張麗媛， 李家秋， 蔡錦威， 畢春華， 劉方花

(1)青島濱海學(xué)院醫(yī)學(xué)院 臨床醫(yī)學(xué)教研室，山東， 青島 266555；2)濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 腫瘤科，山東， 濰坊 261031)

胃癌(gastric cancer，GC)是起源于胃黏膜上皮的惡性腫瘤，根據(jù)國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)(International Agency for Research on Cancer，IARC)發(fā)布的2020年統(tǒng)計(jì)報(bào)告顯示，胃癌發(fā)病率在全球范圍內(nèi)居于第5位，死亡率為第4位[1]。我國(guó)胃癌發(fā)病率和死亡率均處于第3位，防治胃癌的形勢(shì)十分嚴(yán)峻。由于早期胃癌的癥狀常缺乏特異性且受各種條件的限制，胃癌早期診斷率較低，大多數(shù)病人首診即晚期。加上目前晚期胃癌缺乏有效性的治療手段，導(dǎo)致胃癌病人總體預(yù)后差，5年生存率很低[2]。因此，研究胃癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，探索新的早期診斷和治療胃癌的分子標(biāo)記物，有助于提高胃癌的早期確診率和有效控制其侵襲、轉(zhuǎn)移，降低死亡率，對(duì)于胃癌的防治具有非常重要的科學(xué)價(jià)值和臨床意義。

長(zhǎng)非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是長(zhǎng)度大于200個(gè)核苷酸的非編碼RNA[3]。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA在劑量補(bǔ)償效應(yīng)、表觀遺傳調(diào)控、細(xì)胞周期調(diào)控和細(xì)胞分化調(diào)控等眾多生命活動(dòng)中發(fā)揮了重要作用，參與了機(jī)體的各種生理與病理過程[4,5]，因此成為當(dāng)前腫瘤學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn),lncRNA KCNQ1OT1參與腫瘤的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移和抗凋亡等過程，并在不同腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[6,7]。甚至有研究顯示，它可調(diào)控糖酵解途徑[8]。對(duì)于腫瘤中l(wèi)ncRNA KCNQ1OT1作用的研究有望為腫瘤診療提供新的靶點(diǎn)。目前，KCNQ1OT1 在胃癌中的研究文獻(xiàn)報(bào)道較少，并且關(guān)于其表達(dá)和作用的結(jié)論缺乏一致性[9-10]。本研究通過癌癥基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas, TCGA)等公共數(shù)據(jù)庫(kù)綜合分析和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證KCNQ1OT1在胃癌中的表達(dá)及作用機(jī)制，為深入研究該基因功能提供線索，為分子靶向治療胃癌的臨床研究提供新的靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫(kù)的使用

