李炳軒， 黃 濤

(天津大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院結(jié)構(gòu)生物學(xué)實驗室， 天津 300072)

血管生成(angiogenesis)是指在原有血管上生成新血管的生理過程，在機(jī)體發(fā)育、傷口愈合及促腫瘤惡化等方面有著重要影響[1]。由組織缺氧等引發(fā)的血管出芽(sprouting)是血管生成的基本方式：機(jī)體組織釋放的血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor β，TGF-β)等會激活鄰近血管內(nèi)皮細(xì)胞的VEGF和TGF-β等信號通路，被激活的內(nèi)皮細(xì)胞會向外增殖延伸形成“芽”，并發(fā)育成新血管[2]。

在參與血管生成的細(xì)胞因子中，TGF-β家族蛋白質(zhì)極為重要。該家族中有3種受體，包括激活素受體樣激酶1(activin receptor-like kinase 1，ALK1)及激活素受體樣激酶5(activin receptor-like kinase 5，ALK5)等在內(nèi)的I型受體，轉(zhuǎn)化生長因子受體II(TGFβ receptor II，TβRII)及骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體II(bone morphogenetic protein receptor II，BMPRII)等在內(nèi)的II型受體，以及內(nèi)皮聯(lián)蛋白(endoglin，ENG)等在內(nèi)的輔助受體[3]。它們通過一套固定的信號傳導(dǎo)模式調(diào)控著內(nèi)皮細(xì)胞的命運：在輔助受體的參與下，TGF-β家族蛋白質(zhì)與細(xì)胞膜上的I和II型受體互作而形成三元復(fù)合物，致使受體胞內(nèi)域被磷酸化，然后信號經(jīng)胞內(nèi)SMADs依賴型或SMADs非依賴型兩條信號通路傳遞，并最終調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄出的蛋白將進(jìn)一步調(diào)控血管生成[4]。其中，SMADs依賴型通路主要由SMAD1～9等因子組成，且依賴于I型受體的磷酸化；SMADs非依賴型通路由多種因子組成，是多條信號通路的統(tǒng)稱[3, 5]。

ENG是TGF-β家族蛋白質(zhì)的輔助受體，是一個主要表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞的分子質(zhì)量約為90 kD的I型跨膜糖蛋白。此外，ENG亦在成纖維細(xì)胞與血管平滑肌細(xì)胞等細(xì)胞中表達(dá)[6-9]。ENG通過直接或間接影響上述細(xì)胞的增殖、遷移、黏附或分化等生理作用調(diào)控血管生成，其異常可能會導(dǎo)致血管畸形和癌癥惡化等后果：已鑒定出100多種Eng基因突變會引發(fā)一種以血管發(fā)育不良、動靜脈畸形和反復(fù)出血等為特征的1型遺傳性出血性毛細(xì)血管擴(kuò)張癥(hereditary hemorrhagic telangiectasia 1，HHT1)[10]；實體瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞會高表達(dá)ENG，以促進(jìn)腫瘤血管生成與癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移[11]；Eng純合子缺失型小鼠會因血管網(wǎng)絡(luò)發(fā)育失敗而死于胚胎期[6]。ENG之所以能夠在血管生成中發(fā)揮重要功能，是源于ENG獨特的結(jié)構(gòu)，而其結(jié)構(gòu)特征又決定了ENG能夠與不同蛋白質(zhì)互作來調(diào)控血管生成。本文分別從ENG與TGF-β及非TGF-β家族相關(guān)蛋白質(zhì)的互作入手，總結(jié)了ENG調(diào)控血管生成的機(jī)制，以期對今后ENG相關(guān)研究有所幫助。

1 內(nèi)皮聯(lián)蛋白的結(jié)構(gòu)

人源內(nèi)皮聯(lián)蛋白包含1個較大的胞外域(561個殘基)、1個跨膜域和1個較小的胞內(nèi)域(47個或14個殘基)[7](見Fig.1)。

Fig.1 Schematic diagram of ENG structure ENG contains an extracellular domain, a transmembrane domain and a relatively small intracellular domain. The extracellular domain contains signal peptide, OR and ZP. OR contains OR1 and OR2. ZP contains ZP-N and ZP-C. C516 and C582 are two free cysteines

