戚啟瓊，韋倩妮，唐秋霞，莫培銘，張美林

（北海職業(yè)學(xué)院，廣西北海 536100）

柚子果肉口感好，柚子皮的活性成分多，但柚子皮味辛苦甘，其苦味在使用柚子皮制作產(chǎn)品時影響較大，因此在開發(fā)利用柚子皮制作果脯、果酒等產(chǎn)品時，需去除柚子皮的苦味物質(zhì)[1-2]。柚子皮味苦，但不同品種、不同部位的苦味程度差距較大，其中柚皮苷是主要苦味物質(zhì)。本文利用微生物乳桿菌發(fā)酵法去除柚子皮中的苦味物質(zhì)柚皮苷，通過接種、發(fā)酵培養(yǎng)，利用柚皮苷標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，紫外分光光度計于420 nm處測柚皮苷的含量，從而判定乳桿菌去除柚子皮中柚皮苷的效果[3-4]。

1 材料與方法

1.1 菌種

乳桿菌，上海保藏生物技術(shù)中心

1.2 材料

柚皮干，市售；纖維素酶、果膠酶，河南萬邦實(shí)業(yè)有限公司；蛋白胨、牛肉膏，北京奧星生物技術(shù)有限公司；葡萄糖、酵母浸膏，廣東環(huán)凱生物科技有限公司；硫酸鎂、磷酸氫二鉀、碳酸鈉、氫氧化鈉和鹽酸，廣東省化學(xué)試劑工程技術(shù)研究開發(fā)中心；一縮二乙二醇，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；柚皮苷標(biāo)準(zhǔn)品，標(biāo)準(zhǔn)品庫——中藥對照品。

1.3 儀器與設(shè)備

紫外分光光度計，上海翱藝儀器有限公司；超凈工作臺、高壓滅菌鍋，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；恒溫水浴鍋，上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；離心機(jī)，四川蜀科儀器有限公司；振蕩培養(yǎng)箱，金壇市宏華儀器廠。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 柚皮漿的配制

①柚子復(fù)水。柚子皮與蒸餾水的比例為1∶10，浸泡過夜。②打漿。將切成小塊的柚子皮放入破壁機(jī)加蒸餾水打成漿。③酶解。將打好的柚皮漿倒入燒杯，加入0.5%果膠酶和0.5%纖維素酶，放在45 ℃ 恒溫水浴鍋中酶解1 h，期間要不斷攪拌。④調(diào)節(jié)pH值。柚皮漿酶解完成后用1 mol/L碳酸鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至6.5。⑤滅菌。調(diào)節(jié)好pH值的柚皮漿放在高溫滅菌鍋中95 ℃滅菌15 min，冷卻至室溫，備用。

1.4.2 培養(yǎng)基的配制

稱取磷酸氫二鉀2 g、硫酸鎂0.2 g、葡萄糖20 g、蛋白胨10 g、牛肉膏5 g和酵母浸膏4 g，加1000 mL 蒸餾水?dāng)嚢枞芙?，? mol/L鹽酸溶液調(diào)整pH值至6.5，分裝到三角瓶中，包扎，于121 ℃滅菌 20 min。

1.4.3 活化、接種與發(fā)酵

將乳桿菌接入培養(yǎng)基后于振蕩培養(yǎng)箱中30 ℃ 180 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，得到乳桿菌種子液，調(diào)整乳桿菌溶液的OD值為0.359。在無菌操作下將乳酸桿菌液和已滅菌的柚皮漿接入培養(yǎng)基中，于振蕩培養(yǎng)箱中180 r/min振蕩培養(yǎng)24 h。

1.4.4 離心和檢測

取出1.4.3得到的發(fā)酵液，于離心機(jī)4000 r/min離心10 min，取上清液檢測柚皮苷含量。

1.4.5 制作柚皮苷標(biāo)準(zhǔn)曲線

（1）配制4 mol/L氫氧化鈉。稱取16 g氫氧化鈉于小燒杯中，加入少量蒸餾水使用玻璃棒攪拌進(jìn)行溶解，溶解后轉(zhuǎn)入100 mL容量瓶中，使用蒸餾水潤洗燒杯和玻璃棒，將潤洗的蒸餾水也轉(zhuǎn)入容量瓶中，反復(fù)操作兩次，最后定容到刻度線搖勻即可，備用。

（2）配制柚皮苷標(biāo)準(zhǔn)使用液。準(zhǔn)確稱取8 mg柚皮苷標(biāo)準(zhǔn)品置于小燒杯中，加入少量蒸餾水溶解，再轉(zhuǎn)入100 mL容量瓶中，使用少量蒸餾水沖洗小燒杯和玻璃棒，沖洗的蒸餾水也轉(zhuǎn)入容量瓶中，反復(fù)操作兩次，最后加蒸餾水定容至刻度線，搖勻備用。

（3）制作柚皮苷標(biāo)準(zhǔn)曲線。取6支具塞試管，分別加入0 mL、1 mL、2 mL、3 mL、4 mL和5 mL柚皮苷標(biāo)準(zhǔn)使用液，再加入5 mL、4 mL、3 mL、 2 mL、1 mL、0 mL空白液于試管中。分別加入 5 mL 90%二甘醇（一縮二乙二醇）和0.1 mL 4 mol/L氫氧化鈉，搖勻后置于40 ℃恒溫水浴鍋中顯色10 min，立即使用分光光度計在波長420 nm處測吸光度，以柚皮苷含量為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，得到柚皮苷標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖1[5]。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y= 0.2829x+0.0175，R2=0.9994。