1.1.1 GEPIA2數(shù)據(jù)庫(kù)分析 通過GEPIA2數(shù)據(jù)庫(kù)[11]Box Plot模塊檢索KCNQ1OT1在胃癌中的表達(dá)情況，匹配正常數(shù)據(jù)包含TCGA和GTEx數(shù)據(jù)，通過Stage Plot模塊分析KCNQ1OT1在胃癌不同階段的表達(dá)水平，通過Survival Analysis模塊分析KCNQ1OT1在胃癌中總生存期(overall survival，OS)及無病生存期(disease-free survival，DFS)等預(yù)后數(shù)據(jù)，在Correlation Analysis模塊通過Spearman相關(guān)系數(shù)分析前100個(gè)KCNQ1OT1相關(guān)基因，P<0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.1.2 TIMER2數(shù)據(jù)庫(kù)分析 通過TIMER2數(shù)據(jù)庫(kù)[12,13]Diff-Exp模塊分析KCNQ1OT1在腫瘤中的表達(dá)水平，運(yùn)用Survival模塊比較不同表達(dá)KCNQ1OT1組的總生存期，通過Correlation模塊運(yùn)用Spearman相關(guān)系數(shù)分析KCNQ1OT1基因表達(dá)與谷氨酰胺酶1(glutaminase 1, GLS1)之間的相關(guān)性，通過Gene模塊分析KCNQ1OT1與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)之間的相關(guān)性。免疫細(xì)胞包括CD8+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、B細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、NK細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，P<0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.1.3 UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)分析 通過UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)[14]分析KCNQ1OT1基因在胃癌及正常組織中的表達(dá)水平，比較KCNQ1OT1在胃癌不同分期、分級(jí)、病理類型、種族、年齡以及TP53突變狀態(tài)的表達(dá)情況，分析KCNQ1OT1在胃癌中的總生存期，P<0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.1.4 StarBase數(shù)據(jù)庫(kù)分析 通過StarBase數(shù)據(jù)庫(kù)[15]分析GLS在胃癌中的表達(dá)，以及KCNQ1OT1的表達(dá)與PD-L1(CD274)、GLS表達(dá)之間的相關(guān)性，P<0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.1.5 cBioPortal數(shù)據(jù)庫(kù)分析 通過cBioPortal數(shù)據(jù)庫(kù)[16,17]分析KCNQ1OT1的表達(dá)與GLS表達(dá)之間的相關(guān)性，P<0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.1.6 Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫(kù)分析 Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫(kù)[18]包含基因表達(dá)綜合(gene expression omnibus, GEO)和TCGA等數(shù)據(jù)，通過對(duì)該數(shù)據(jù)庫(kù)的挖掘，評(píng)估KCNQ1OT1表達(dá)的預(yù)后價(jià)值，包括總生存期(OS)、無病生存期(DFS)、首次進(jìn)展生存期(first progression survival, FP)和復(fù)發(fā)生存期(relapse survival, PPS)，P<0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.1.7 lnCAR數(shù)據(jù)庫(kù)分析 通過lnCAR數(shù)據(jù)庫(kù)[19]探索KCNQ1OT1的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，對(duì)前200個(gè)基因網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化，并進(jìn)行富集通路分析(kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG)。

1.1.8 DAVID分析 通過GEPIA2和lnCAR數(shù)據(jù)庫(kù)得到的KCNQ1OT1相關(guān)基因全部輸入DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)[20]進(jìn)行注釋、可視化和綜合分析，基因功能分析包括生物過程(biological process, BP)，分子功能(molecular function, MF)和細(xì)胞成分(cellular component, CC)，相關(guān)通路主要是KEGG途徑。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

細(xì)胞全部來源于中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心，使用DMEM或者1640培養(yǎng)基在含有5% CO2的 37 ℃ 細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)基中添加 10%胎牛血清以及 100 U/mL 青霉素和 100 μg/mL 鏈霉素，根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)及時(shí)更換培養(yǎng)液，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 siRNA干擾

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的胃癌細(xì)胞SGC7901和BGC823接種于6孔板中(1×105/孔)，貼壁過夜后，利用Lipofectamine RNAiMAX轉(zhuǎn)染目標(biāo)siRNA，轉(zhuǎn)染24 h后更換正常培養(yǎng)基，48 h后收集細(xì)胞進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。所用到的siRNA序列如下：NC-S:5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT3′, AS:5′-ACGUGA CACGUUCGGAGAATT-3′; KCN1OT1-siRNA-1#-S:5′-GCAACAGCUAUUCUUCAUATT3′, AS:5′-UAUG AAGAAUAGCUGUUGCTT-3′; KCN1OT1-siRNA-2#:S: 5′-GCCACAUCUAACACCUAUATT-3′, AS：5′-UAUAGGUGUUAGAUGUGGCTT-3′。

1.4 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，在6孔板中處理細(xì)胞后，重新消化種板，1 000個(gè)細(xì)胞/孔，每3 d換1次液，2周后用福爾馬林固定，結(jié)晶紫染色后計(jì)算克隆個(gè)數(shù)。

1.5 臺(tái)盼藍(lán)染色細(xì)胞計(jì)數(shù)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，在6孔板中處理細(xì)胞完成后，用0.4%臺(tái)盼藍(lán)染色，每d計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)，以培養(yǎng)時(shí)間為橫軸，細(xì)胞數(shù)為縱軸(對(duì)數(shù))，描繪細(xì)胞生長(zhǎng)曲線圖。

1.6 RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄

取處理好的細(xì)胞，加入Trizol提取總RNA。RNA定量后，使用高容量cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，取2 μg RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。