1.1 ENG的胞外域

ENG的胞外域包含orphan domain(OR)和透明帶域(zona pellucida domain，ZP)，OR由OR1與OR2組成，ZP由ZP-N與ZP-C組成，這4部分均以堆疊的β片層為基本骨架，形成免疫球蛋白樣的結(jié)構(gòu)[7]。OR的晶體結(jié)構(gòu)(PDB ID：5I04)顯示，OR1上的β6～β7片層組成了一個疏水溝，負(fù)責(zé)結(jié)合配體骨形態(tài)發(fā)生蛋白9(bone morphogenetic protein 9，BMP9)[12]。雖然OR1與OR2在結(jié)構(gòu)上高度相似，但是與OR1結(jié)合BMP9的功能不同，目前尚未發(fā)現(xiàn)OR2具有任何介導(dǎo)蛋白質(zhì)互作的功能，因此關(guān)于OR2的功能仍需要進(jìn)一步研究[12]。ZP-N包含1個Arg-Gly-Asp(RGD)序列，這是一個結(jié)合整合素的經(jīng)典序列，ZP-C包含的C516及近膜端包含的C582，分別形成C516～C516和C582～C582共2個二硫鍵并共同介導(dǎo)ENG的二聚化[12, 13]。

1.2 ENG的胞內(nèi)域

細(xì)胞通過選擇性剪接ENG的前體mRNA (precursor mRNA)產(chǎn)生兩種亞型。依據(jù)胞內(nèi)域的長度，ENG可被分為長型-ENG(L-ENG，胞內(nèi)域含47個氨基酸殘基)與短型-ENG(S-ENG，胞內(nèi)域含14個氨基酸殘基)[14, 15]。當(dāng)內(nèi)皮細(xì)胞處于健康活躍狀態(tài)時，L-ENG為主要亞型，而當(dāng)內(nèi)皮細(xì)胞處于衰老或高氧狀態(tài)時，S-ENG會被大量誘導(dǎo)表達(dá)，從而降低內(nèi)皮細(xì)胞的增殖率，抑制血管生成[14, 16]。L-ENG胞內(nèi)域含有絲/蘇氨酸富集區(qū)，該區(qū)域可被I型或II型受體磷酸化，其C端Ser-Met-Ala 的3個氨基酸是一個I型PDZ結(jié)合序列，可結(jié)合其他蛋白質(zhì)的PDZ結(jié)構(gòu)域。相反，S-ENG的胞內(nèi)域因缺少這些特殊序列，所以無類似L-ENG的功能[17]。ENG的兩種亞型具有截然不同的生理功能，L-ENG可幫助內(nèi)皮細(xì)胞遷移或增殖，S-ENG可參與內(nèi)皮細(xì)胞衰老[14]。

2 內(nèi)皮聯(lián)蛋白與TGF-β家族相關(guān)蛋白質(zhì)互作調(diào)控血管生成

2.1 ENG與TGF-β家族的I型受體互作調(diào)控血管生成

L-ENG和S-ENG分別與ALK1及ALK5互作來介導(dǎo)胞內(nèi)2條功能不同的SMADs信號通路，進(jìn)而改變TGF-β信號傳導(dǎo)的結(jié)果[14](見Fig.2)。L-ENG胞內(nèi)域與ALK1的親和力較高，可觸發(fā)由被磷酸化的ALK1引起的SMAD1/5信號通路。已有研究表明，ALK1-SMAD1/5的激活可以增加VEGF的表達(dá)量，并促進(jìn)血管生成等[14, 18]；S-ENG胞內(nèi)域與ALK5的親和力較高，可促使TGFβ1等因子的信號經(jīng)由ALK5-SMAD2/3通路傳遞，而ALK5-SMAD2/3信號通路可以調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞與血管平滑肌細(xì)胞，來分泌結(jié)締組織生長因子(connective tissue growth factor，CTGF)等促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)形成的因子，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞外基質(zhì)穩(wěn)態(tài)與血管形成的過程，而這些因子的過表達(dá)則可能導(dǎo)致血管纖維化等血管病變[14, 19-21]。在細(xì)胞衰老階段，血管中的CTGF表達(dá)量被上調(diào)，這導(dǎo)致血管細(xì)胞外基質(zhì)發(fā)生重塑，并進(jìn)一步誘發(fā)衰老相關(guān)的血管病癥等[19]。

