物的作用評價主要為體外細胞毒性實驗，較少開展進一步的體內分布等藥代學評價。

傳統(tǒng)上，同位素標記示蹤技術常被用于開展藥物代謝等體內藥代學研究。隨著核醫(yī)學分子影像，特別是正電子發(fā)射體層成像（positron emission tomography，PET）/計算機體層成像（computed tomography，CT）的發(fā)展，正電子核素標記和PET/CT的聯(lián)合應用已經(jīng)成為現(xiàn)代新藥評價的最為有力的先進技術［9-10］。由于核素18F具有理想的物理和化學特性，如較長的半衰期（t1/2=109.7 min），其對應同位素氟（19F）又是-OH等多種基團的電子等排體，而且很多藥物分子結構本身含有氟原子，從化學分子結構上和18F標記物完全就是同一個化合物，因此18F標記和PET/CT就成為候選新藥體內效果評價的理想方式和發(fā)展趨勢［11-13］。

為了更好、更快地評價基于中藥活性成分衍生物的潛在抗腫瘤候選新藥，本文利用18F標記和PET/CT的現(xiàn)代先進技術，以具有抗腫瘤性質的毛蘭素衍生物氟乙氧基毛蘭素（fluoroethoxylerianin，F(xiàn)EE）為目標，開展其對應的18F標記化合物18F-FEE的合成條件優(yōu)化，并用小動物PET/CT進行可視化研究觀察其在正常小鼠與HepG2移植瘤模型的體內分布，為揭示FEE的體內藥代學特征提供直觀的參考。

1 資料和方法

1.1 主要儀器與試劑

儀器：采用德國Siemens公司的醫(yī)用回旋加速器Eclipse和小動物MicroPET/CT Inveon，美國Agilent公司的分析型HPLC 1200系列，配有可變波長紫外檢測器、Zorbax 300SB-C18分析柱（4.6×250 mm，5 μm），美國Capintec公司的放射性活度計CRC?-15PET，上海日環(huán)儀器設備有限公司的γ放射性免疫計數(shù)儀SN-697型，德國Raytest公司的放射性檢測器Gabi Star和放射性薄層色譜掃描儀miniGita Star，上海力辰邦西儀器科技有限公司的三用紫外分析儀ZF-1，杭州米歐儀器有限公司的恒溫金屬浴DKT200-1。

試劑：標記前體2-甲氧基甲氧基-甲苯磺酸-乙氧基-毛蘭素（2-methoxymethoxytolsylethoxylerianin，MMEE）、對照品19F-FEE（純度＞95%）是由上海應用技術大學吳范宏教授惠贈。K222（Kryptofix 222）、無水乙腈和無水碳酸鉀為美國Sigma-Aldrich公司產品；HPLC/光譜純乙腈為美國Tedia公司產品；N,N-二甲基甲酰胺（DMF，99.8%）、乙腈（99.9%）、二甲基亞砜（DMSO，99.7%）購自瑞士Adamas-Beta公司。

腫瘤細胞和模型：人肝癌細胞系HepG2購自于中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫/中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心，使用含10%FBS（美國Gibco公司）、1%谷氨酰胺、1%非必需氨基酸和1%丙酮酸鈉的MEM培養(yǎng)基，在CO2體積分數(shù)為5%的37 ℃潮濕環(huán)境下進行培養(yǎng)。實驗中所用到的5周齡BALB/c正常小鼠與裸小鼠均購自于上海靈暢生物科技有限公司，將處于對數(shù)增長期的HepG2細胞經(jīng)消化離心處理后，溶解于磷酸鹽緩沖生理鹽水（phosphate buffer saline，PBS）中，取0.1 mL（1×107個細胞）細胞懸液，注射在裸小鼠前肢腋窩皮下。待腫瘤生長至0.5～1.0 cm時，便可用于動物實驗。

1.2 18F-FEE的放射化學合成條件優(yōu)化

18F-FEE的放射化學合成路線如圖1所示。參考文獻［14］制備活化的18F-離子，經(jīng)無水乙腈溶解后用于條件優(yōu)化實驗。取一定量的18F-與前體MMEE溶液混合，置于恒溫金屬浴中加熱進行18F標記反應。達到反應時間后停止加熱，冷卻至室溫，取樣，用放射性薄層色譜法（radio-TLC）分析標記率，所用展開劑為乙酸乙酯/環(huán)己烷（V/V 1/4）。然后加入HCl溶液，加熱進行水解反應，達到反應時間后，進行取樣和radio-TLC分析，測量水解效率。

圖1 18F-FEE的放射化學合成與條件優(yōu)化

為了優(yōu)化18F-FEE的制備條件，本文針對標記反應和水解反應的多個實驗參數(shù)，分別設計了一系列條件實驗。對于第一步標記反應，考察標記率的影響因素包括時間、溫度、前體濃度與溶劑，對于第二步水解反應，考察水解效率的影響因素包括HCl濃度、時間與溫度。

