楊 恒,錢(qián) 彪,劉志立,王勤章,郝志強(qiáng),王敬珅,汪 淵,李永樂(lè),譚明輝,鄭麗英

(1.石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院泌尿外科,新疆石河子 832008；2.贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院泌尿外科，江西贛州 341000)

腎結(jié)石是臨床常見(jiàn)的泌尿外科疾病，嚴(yán)重影響患者的身體健康和生活質(zhì)量[1-2]，該病的成因非常復(fù)雜。自從芬蘭科學(xué)家 KAJANDER及其同事研究發(fā)現(xiàn)了一種直徑在0.1～2.0 μm的微生物，并將其命名為納米細(xì)菌(nanobacteria，NB)以來(lái)[3]，NB作為一種新的微生物被臨床及科研人員廣泛研究。NB在95%腎結(jié)石患者的血液、尿液和結(jié)石中均可檢測(cè)出，有關(guān)NB的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已經(jīng)成功建立出了腎結(jié)石的模型[4-6]。將NB與HK-2細(xì)胞一同培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)NB可損傷HK-2細(xì)胞[7]，但機(jī)制不明。研究表明納米細(xì)菌可誘導(dǎo)腎小管氧化應(yīng)激，促進(jìn)腎結(jié)石的形成[8]。本研究將采用體外培養(yǎng)HK-2細(xì)胞，探討脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)在NB損傷HK-2細(xì)胞過(guò)程中的作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器人腎小管上皮細(xì)胞HK-2購(gòu)自武漢大學(xué)保藏中心，DMEM培養(yǎng)基、1640培養(yǎng)基、胎牛血清均來(lái)自GIBCO 公司(美國(guó))，HEPES(N’-a-hydroxythylpiperazine-N’-ethanesulfanic acid，4-羥乙基哌嗪-2-乙磺酸)緩沖液購(gòu)自美國(guó)Hyclone 公司。四環(huán)素購(gòu)自山西云鵬制藥有限公司。過(guò)氧化氫(H2O2)試劑盒、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)試劑盒、乳酸脫氫酶(Lactatedehydrogenase,LDH)試劑盒、Na+/K+ATP酶試劑盒、Ca2+/Mg2+ATP酶試劑盒、phalloidin-FITC均購(gòu)自中杉金橋生物技術(shù)有限公司。細(xì)胞孵育箱購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司，倒置相差顯微鏡來(lái)自于德國(guó)蔡司，酶標(biāo)儀來(lái)源于美國(guó)Bio-TEK 公司。

1.2 NB的培養(yǎng)與鑒定于新疆石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院泌尿外科收集臨床確診腎結(jié)石且未應(yīng)用藥物或手術(shù)治療的患者尿液，將2 mL無(wú)菌條件下獲得的尿液用生理鹽水稀釋5倍，4 ℃(離心力14 000 g，45 min)；再取管底2 mL混勻，以0.45 μm濾紙過(guò)濾后，再以生理鹽水稀釋5倍，4 ℃(離心力14 000 g，45 min)；取管底1 mL液體充分混勻后，經(jīng)0.22 μm的濾紙加壓過(guò)濾。將濾液1 mL注入含DMEM培養(yǎng)液、體積分?jǐn)?shù)為10%的γ-胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)和體積分?jǐn)?shù)為1%的HEPES緩沖液的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5% 的CO2條件下培養(yǎng)，5～7 d換1次液。倒置相差顯微鏡觀察NB生長(zhǎng)，篩選出無(wú)污染的標(biāo)本，用吸管吹打均勻后，吸入EP管。以12 000 r/min的速度離心20 min，棄上清液，再加入無(wú)菌注射用水1.5 mL吹打混勻。重復(fù)上述步驟，共計(jì)清洗NB 3次，采用納米細(xì)菌鈣染色(Von KOSSA法)和透射電鏡掃描(負(fù)染法)鑒定NB。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組選取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)狀態(tài)良好的HK-2細(xì)胞，隨機(jī)分為3組，NB組[NB菌液2 mL、PBS 20 mL、1640培養(yǎng)液+HK-2細(xì)胞(每孔約4×106個(gè))]，四環(huán)素干擾組[5 mg/L四環(huán)素、NB菌液2 mL、PBS 20 mL、1640培養(yǎng)液+HK-2細(xì)胞(每孔約4×106個(gè))]和空白對(duì)照組[PBS 20 mL、1640培養(yǎng)液+HK-2細(xì)胞(每孔約4×106個(gè))]。