1.7 實(shí)時(shí)定量PCR

使用實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒，檢測(cè)KCNQ1OT1和GLS1的RNA表達(dá)水平。其中，α-微管蛋白(α-tubulin)作為內(nèi)參，引物序列如下：GLS1-F:5′-GCAACAGCGAGGGCAAAGA-3′,R:5′-TTCAACCTG GGATCAGACG-3′; KCNQ1OT1-F:5′-GATCTGCCCT GCTTACCTCTC-3′,R:5′-GTGAGTGACTGAAGGGGA TGA-3′; Tubulin-F:5′-GAAGCAGCAACCATGCGTG A-3′,R:5′-AAGGAATCATCTCCTCCCCCA-3′。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。應(yīng)用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用Student’st檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性分析，P<0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 KCNQ1OT1在胃癌中高表達(dá)且與預(yù)后不良相關(guān)

為了排除單一數(shù)據(jù)庫(kù)數(shù)據(jù)造成的結(jié)果偏倚，本研究利用TIMER和UALCAN兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)綜合分析了KCNQ1OT1的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)KCNQ1OT1在多種腫瘤類型中高表達(dá)，包括胃癌(Fig.1A, B)。而它對(duì)胃癌病人的預(yù)后的影響，通過GEPIA2、UALCAN和Kaplan Meier- plotter 3個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)分析，發(fā)現(xiàn)高表達(dá)KCNQ1OT1的胃癌病人總生存期(OS)、無病生存期(DFS) 、進(jìn)展生存期(FP)和復(fù)發(fā)生存期(PPS)均明顯縮短(Fig.1C, D, E)，提示高表達(dá)KCNQ1OT1的胃癌病人可能預(yù)后不良。因此，KCNQ1OT1在胃癌中可以作為一個(gè)診斷性和預(yù)后性的腫瘤標(biāo)記物。

Fig.1 Expression levels and prognostic value of KCNQ1OT1 in gastric cancer (A) The expression level of KCNQ1OT1 in different tumors or specific tumor subtypes was analyzed through the TIMER2 database. (B) The expression level of KCNQ1OT1 between normal and gastric cancer tissues in the UALCAN database (***P<0.001). (C) The prognostic value of KCNQ1OT1 was analyzed by GEPIA2 database (DFS, disease-free survival). (D) The prognostic value of KCNQ1OT1 was analyzed by UALCAN database (OS, overall survival). (E) The prognostic value of KCNQ1OT1 was analyzed by Kaplan-Meier Plotter database. (FP, first progression survival, PPS, relapse survival)

2.2 KCNQ1OT1與胃癌各種臨床因素密切相關(guān)

通過UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)，進(jìn)一步分析了KCNQ1OT1與胃癌各種臨床因素的相關(guān)性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，KCNQ1OT1在胃癌的不同分期、分級(jí)、不同病理類型、不同人種和不同年齡段中普遍高表達(dá)(Fig.2A-2E)，具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。適用于大部分胃癌病人的診斷，其中在年輕的胃癌病人中(21～40歲)顯著高于其他年齡段的胃癌病人(P<0.05)。更重要的是發(fā)現(xiàn)，KCNQ1OT1的表達(dá)與TP53的突變有一定相關(guān)性(P<0.05, Fig.2F)。這也部分揭示了KCNQ1OT1在胃癌中高表達(dá)的原因。

Fig.2 The correlation between the expression of KCNQ1OT1 and clinical factors in gastric cancer via UALCAN database (A) The expression of KCNQ1OT1 in different stages of gastric cancer (*P<0.05). (B) The expression of KCNQ1OT1 in different grades of gastric cancer (*P<0.05). (C) The expression of KCNQ1OT1 in different pathological types of gastric cancer (*P<0.05). (D) The expression of KCNQ1OT1 in different patient’s race (*P<0.05). (E) The expression of KCNQ1OT1 in different patient’s age (*P<0.05). (F) The expression of KCNQ1OT1 in different TP53 mutation status (*P<0.05)

2.3 KCNQ1OT1的表達(dá)與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)密切相關(guān)

本研究利用TIMER2數(shù)據(jù)庫(kù)分析了KCNQ1OT1的表達(dá)與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)之間的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，KCNQ1OT1的表達(dá)分別與CD4+T細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的浸潤(rùn)呈正相關(guān)關(guān)系，而與CD8+T細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和γδT細(xì)胞的浸潤(rùn)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(Fig.3A)。而且發(fā)現(xiàn)，KCNQ1OT1表達(dá)與程序性死亡配體-1(programmed death ligand-1, PD-L1(CD274))的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(Fig.3B-3D), 提示高表達(dá)KCNQ1OT1的胃癌病人可能不適合免疫檢查點(diǎn)治療。