1.3 18F-FEE的放射化學分析

根據(jù)優(yōu)化的放射化學合成條件，制備18F-FEE，用于后續(xù)實驗。為了分析18F-FEE的放射化學純度，本文采取了radio-TLC和放射性高效液相色譜法（radio-HPLC）兩種方法。對于radio-TLC分析，采用GF254硅膠板，展開劑為乙酸乙酯/環(huán)己烷（V/V 1/4）。對于radio-HPLC分析，流動相為水（含0.1%三氟乙酸，A）和乙腈（B）的混合液，其濃度梯度為0～10 min由50%A+50%B線性變?yōu)?0%A+70%B，到15 min時逐漸變?yōu)?0%A+90%B，直到20 min變?yōu)?0%A+50%B。同時，采取同樣的方法，分別分析參考品19F-FEE的TLC和HPLC，對其18F-FEE結果進行驗證。

1.4 生物分布

通過尾靜脈將18F-FEE溶液（3.7×106Bq，200 μL）注射到BALB/c小鼠體內，在注射后2、10、30、60 min等4個時間點（n=3），采取脫頸方式處死小鼠，解剖并獲取心、肝、脾、肺、腎、膀胱、肌肉、骨、腦、血液等，然后稱重，并用γ計數(shù)儀測量組織放射性，計算每克組織百分注射劑量率（%ID/g）。

1.5 MicroPET/CT

通過尾靜脈將18F-FEE溶液［（3.7～11.1）×106Bq，200 μL］注射到正常BALB/c小鼠和HepG2移植瘤模型小鼠體內（n=3），于注射后30、60、90 min進行MicroPET/CT，勾畫感興趣區(qū)，計算腫瘤和心、肝等主要器官的%ID/g和對應的腫瘤-肌肉比值（T/M）。

1.6 統(tǒng)計學處理

2 結 果

2.1 18F標記反應的條件優(yōu)化

2.1.1 反應時間對標記率的影響

將前體M M E E乙腈溶液（0.1 m L，20 mg/mL）與活化的18F-溶液（0.1 mL）在玻璃反應瓶內混合均勻，在反應溫度為120 ℃時分別反應10、20、30 min。反應時間對標記率的影響如圖2A所示，10 min時標記率已經(jīng)接近90%，隨時間延長僅略有增加，并且20和30 min的標記率與10 min的差異無統(tǒng)計學意義。因此，綜合考慮18F衰變和標記率，優(yōu)化的標記反應時間是10 min。

2.1.2 反應溫度對標記率的影響

前體MMEE溶液與18F-溶液的組成和用量同上2.1.1，在100、120和140 ℃均反應10 min（上述優(yōu)化的標記反應時間）。反應溫度對標記率的影響結果如圖2B所示，100 ℃時標記率為93%，而120 ℃時為92%，140 ℃時只有88%。由此可見，隨著溫度升高，標記率并未呈升高趨勢，同時三者之間差異無統(tǒng)計學意義。因此，綜合考慮標記率和高溫安全性，優(yōu)化的標記反應溫度是100 ℃。

2.1.3 前體濃度對標記率的影響

前體MMEE溶液與18F-溶液的組成和總體積同上2.1.1，加入一定量MMEE，使前體濃度分別為5、10和20 mg/mL，均在100 ℃下反應10 min（上述優(yōu)化的時間和溫度），考察前體濃度對標記率的影響。如圖2C所示，前體濃度為5、10 mg/mL時標記率均為92%，而濃度為20 mg/mL時為86%。由此可知，增大前體濃度，標記率并沒有明顯增加，同時三者之間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。因此，綜合考慮標記率和節(jié)約前體用量，優(yōu)化的前體反應濃度為5 mg/mL。

2.1.4 反應溶劑對標記率的影響

分別配制前體MMEE的乙腈、DMF和DMSO溶液（20 mg/mL），各取0.1 mL與活化的18F-溶液（0.1 mL）在玻璃反應瓶內混合均勻（需要指出的是，此處反應體系前體的實際濃度為10 mg/mL，與上述2.1.1和2.1.2保持一致），均在100 ℃反應10 min（上述優(yōu)化的溫度和時間），從而探究反應溶劑對標記率的影響。如圖2D所示，反應溶劑對標記率的影響比較明顯，溶劑為無水乙腈時標記率最高（93%），而DMF和DMSO為溶劑時標記率分別為86%和71%。因此，綜合考慮標記率和溶劑的低沸點和易揮發(fā)性等有利特性，優(yōu)化的反應溶劑為無水乙腈。