Fig.2 Diagram of ENG signaling pathways TGF-β1/β3 bind to ALK5 or ALK1 with the assistance of S-ENG or L-ENG, subsequently bind to TβRII. BMP9 binds to ALK1 with the assistance of L-ENG, subsequently binds to BMPRII. ALK5 will activate SMAD2/3 and ALK1 will activate SMAD1/5. With the assistance of SMAD4, these SMADs factors will enter the nucleus to regulate the transcription of corresponding genes related to angiogenesis

此外，ALK1和ALK5亦可影響ENG的功能。Tazat等[22]發(fā)現(xiàn)，被磷酸化的ALK1與ALK5會被胞吞，但ALK1被胞吞的速率(t1/2=2.5 min)遠(yuǎn)高于ALK5(t1/2=13 min)。同時，ALK1可通過與ENG形成復(fù)合物使ENG一同被胞吞，進(jìn)而抑制SMAD1/5信號通路，抑制血管生成。

2.2 ENG與TGF-β家族蛋白質(zhì)互作調(diào)控血管生成

ENG可與TGF-β家族蛋白質(zhì)TGFβ1/β3相互作用，調(diào)控涉及TGFβ1/β3的血管生成過程[23](見Fig.2)。TGFβ1是一個經(jīng)典的促進(jìn)細(xì)胞纖維化的因子，Kapur等[24]發(fā)現(xiàn)，通過降低心力衰竭患者的左心室內(nèi)皮細(xì)胞中ENG的表達(dá)量能抑制TGFβ1的信號，限制心肌纖維化并提高心力衰竭患者的存活率，說明ENG在TGFβ1信號通路調(diào)控心血管發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用。

后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，ENG與TGF-β家族蛋白質(zhì)BMP9的親和力遠(yuǎn)高于ENG與TGFβ1的親和力[12]，ENG可通過與BMP9互作來調(diào)控血管生成(見Fig.2)?；诙叩牡鞍踪|(zhì)互作結(jié)構(gòu)已被解析，ENG與BMP9的互作界面包括ENG-OR1中的1個高度保守的疏水溝和BMP9生長因子中的β6～β7片層[12]。ENG在結(jié)合BMP9時亦可以競爭性替換掉BMP9的前體結(jié)構(gòu)域，使BMP9暴露出結(jié)合II型受體的位置[12, 25]。研究顯示，I型與II型受體均不能替換掉BMP9前體結(jié)構(gòu)域，且II型受體與BMP9結(jié)合界面被BMP9的前體結(jié)構(gòu)域阻礙，因此ENG對BMP9-I型受體-II型受體的三元復(fù)合物的形成至關(guān)重要[26, 27]。