Fig.3 The correlation between the expression of KCNQ1OT1 and immune factors in gastric cancer (A) Correlation analysis between KCNQ1OT1 expression and various immune cell infiltration levels via TIMER2 database. (B-D) The expression of KCNQ1OT1 was negatively correlated with the expression of PD-L1 (CD274) via different databases. (B, GEPIA2, C, TIMER2, D, StarBase)

2.4 KCNQ1OT1促進(jìn)胃癌腫瘤細(xì)胞的增殖能力

為了探索直接靶向KCNQ1OT1的可能性，本文研究了KCNQ1OT1在胃癌腫瘤細(xì)胞中的作用。首先檢測(cè)了KCNQ1OT1在胃癌腫瘤細(xì)胞系中的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，KCNQ1OT1在胃癌腫瘤細(xì)胞系中普遍高表達(dá)(Fig.4A)。隨后，應(yīng)用特異性的siRNA敲低KCNQ1OT1的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)胃癌腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)受到了明顯的抑制(Fig.4B-4D)。說明KCNQ1OT1能促進(jìn)胃癌腫瘤細(xì)胞的增殖能力，可作為1個(gè)新的分子靶點(diǎn)。

Fig.4 KCNQ1OT1 promotes the proliferation of gastric cancer cells (A) The relative expression of KCNQ1OT1 in gastric cancer cell lines by quantitative PCR assays. (B-D) Colony formation assays and growth curve were used to evaluate the proliferation of gastric cancer cells after knockdown of KCNQ1OT1 for 72 hours. Values are the mean ± SD of three determinations from separate experiments (*P<0.05)

2.5 KCNQ1OT1共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)富集通路分析

既然KCNQ1OT1在胃癌腫瘤細(xì)胞中發(fā)揮著重要的作用，本文想探索其發(fā)揮作用的具體機(jī)制。首先，在lnCAR數(shù)據(jù)庫(kù)中分析了KCNQ1OT1共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)(前200個(gè)基因)(Fig.5A)。并且發(fā)現(xiàn)KCNQ1OT1跟多種通路活性密切相關(guān)，最明顯的是代謝通路(Fig.5B)。本文合并GEPIA2(前100個(gè)基因)和lnCAR(前200個(gè)基因)2個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)的相關(guān)基因，進(jìn)行了基因功能分類(gene ontology, GO)和富集通路分析(KEGG)(Fig.5C-F)。有意思的是，結(jié)果顯示，KCNQ1OT1可能參與到谷氨酰胺代謝通路當(dāng)中。

Fig.5 Analysis of KCNQ1OT1 coexpression gene network (A) Analysis of KCNQ1OT1 coexpression network via lnCAR database. (B) KEGG analysis of the KCNQ1OT1 gene network via lnCAR database. (C-F) GO and KEGG analysis of the KCNQ1OT1 gene network using lnCAR and GEPIA2 data (BP, biological process, CC, cellular component, MF, molecular function, KEGG, Kyoto encyclopedia of genes and genomes)

2.6 KCNQ1OT1通過GLS1調(diào)控胃癌腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)

谷氨酰胺酶1(GLS1)是調(diào)控谷氨酰胺代謝最重要的酶。利用TIMER2和UALCAN兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)，綜合分析了GLS1的表達(dá)。發(fā)現(xiàn)GLS1在多種腫瘤類型中也高表達(dá)，包括胃癌(Fig.6A，B)，而高表達(dá)GLS1的胃癌病人也提示預(yù)后不良，總生存期(OS)、進(jìn)展生存期(FP)均明顯縮短(Fig.6C)。進(jìn)一步探索KCNQ1OT1是否是通過調(diào)控GLS1促進(jìn)胃癌腫瘤細(xì)胞的增殖？ TIMER2等數(shù)據(jù)庫(kù)顯示，KCNQ1OT1與GLS1 mRNA表達(dá)呈明顯正相關(guān)關(guān)系(Fig.6D-6F)。敲低KCNQ1OT1的表達(dá)，GLS1 mRNA確實(shí)明顯下調(diào)(Fig.6G)，在敲低KCNQ1OT1的同時(shí)過表達(dá)GLS1會(huì)部分逆轉(zhuǎn)對(duì)胃癌腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用(Fig.6H)。上述結(jié)果說明，KCNQ1OT1能通過調(diào)控GLS1表達(dá)促進(jìn)胃癌腫瘤細(xì)胞的增殖。