圖2 不同反應條件對標記率的影響

2.2 水解反應的條件優(yōu)化

2.2.1 反應時間對水解效率的影響

將標記反應混合液（0.1 mL）與HCl溶液（0.1 mL，6 mol/L）在玻璃反應瓶中混合均勻，在100 ℃下分別反應10、15、20 min，探究反應時間對水解效率的影響。如圖3A所示，反應時間為10 min時水解效率在38%，15、20 min時為48%，然而三者之間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），即延長反應時間對水解效率并沒有顯著影響。因此，綜合考慮18F衰變和水解效率，優(yōu)化的水解反應時間為10 min。

圖3 不同反應條件對水解效率的影響

2.2.2 反應溫度對水解效率的影響

標記反應混合液與HCl溶液的體積和組成同2.2.1，在80、100、120 ℃下均反應為10 min（上述的優(yōu)化時間），考察反應溫度對水解效率的影響。如圖3B所示，3種反應溫度的水解效率分別為38%、40%、41%，統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，80與120 ℃之間的水解效率差異有統(tǒng)計學意義，而100與120 ℃之間的差異無統(tǒng)計學意義。因此，綜合考慮水解效率和高溫安全性，優(yōu)化的水解反應溫度為100 ℃。

2.2.3 HCl濃度對水解效率的影響

取標記反應混合液（0.1 mL），吹干后分別加入不同濃度（3、6、12 mol/L）的HCl溶液（0.1 mL），均在100 ℃反應10 min（上述優(yōu)化的時間和溫度），考查HCl濃度對水解效率的影響。如圖3C所示，HCl濃度為6 mol/L時的水解效率最高（61%），而3和12 mol/L時的水解效率分別為22%和49%。因此，綜合考慮水解效率和高濃度HCl的揮發(fā)性，優(yōu)化的HCl濃度為6 mol/L。

2.3 18F-FEE放射化學純度及分析

根據(jù)上述標記反應和水解反應的優(yōu)化條件，成功制備了18F-FEE。圖4A是18F-FEE的radio-TLC譜圖，與參考品19F-FEE的比移值（Rf）一樣（圖4B，Rf值為0.4）。圖4C是18F-FEE的radio-HPLC譜圖，其保留時間（tR）=6.8 min，與參照物19F-FEE的保留時間匹配（tR=6 min）。根據(jù)18F-FEE的radio-TLC和Radio-HPLC圖譜可知，18F-FEE的放射化學純度大于95%以上，確保能夠用于后續(xù)體內試驗。

圖4 18F-FEE的放射化學分析

2.4 18F-FEE的體內生物分布

18F-FEE的正常小鼠體內生物分布如表1所示。注射后2 min，18F-FEE在心、肝、肺、腎等的%ID/g都到達最大值，然后從2 min到10 min再到30 min均在較大幅度地快速降低，而從30 min到60 min的降低幅度則較小。由表1可知，肝臟是18F-FEE的最主要分布組織，在所有時間點肝臟的%ID/g均最高，其次是腎臟，說明肝膽和泌尿系統(tǒng)均為18F-FEE的排泄途徑。同時，注射后60 min，18F-FEE在心臟和血液中的%ID/g分別為0.94±0.14和1.21±0.30，說明其血液系統(tǒng)的循環(huán)時間較長，其肺、肌肉等組織分布時間較長，這也是注射30 min后主要臟器%ID/g降幅較小的原因。因此，18F-FEE在主要器官均呈現(xiàn)快速的吸收和分布特征、先快后慢的清除特征。

表1 18F-FEE的正常小鼠體內生物分布

2.5 18F-FEE的體內MicroPET/CT

為了更加直觀連續(xù)觀察18F-FEE的體內分布性質，本文開展了注射后不同時間點18F-FEE的正常小鼠與HepG2肝癌移植瘤模型MicroPET/CT，分別如圖5、6所示。根據(jù)正常小鼠MicroPET/CT可知（圖5A），在注射后30、60和90 min，18F-FEE在小鼠體內主要分布于腸道和膀胱，說明其經(jīng)肝-腸和泌尿雙通道進行藥物代謝，與上述生物分布結果一致。為了進一步直接觀察比較18F-FEE在代表性臟器中的分布，圖5B是對應的定量值%ID/gmean。對比分析發(fā)現(xiàn)，在注射后的每個時間段，18F-FEE的心臟分布較低，肝臟與腎臟的較高，腸道和膀胱最高。隨著時間延長，18F-FEE在肝臟和腎臟等主要組織的%ID/gmean都呈下降趨勢，注射后30 min時肝、腎的%ID/g分別為4.1±0.38、3.1±0.57，90 min時分別降到了1.8±0.09、1.1±0.35。值得注意的是，18F-FEE的腸道停留時間較長，積累較多，30 min時腸道%ID/g為69.0±32.0，而90 min時仍達59.8±19.7。