3 內(nèi)皮聯(lián)蛋白與非TGF-β家族相關(guān)蛋白質(zhì)互作調(diào)控血管生成

3.1 ENG與MMP14互作調(diào)控血管生成

基質(zhì)金屬蛋白酶14(matrix metalloproteinase 14，MMP14)可識別并切割ENG的G586與L587間的肽鍵，產(chǎn)生一種不包含跨膜域與胞內(nèi)域的游離型ENG。因此，血液中游離型ENG的含量與MMP14的含量呈正相關(guān)，在臨床上游離型ENG含量的升高通常伴隨著子癇前期或肺動脈高壓等病癥[28-30]。目前，游離型ENG調(diào)控血管生成進(jìn)而導(dǎo)致這些疾病的機(jī)制仍存在爭議：Castonguay等[31]發(fā)現(xiàn)，外源游離型ENG-Fc重組蛋白能特異性結(jié)合配體BMP9/10，并抑制A204細(xì)胞系(該細(xì)胞不含內(nèi)源ENG)對2個配體的響應(yīng)。但Lawera等[25]發(fā)現(xiàn)，當(dāng)人肺動脈內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)內(nèi)源ENG時，外源游離型ENG單體不會抑制細(xì)胞對BMP9的響應(yīng)；當(dāng)人肺動脈內(nèi)皮細(xì)胞不表達(dá)內(nèi)源ENG時，外源的游離型ENG單體可抑制BMP9/10的信號。因此，MMP14可以通過產(chǎn)生游離型ENG，調(diào)控BMP9/10信號通路進(jìn)而調(diào)控血管生成，但具體機(jī)制可能涉及多種因素，目前尚不明確。

3.2 ENG與整合素互作調(diào)控血管生成

整合素是一種由α亞基和β亞基組成的異源二聚的膜受體[32]。整合素可通過與包含RGD序列的配體互作，進(jìn)而激活黏著斑激酶(focal adhesion kinase，F(xiàn)AK)和磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)等，最終調(diào)控血管生成[32, 33]。α5β1是一種在內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)的整合素，其主要配體為纖維粘連蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)，但亦能與包含RGD序列的ENG等互作，強(qiáng)化ENG促進(jìn)血管生成的功能[34, 35]。

細(xì)胞外基質(zhì)中的纖維粘連蛋白可通過與α5β1互作使α5β1在細(xì)胞表面聚集成簇，而成簇的α5β1可以與ENG、ALK1互作，進(jìn)而促進(jìn)ENG與ALK1形成復(fù)合物，增強(qiáng)促血管生成的SMAD1/5信號；同時，TGFβ1也能夠以依賴ENG，但不依賴I型受體的方式激活α5β1信號通路，TGFβ1對α5β1信號的激活依賴由β-抑制蛋白2(β-arrestin2，βarr2)引起的ENG被胞吞的生理活動，這使與ENG胞外域互作α5β1亦被胞吞，進(jìn)而激活FAK通路，抑制內(nèi)皮細(xì)胞遷移，最終參與促進(jìn)新生血管穩(wěn)定與成熟[35, 36]。

3.3 ENG與LRG1互作調(diào)控血管生成

正如上文所述，有多種蛋白質(zhì)可以通過與ENG互作進(jìn)而影響TGF-β通路來調(diào)控血管生成，但ENG參與到病理性血管生成的機(jī)制卻尚不明晰。近年來，研究發(fā)現(xiàn)一種名為富含亮氨酸的α-2-糖蛋白-1(leucine-rich alpha-2-glycoprotein-1，LRG1)的血管生成性糖蛋白，相比于野生型小鼠，高表達(dá)LRG1的小鼠眼部的病理性血管的數(shù)量增加，而Lrg1基因敲除小鼠眼部的病理性血管的數(shù)量減少，同時正常血管的數(shù)量無明顯變化。這表明，LRG1可能在病理性血管的生成中發(fā)揮主導(dǎo)作用，而在正常的血管生成中作用不明顯[37]。后續(xù)的生化研究表明，在病理狀態(tài)下，高表達(dá)的LRG1可與ALK1或ALK5結(jié)合。但在TGFβ1及ENG存在時，LRG1則通過結(jié)合ENG，增強(qiáng)與ALK1的互作，削弱與ALK5的互作，這導(dǎo)致ALK1-Smad1/5信號被增強(qiáng)，從而促進(jìn)病理性血管的生成[37]。LRG1是一個具有重要意義的發(fā)現(xiàn)，使在不損傷正常血管生成基礎(chǔ)上抑制病理性血管生成變?yōu)榭赡埽捎谀壳癊NG與LRG1的蛋白質(zhì)互作界面尚未解析，具體作用機(jī)制尚不明了。因此，未來研究可以嘗試通過解析ENG與LRG1的互作結(jié)構(gòu)來開發(fā)相應(yīng)的靶向藥物。