Fig.6 KCNQ1OT1 regulates the growth of gastric cancer cells through GLS1 (A) The expression level of GLS1 in different tumors or specific tumor subtypes was analyzed through the TIMER2 database. (B) The expression level of KCNQ1OT1 between normal and gastric cancer tissues in the StarBase database (***P<0.001). (C) The prognostic value of GLS1 was analyzed by Kaplan-Meier Plotter database (FP, first progression survival, OS, overall survival). (D-F) The expression of KCNQ1OT1 was positively correlated with the expression of GLS1 in gastric cancer via different databases (D, StarBase, E, cBio, F, TIMER2). (G) The relative expression of GLS1 mRNA was significantly downregulated after KCNQ1OT1 knockdown by quantitative PCR assays. (H) Overexpression of GLS1 can partially rescue the inhibitory effect on the growth of gastric cancer cells with KCNQ1OT1 knockdown. Values are the mean ± SD of three determinations from separate experiments (*P<0.05)

3 討論

胃癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)涉及多基因與多步驟的復(fù)雜過程[21]。我國(guó)的胃癌發(fā)病率明顯高于世界水平，雖然已經(jīng)在胃癌的診療方面取得了巨大進(jìn)步，但是大部分病人的預(yù)后仍然較差，需要進(jìn)一步研究胃癌的發(fā)病機(jī)制，發(fā)現(xiàn)新的分子靶點(diǎn)。多項(xiàng)研究[22-24]表明，長(zhǎng)非編碼RNA KCNQ1OT1在肝癌、肺癌、乳腺癌、膠質(zhì)瘤、黑色素瘤等多種類型腫瘤的進(jìn)程中存在表達(dá)異常，但是在胃癌中的研究文獻(xiàn)報(bào)道較少，并且關(guān)于其表達(dá)和作用的結(jié)論缺乏一致性。Feng等[9]研究表明，KCNQ1OT1在胃癌中低表達(dá)，過表達(dá)后可以抑制胃癌腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。而Zhong等[10]研究表明，KCNQ1OT1在胃癌中高表達(dá)，敲低后可以抑制胃癌腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。造成這種相反結(jié)論的原因可能是他們研究的病例數(shù)太少，取材有一定的片面性，并且研究的細(xì)胞也是不同的。本研究通過TCGA不同公共數(shù)據(jù)庫(kù)綜合分析了KCNQ1OT1的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，KCNQ1OT1在胃癌中普遍高表達(dá)，并且通過實(shí)驗(yàn)證明敲低后可以抑制胃癌腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。這些結(jié)論與Zhong等的研究結(jié)果一致。由于本文通過TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)分析了上千例胃癌病人KCNQ1OT1的表達(dá)，能夠較好地克服少量臨床病例造成的偏倚，更加真實(shí)的反映了KCNQ1OT1在胃癌中的表達(dá)水平。通過進(jìn)一步對(duì)KCNQ1OT1與胃癌病人臨床因素的相關(guān)性的生物信息學(xué)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，KCNQ1OT1在各種類型胃癌中普遍高表達(dá)，且KCNQ1OT1的表達(dá)與TP53的突變有一定相關(guān)性，這也解釋了KCNQ1OT1在胃癌高表達(dá)的部分原因。此外，本文通過生物信息學(xué)分析還發(fā)現(xiàn)，KCNQ1OT1與胃癌病人預(yù)后不良相關(guān)。由此表明，KCNQ1OT1在對(duì)胃癌不僅可以作為一種新型的診斷性的腫瘤標(biāo)記物，也可以作為一種預(yù)后性的腫瘤標(biāo)記物。