圖1 柚皮苷標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.4.6 單因素試驗(yàn)設(shè)計

（1）乳桿菌添加量的單因素試驗(yàn)。準(zhǔn)備4個 100 mL的培養(yǎng)基，在4個培養(yǎng)基內(nèi)分別加入5%、10%、15%和20%的乳桿菌，再分別加入40%的柚皮漿在25 ℃下培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)完成后離心，取0.5 mL上清液，加入5 mL一縮二乙二醇和0.5 mL 1 mol/L NaOH溶液，搖勻后在30 ℃恒溫水浴中保溫顯色30 min，在440 nm波長下測吸光度值。測試時以0.5 mL蒸餾水加入同比例其他試劑作空白對照。同時做不加乳桿菌的柚皮漿的培養(yǎng)基搖瓶發(fā)酵。

（2）柚皮漿添加量的單因素試驗(yàn)。在4個培養(yǎng)基內(nèi)分別加入40%、50%、60%和70%的柚皮漿，再分別加入5%的乳桿菌在25 ℃下培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)完成后離心，取0.5 mL上清液，加入5 mL一縮二乙二醇和0.5 mL 1 mol/L NaOH溶液，搖勻后在30 ℃恒溫水浴中保溫顯色30 min，在440 nm波長下測吸光度值。測試時以0.5 mL蒸餾水加入同比例其他試劑作空白對照。同時做不加乳桿菌的柚皮漿的培養(yǎng)基搖瓶發(fā)酵。

（3）培養(yǎng)溫度的單因素試驗(yàn)。在4個培養(yǎng)基內(nèi)，分別加入40%的柚皮漿和5%的乳桿菌，分別在 25 ℃、30 ℃、35 ℃和40 ℃下培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)完成后離心，取0.5 mL上清液，加入5 mL一縮二乙二醇和0.5 mL 1 mol/L NaOH溶液，搖勻后在30 ℃恒溫水浴中保溫顯色30 min，在440 nm波長下測吸光度值。測試時以0.5 mL蒸餾水加入同比例其他試劑作空白對照。同時做不加乳桿菌的柚皮漿的培養(yǎng)基搖瓶發(fā)酵。

（4）培養(yǎng)時間的單因素試驗(yàn)。在4個培養(yǎng)基內(nèi)，分別加入40%的柚皮漿和5%的乳桿菌，在25 ℃下分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h和96 h，培養(yǎng)完成后離心，取0.5 mL上清液，加入5 mL一縮二乙二醇和 0.5 mL 1 mol/L NaOH溶液，搖勻后在30 ℃恒溫水浴中保溫顯色30 min，在440 nm波長下測吸光度值。測試時以0.5 mL蒸餾水加入同比例其他試劑作空白對照。同時做不加乳桿菌的柚皮漿的培養(yǎng)基搖瓶發(fā)酵。

1.4.7 柚皮苷降解率

柚皮苷降解率計算公式為：

2 結(jié)果與分析

2.1 乳桿菌添加量對柚皮苷降解率的影響

由表1可知，乳桿菌添加量為5%時，柚皮苷濃度最低，柚皮苷降解率最高。因此，加入乳桿菌添加量為5%時最優(yōu)。

表1 乳桿菌添加量對柚皮苷濃度的影響

2.2 柚皮漿添加量對柚皮苷降解率的影響

由表2可知，柚皮漿添加量為50%及以上時，乳桿菌不能將柚皮苷分解，發(fā)酵液中柚皮苷含量隨著柚皮漿添加量增加而上升。因此，在柚皮漿的添加量為40%時柚皮苷降低率最大，故柚皮漿添加量為40%時最優(yōu)。

表2 柚皮漿添加量對柚皮苷濃度的影響

2.3 培養(yǎng)溫度對柚皮苷降解率的影響

由表3可知，柚皮苷降解率隨著培養(yǎng)溫度的升高先升高后降低，當(dāng)培養(yǎng)溫度為35 ℃時，柚皮苷濃度最低，柚皮苷降解率最高。因此，在培養(yǎng)溫度為35 ℃時最優(yōu)。

表3 培養(yǎng)溫度對柚皮苷濃度的影響

2.4 培養(yǎng)時間對柚皮苷降解率的影響

由表4可知，柚皮苷降解率隨著培養(yǎng)時間的延長先升高后降低，培養(yǎng)時間為48 h時，柚皮苷濃度最低，柚皮苷降解率最高。因此，培養(yǎng)時間為48 h時最優(yōu)。

表4 培養(yǎng)時間對柚皮苷濃度的影響

3 結(jié)論

本文采用微生物法研究去除柚子皮的苦味，從乳桿菌添加量、柚皮漿添加量、培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時間4個方面進(jìn)行單因素試驗(yàn)得到去除柚子皮苦味的最佳條件。結(jié)果表明，當(dāng)乳桿菌添加量為5%、柚皮漿添加量為40%、培養(yǎng)溫度為35 ℃、培養(yǎng)時間為 48 h時為最優(yōu)方案。