1.4 各組細(xì)胞蘇木精-伊紅(harris-eosin，HE)染色觀察分別于實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后6、12、24 h提取各組細(xì)胞，每組吸取100 μL細(xì)胞懸液，使用細(xì)胞離心涂片機(jī)進(jìn)行涂片，PBS沖洗3次，晾干；玻片經(jīng)二甲苯脫蠟及梯度乙醇水化后，蘇木精染色1 min，自來(lái)水沖洗2 min，體積分?jǐn)?shù)為1%的鹽酸乙醇分化5 s，伊紅染色5 min；再經(jīng)梯度乙醇脫水、二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片，于光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化。

1.5 細(xì)胞損傷因子指標(biāo)檢測(cè)分別在6、12、24 h取各組細(xì)胞上清液，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)分別檢測(cè)H2O2、MDA、LDH含量；向吸盡培養(yǎng)液的細(xì)胞中加入25 g/L胰蛋白酶并反復(fù)吹打?qū)⒓?xì)胞消化，轉(zhuǎn)移至EP管中，分別加入PBS緩沖液400 μL。用超聲粉碎機(jī)粉碎，ATP酶試劑盒比色法測(cè)定各組細(xì)胞Na+/K+ATP酶和Ca2+/Mg2+ATP酶活性。

2 結(jié) 果

2.1 各組細(xì)胞HE染色結(jié)果結(jié)果如圖1所示。NB組在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后，部分細(xì)胞體積增大，刷狀緣排列紊亂，胞核松散，核膜模糊不清，并且此改變隨時(shí)間延長(zhǎng)，呈加重趨勢(shì)；四環(huán)素干擾組在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后，整體上細(xì)胞形態(tài)完好，胞核清晰，胞漿致密，少量細(xì)胞出現(xiàn)胞體膨脹，胞核松散，出現(xiàn)這種改變的細(xì)胞，隨時(shí)間延長(zhǎng)有緩慢增多的趨勢(shì)；空白對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)完好，大小均一，細(xì)胞核清晰、胞漿致密，無(wú)明顯異常。

注：NB(納米細(xì)菌)組中紅色箭頭表示部分細(xì)胞體積增大，四環(huán)素干擾組中6 h紅色箭頭表示整體上細(xì)胞形態(tài)完好，12 h及24 h紅色箭頭表示少量細(xì)胞出現(xiàn)胞體膨脹，胞核松散；對(duì)照組紅色箭頭表示細(xì)胞形態(tài)完好，大小均一。

2.2 各組細(xì)胞細(xì)胞損傷因子指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果共培養(yǎng)12、24 h后，NB組細(xì)胞的Na+/K+ATP酶和Ca2+/Mg2+ATP酶活性均低于對(duì)照組(P<0.05)和干擾組(P<0.05)，干擾組細(xì)胞在各時(shí)間點(diǎn)的酶活性均低于對(duì)照組(P<0.05)(表1)。

表1 各時(shí)間點(diǎn)各組Na+/K+ATP和Ca2+/Mg2+ATP酶活性比較

共培養(yǎng)12、24 h后，NB組培養(yǎng)液中H2O2和MDA的含量顯著高于對(duì)照組(P<0.05)和干擾組(P<0.05)，干擾組中H2O2和MDA的含量顯著高于對(duì)照組(P<0.05)(表2)。