隨著免疫治療的研究進(jìn)展，特別是PD-L1/PD1抑制劑，胃癌也成為有望治愈的惡性腫瘤之一，但是需要篩選真正適合免疫治療的病人。腫瘤微環(huán)境中主要的成分是免疫細(xì)胞，這些免疫細(xì)胞跟腫瘤形成、進(jìn)展和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[25,26]。本文的研究發(fā)現(xiàn)，KCNQ1OT1的表達(dá)與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)也存在明顯的相關(guān)性，而更重要的是KCNQ1OT1的表達(dá)與PD-L1(CD274)的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。目前，應(yīng)用PD-L1抑制劑的條件是通過檢測(cè)PD-L1的表達(dá)含量以及腫瘤突變負(fù)荷(TMB)等條件，但是仍然存在較多的缺點(diǎn)[27,28]，造成符合條件的病人未取得理想的效果，而且漏掉了不符合這些條件反而能夠取得較好療效的病人。因此，需要更多的腫瘤標(biāo)記物去預(yù)測(cè)是否使用PD-L1抑制劑。而本文的研究提示：高表達(dá)KCNQ1OT1的胃癌病人有可能不適合應(yīng)用PD-L1抑制劑進(jìn)行治療，但是由于其表達(dá)與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)存在明顯的相關(guān)性，有可能適合其他類型的免疫治療。當(dāng)然這種假設(shè)需要進(jìn)一步的臨床實(shí)驗(yàn)去驗(yàn)證，從而幫助臨床找到真正適合免疫治療的胃癌病人。

谷氨酰胺代謝是惡性腫瘤存活的關(guān)鍵，特別是為腫瘤細(xì)胞的增殖及生物大分子合成方面具有十分重要的作用[29]。最新的研究顯示,相對(duì)于腫瘤微環(huán)境喜歡利用葡萄糖代謝，腫瘤細(xì)胞更加喜歡利用谷氨酰胺作為代謝原料[30]。谷氨酰胺酶1(glutaminase 1，GLS1)是一種代謝酶，在谷氨酰胺分解中發(fā)揮重要作用，GLS1常在高度增殖的癌細(xì)胞中過表達(dá)以滿足增強(qiáng)的谷氨酰胺代謝的需求[31]。目前，多項(xiàng)研究證實(shí)，GLS1是致癌過程中的重要靶點(diǎn)[32,33]。本研究通過生物信息學(xué)綜合分析了KCNQ1OT1在胃癌中可能發(fā)揮的作用機(jī)制，發(fā)現(xiàn)KCNQ1OT1與腫瘤代謝有密切的相關(guān)性，尤其是對(duì)谷氨酰胺代謝的影響。本文通過生物信息學(xué)和實(shí)驗(yàn)證明，KCNQ1OT1可以通過調(diào)節(jié)GLS1介導(dǎo)的谷氨酰胺代謝，促進(jìn)胃癌腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。有研究證實(shí)，KCNQ1OT1在結(jié)直腸癌中可以調(diào)控糖酵解途徑[34]。而本文是第一個(gè)報(bào)道KCNQ1OT1可調(diào)控谷氨酰胺代謝的研究。本研究進(jìn)一步豐富了關(guān)于KCNQ1OT1調(diào)控腫瘤代謝的理論。

本研究尚存在較多的局限性。例如，通過生物信息學(xué)進(jìn)行了分析，但是生物信息學(xué)本身由于算法等問題也可能存在一定的誤差，需要臨床數(shù)據(jù)進(jìn)行驗(yàn)證。另外，本研究尚存在幾個(gè)問題沒有解決：首先，TP53基因突變?yōu)槭裁丛斐闪薑CNQ1OT1表達(dá)的差異？KCNQ1OT1為什么與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)明顯相關(guān)，而與PD-L1的表達(dá)卻是負(fù)相關(guān)的？臨床病例中KCNQ1OT1對(duì)免疫治療的指導(dǎo)意義是怎樣的？KCNQ1OT1調(diào)控GLS1表達(dá)的具體機(jī)制是什么？這些問題將在后續(xù)的工作中進(jìn)行研究。總之，本研究通過生物信息學(xué)和分子實(shí)驗(yàn)揭示了KCNQ1OT1在胃癌組織中的表達(dá)及功能，提示KCNQ1OT1很可能通過調(diào)控GLS1介導(dǎo)的谷氨酰胺代謝來促進(jìn)胃癌的發(fā)生和發(fā)展，并導(dǎo)致胃癌病人預(yù)后不良，為深入研究該基因功能提供了線索，也為分子靶向治療胃癌的臨床研究提供了新的靶點(diǎn)和思路。