3.4 ENG與VEGFR2互作調(diào)控血管生成

VEGF及其主要受體(VEGF receptor，VEGFR)是促血管生成的關(guān)鍵因素。VEGF有A、B、C、D和胎盤生長因子5個亞型。其中，VEGF-A及其受體VEGFR2在血管生成階段發(fā)揮關(guān)鍵作用[38, 39]。VEGFR2在結(jié)合VEGF后會被胞吞，但ENG的胞內(nèi)域序列625PVVAVA630和643SIGSTQ648與VEGFR2以VEGF-A依賴性方式互作，因此ENG可以抑制VEGFR2被胞吞，延長VEGFR2在細(xì)胞膜上的駐留時間(駐膜時間)，促進(jìn)血管出芽與延伸[38, 39]。然而，缺失胞內(nèi)域的ENG則不能結(jié)合VEGFR2，這導(dǎo)致VEGF-A信號半衰期被縮短，出芽活動被削弱，血管向外延伸能力下降，同時血管局部增殖并導(dǎo)致血管畸形[39, 40]。目前在小鼠模型中，聯(lián)用VEGFR的單克隆抗體bevacizumab與ENG的單克隆抗體TRC105，可以成功抑制注射進(jìn)小鼠體內(nèi)的4T1癌細(xì)胞的生長與轉(zhuǎn)移，這為通過聯(lián)合用藥抑制腫瘤的血管生成提供了一定的理論與實踐基礎(chǔ)[39]。

3.5 ENG與支架蛋白互作調(diào)控血管生成

G蛋白信號調(diào)節(jié)體-G alpha相互作用蛋白C端(GAIP interacting protein C-terminus，GIPC)是一個包含PDZ結(jié)構(gòu)域，可以穩(wěn)定跨膜蛋白質(zhì)的支架蛋白[41]。ENG可通過與GIPC互作來增加自身的駐膜時間。Lee等[17]發(fā)現(xiàn)，GIPC可通過與ENG胞內(nèi)域的I型PDZ結(jié)合基序互作，穩(wěn)定小鼠胚胎內(nèi)皮細(xì)胞表面的ENG，延長ENG調(diào)控其他信號通路的時間，促進(jìn)SMAD1/5的磷酸化，抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移，進(jìn)而調(diào)控血管生成。

ENG亦可通過與另一種支架蛋白質(zhì)，即G蛋白偶聯(lián)受體信號通路的負(fù)反饋因子β-arrestin2互作引發(fā)ENG被胞吞，縮短ENG駐膜時間，并激活SMADs非依賴型通路，削弱細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)信號，最終抑制內(nèi)皮細(xì)胞的有絲分裂和遷移。利用siRNA沉默內(nèi)源β-arrestin2可恢復(fù)細(xì)胞的ERK信號與內(nèi)皮細(xì)胞的遷移功能，進(jìn)而調(diào)控血管生成。后續(xù)的研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，ENG與β-arrestin2的互作依賴于ENG的T650附近區(qū)域的磷酸化。鑒于T650附近區(qū)域的磷酸化又依賴于TβRII或ALK1的磷酸化，因此ENG與β-arrestin2的互作可能涉及了ENG信號的負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制[36, 42]。這項發(fā)現(xiàn)可能為治療因ENG過表達(dá)而導(dǎo)致的腫瘤等疾病提供了新思路。但由于目前ENG與β-arrestin2復(fù)合物結(jié)構(gòu)尚未解析，相關(guān)靶向藥物的開發(fā)仍需更多的研究。