表2 各時(shí)間點(diǎn)各組培養(yǎng)液LDH、H2O2和MDA含量比較

3 討 論

腎結(jié)石的病因非常復(fù)雜，與尿路異常、代謝異常和基因的特異性有關(guān)，同時(shí)與地理、氣候、飲食和飲水量等也密切相關(guān)[9]。目前，關(guān)于NB與腎結(jié)石的研究發(fā)現(xiàn)，NB可能是導(dǎo)致腎結(jié)石形成的原因之一，其能夠促進(jìn)大鼠腎草酸鈣結(jié)晶結(jié)石的形成[10]。NB是可以在人體內(nèi)產(chǎn)生磷灰石結(jié)晶的生物，已經(jīng)證實(shí)其存在于人體血液、尿及許多器官組織中[11]，可使體內(nèi)多種細(xì)胞發(fā)生病理性鈣化[12]，并可損傷腎小管上皮細(xì)胞[13]。細(xì)胞損傷是引起結(jié)石的關(guān)鍵因素，腎小管上皮細(xì)胞損傷脫落后暴露的基底膜可以吸引結(jié)晶的黏附，而壞死的細(xì)胞碎片會(huì)進(jìn)一步富集參與形成結(jié)石，從而導(dǎo)致腎結(jié)石的發(fā)生發(fā)展[14-15]。但NB是如何導(dǎo)致細(xì)胞損傷的，其機(jī)制尚不明確。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)HE染色和電鏡對(duì)細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后，NB組HK-2細(xì)胞逐漸出現(xiàn)損傷，并且損傷情況隨時(shí)間延長(zhǎng)呈加重趨勢(shì)；四環(huán)素干擾組出現(xiàn)少量HK-2細(xì)胞損傷，但與NB組相比損傷明顯減輕，考慮可能四環(huán)素對(duì)NB有抑制作用，該結(jié)果進(jìn)一步佐證了NB可以促進(jìn)腎結(jié)石形成。

以往有研究證實(shí)，脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)可以產(chǎn)生大量活性氧自由基，進(jìn)而對(duì)腎小管上皮細(xì)胞造成損傷。THAMILSELVAN等[17]將LLC-PK1細(xì)胞置于500 g/L COM晶體條件下培養(yǎng)4 h后，觀察到培養(yǎng)液中LDH和MDA濃度顯著提升，一定濃度范圍內(nèi)的抗氧化劑可以有效抑制脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)從而減少活性氧對(duì)細(xì)胞的損傷[16-19]。本次實(shí)驗(yàn)中，我們通過(guò)檢測(cè)ATP酶活性及培養(yǎng)液中LDH水平來(lái)評(píng)估細(xì)胞膜損傷程度，通過(guò)檢測(cè)H2O2和MDA來(lái)確定損傷過(guò)程中有無(wú)脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的參與。結(jié)果NB組培養(yǎng)液中H2O2和MDA的含量超過(guò)一定時(shí)間后，顯著高于對(duì)照組(P<0.05)和干擾組(P<0.05)，說(shuō)明在NB損傷HK-2細(xì)胞的機(jī)制中，有脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的參與。同時(shí)，本次實(shí)驗(yàn)中，NB組細(xì)胞的Na+/K+ATP酶和Ca2+/Mg2+ATP酶活性超過(guò)一定時(shí)間后，均明顯低于對(duì)照組(P<0.05)和四環(huán)素干擾組(P<0.05)，LDH水平高于對(duì)照組(P<0.05)和干擾組(P<0.05)，說(shuō)明NB組HK-2細(xì)胞損傷的程度明顯高于對(duì)照組和四環(huán)素干擾組。并且，在NB組中，HK-2細(xì)胞的損傷程度與發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的程度，呈現(xiàn)出一致性。

在細(xì)胞損傷實(shí)驗(yàn)的客觀指標(biāo)測(cè)定中，本研究在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)每組僅選擇了3個(gè)樣本，因此沒(méi)有進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，還需要積累更多時(shí)間點(diǎn)和更大樣本量進(jìn)行深入分析，但僅從形態(tài)學(xué)的角度仍然可以得出“NB對(duì)人腎小管上皮細(xì)胞造成損傷”的確定結(jié)論。本研究采用試劑盒直接檢測(cè)H2O2、MDA含量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確，誤差較小，且前人研究已有相關(guān)文獻(xiàn)支撐[20]。另對(duì)于脂質(zhì)過(guò)氧化的檢測(cè)方法也可以考慮采用化學(xué)發(fā)光法或者硫代巴比妥酸法，這樣可以通過(guò)多種檢測(cè)方法來(lái)證實(shí)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的合理性。

綜上所述，我們推論，脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)是NB損傷HK-2細(xì)胞的作用機(jī)制之一，HK-2細(xì)胞的損傷程度與發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的程度呈現(xiàn)出一致性，脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)甚至可能是導(dǎo)致HK-2細(xì)胞損傷的主要原因，這為我們今后在結(jié)石治療和預(yù)防方面提供了一個(gè)很好的方向。