圖5 18F-FEE的正常小鼠體內MicroPET/CT顯像與分析

根據(jù)18F-FEE的HepG2肝癌移植瘤模型MicroPET/CT可知，18F-FEE在正常組織內的分布與上述正常小鼠的生物分布和顯像結果一致。特別需要強調的是，18F-FEE的腫瘤分布較為明顯，注射后30、60和90 min的%ID/gmean分別為2.0±0.42、1.6±0.70和1.4±0.64，整體呈現(xiàn)緩慢下降趨勢，這與其它正常組織%ID/g的變化趨勢不一樣。同時，18F-FEE的腫瘤和肌肉的定量分布%ID/gmean的比值（T/M）隨著時間延長而增加，3個時間點的T/M分別為6.69±0.08、10.2±0.03和22.2±0.02。實驗結果表明，18F-FEE的腫瘤分布較高、停留時長較長。

圖6 18F-FEE 的HepG2移植瘤模型MicroPET/CT與分析

3 討 論

作為廣受關注的中藥活性成分的代表之一，毛蘭素及其衍生物作為潛在的抗癌新藥候選對象具有重要的研發(fā)價值。研究［7］發(fā)現(xiàn)，EBT比毛蘭素的抗腫瘤活性更大，并且其對應的磷酸化前藥（EBTP）水溶性更好，能夠通過破壞血管而抑制腫瘤生長［15］。由于特殊的氟效應，含氟的藥物分子往往具有更好的藥效和藥代學性質［12］，因此在EBT分子結構中引入氟原子設計而成的一種新型衍生物FEE具有較好的抗癌潛力。為了更為直觀地評價FEE的體內分布性質，本文探索了18F-FEE的18F標記方法及其制備條件，開展了MicroPET/CT可視化評價其體內分布的研究。

由于目前未見18F標記毛蘭素衍生物的研究報道，本文首先優(yōu)化建立18F-FEE的合成方法。合成18F-FEE的第一步是18F標記反應，其標記率是18F-FEE產率的首要決定因素，因此本文從反應時間、反應溫度、前體濃度和反應溶劑等4個主要影響因素優(yōu)化了標記條件。結果顯示，濃度為5.0 mg/mL的前體MMEE的乙腈溶液，與活化的18F-離子，在100 ℃下加熱反應10 min就能達到理想的標記率。對于第二步水解反應，本文從反應時間、反應溫度和HCl濃度3個關鍵的影響因素優(yōu)化了水解條件。結果顯示，中間體18F-FMEE在6 mol/L的HCl中，于100 ℃下加熱反應10 min即可實現(xiàn)高效的水解反應。根據(jù)上述標記反應和水解反應的優(yōu)化條件，本文成功制備了18F-FEE，其放射化學純度大于95%，便于開展后續(xù)的生物分布和MicroPET/CT等體內評價。

對于天然中藥活性成分進行化學結構改造，是發(fā)現(xiàn)和創(chuàng)制新藥的重要來源之一［2］。FEE是根據(jù)氟效應進行化學結構改變而成的EBT類似物，二者化學結構非常相似，又都是毛蘭素的衍生物，潛在的抑瘤能力更強。與以前側重體外評價篩選候選新藥不同，本研究聯(lián)合利用18F標記和PET/CT，發(fā)揮核素標記示蹤與PET/CT可視化的多重優(yōu)勢，首先嘗試評價18F-FEE的體內正常組織分布和腫瘤分布情況。正常小鼠的生物分布和MicroPET/CT顯示，18F-FEE主要分布于肝、腸、腎和膀胱等代謝組織，心、肺等組織的分布較低，提示FEE作為抗癌藥物具有較好的安全耐受性。特別重要的是，HepG2肝癌移植瘤模型MicroPET/CT發(fā)現(xiàn)，18F-FEE長時間廣泛分布于腫瘤組織，腫瘤%ID/gmean高，注射60 min后T/M高達10以上，提示FEE有望用于抗腫瘤治療。

綜上所述，本研究優(yōu)化建立了抗癌中藥活性成分毛蘭素衍生物18F-FEE的18F標記條件，同時利用MicroPET/CT探索了其體內正常組織分布和腫瘤組織分布情況。本研究發(fā)現(xiàn)，18F-FEE主要分布于肝、腸、腎等藥物代謝組織，而且其在腫瘤內分布廣泛，證實FEE抗腫瘤潛能大、安全耐受性好。總之，18F等正電子核素標記與PET/CT非常有利于天然活性中藥成分及其衍生物作為潛在抗癌藥物的評價，進而更快、更好地從中醫(yī)藥寶庫中發(fā)掘造福民眾健康的新藥。