3.6 ENG與血管內(nèi)皮鈣黏連蛋白互作調(diào)控血管生成

血管內(nèi)皮鈣黏連蛋白(vascular endothelial cadherin，VE-cadherin)是一種表達(dá)于血管內(nèi)皮、負(fù)責(zé)調(diào)控細(xì)胞黏連的Ca2+依賴性的膜蛋白質(zhì)，參與血管生成與穩(wěn)態(tài)調(diào)控等[43]。正常表達(dá)的且在細(xì)胞膜上規(guī)則分布的血管內(nèi)皮鈣黏連蛋白可強(qiáng)化細(xì)胞間黏連，減弱血管的滲透性[44]。ENG可通過與血管內(nèi)皮鈣黏連蛋白互作來改變其在細(xì)胞膜上的分布情況，并借以調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞間的黏連。野生型小鼠和過表達(dá)ENG的小鼠的血管內(nèi)皮鈣黏連蛋白表達(dá)量雖無明顯區(qū)別，但過表達(dá)ENG小鼠的血管內(nèi)皮鈣黏連蛋白傾向于不規(guī)則地分布于細(xì)胞膜上，這導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞間的黏連被減弱，血管的滲透性增加，最終致使新生血管不穩(wěn)定，易出現(xiàn)出血或促癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的情況[45]。

4 問題與展望

綜上所述，現(xiàn)將目前已被研究驗證的與ENG存在相互作用的蛋白質(zhì)匯總(見Table 1)。基于目前的研究，可以暫時描繪出如下的ENG調(diào)控血管生成的機(jī)制：在血管生成活躍階段，內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)大量的ENG，致使血管內(nèi)皮鈣黏連蛋白介導(dǎo)細(xì)胞間黏附作用被削弱；同時，大量的ENG開始加速招募TGF-β家族蛋白質(zhì)結(jié)合到細(xì)胞膜上的ALK1-ENG復(fù)合物，而fibronectin-α5β1復(fù)合物與ENG的互作又進(jìn)一步加速了這一復(fù)合物的形成，導(dǎo)致配體與ALK1-ENG復(fù)合物的結(jié)合被進(jìn)一步加強(qiáng)。隨后，ENG被磷酸化，SMAD1/5信號被激活，內(nèi)皮細(xì)胞開始分泌VEGF等因子；同時ENG又進(jìn)一步延長了VEGF-A信號，致使內(nèi)皮細(xì)胞的遷移與增殖活動被加強(qiáng)。此外，在GIPC的作用下，上述的各個信號作用時間又隨著ENG駐膜時間的延長也被進(jìn)一步延長，最終表現(xiàn)為活躍的血管出芽與血管生成等生理活動。但隨著血管生成趨于成熟，已被磷酸化的ENG會隨著β-arrestin2或被磷酸化的ALK1一同被胞吞，致使ENG在細(xì)胞膜上介導(dǎo)的ALK1-SMAD1/5通路被抑制。與此同時，內(nèi)化的ENG又開始抑制ERK信號。此外，隨著ENG被一同胞吞的α5β1會同時激活FAK信號，最終導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞的分裂與遷移活動均被抑制，表現(xiàn)為內(nèi)皮細(xì)胞趨于靜默，血管最終成熟。在血管衰老階段，內(nèi)皮細(xì)胞開始大量表達(dá)S-ENG，ALK5-SMAD2/3信號被增強(qiáng)，內(nèi)皮細(xì)胞開始大量表達(dá)CTGF等促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)形成的因子，可能進(jìn)一步加速血管的衰老。

Table 1 The proteins interacted with ENG

因此，ENG通過調(diào)控信號通路和介導(dǎo)細(xì)胞間相互作用，在血管生成中發(fā)揮著重要作用。但ENG是如何在錯綜復(fù)雜的細(xì)胞環(huán)境中協(xié)調(diào)各信號的有序傳導(dǎo)，仍有待研究。ENG作為調(diào)控血管生成的重要蛋白質(zhì)，是一個具有藥物研發(fā)前景的靶蛋白質(zhì)。雖然目前的ENG單克隆抗體TRC105在靶向治療腫瘤方面初見成效，但仍因為抗藥性和適用范圍小而收效甚微。在未來的研究中，解析ENG與不同蛋白質(zhì)互作結(jié)構(gòu)，深入理解ENG與不同蛋白質(zhì)的互作機(jī)制，進(jìn)而對不同病患實施不同的雞尾酒療法，或許可以對血管類疾病的治療提供更有針對性的幫助。