周 露

（寶應(yīng)縣產(chǎn)品質(zhì)量綜合檢驗(yàn)檢測(cè)中心，江蘇揚(yáng)州 225800）

微生物污染引起的食源性疾病是世界各國(guó)普遍關(guān)注的問題。大腸埃希氏菌O157:H7/NM是一種通過肉類或乳類食品傳播的致病性大腸桿菌，這類病菌不僅能引起食物中毒，還能引起腸道內(nèi)出血，因此又被稱為“出血性大腸桿菌”。對(duì)食品中大腸埃希氏菌O157:H7/NM的檢測(cè)和監(jiān)控是預(yù)防與控制食源性疾病的重要技術(shù)手段。本實(shí)驗(yàn)室參加了大連中食國(guó)實(shí)檢測(cè)技術(shù)有限公司組織的大腸埃希氏菌O157:H7/NM檢測(cè)能力驗(yàn)證活動(dòng)。

目前，能力驗(yàn)證已成為中國(guó)合格評(píng)定國(guó)家認(rèn)可委員會(huì)保障實(shí)驗(yàn)室認(rèn)可有效性極為重要的手段[1]。對(duì)于實(shí)驗(yàn)室而言，能力驗(yàn)證是非常有效的外部質(zhì)量控制方式，利用能力驗(yàn)證結(jié)果能有效提升檢驗(yàn)人員的檢測(cè)能力及實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)水平。完成能力驗(yàn)證的過程能核驗(yàn)儀器設(shè)備的準(zhǔn)確性、穩(wěn)定性，驗(yàn)證檢驗(yàn)人員的技術(shù)能力，能力驗(yàn)證結(jié)果可證明實(shí)驗(yàn)室已具備一定的技術(shù)能力。同時(shí)，每參加一個(gè)能力驗(yàn)證項(xiàng)目，都能提升實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)人員的技術(shù)水平，為以后的實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)場(chǎng)評(píng)審和各項(xiàng)檢查提供有力的證據(jù)。因此，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)加強(qiáng)開展能力驗(yàn)證活動(dòng)，結(jié)合檢驗(yàn)工作自身需求和能力驗(yàn)證領(lǐng)域及頻次要求，積極尋求并主動(dòng)參加能力驗(yàn)證和實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)，覆蓋能力范圍內(nèi)的專業(yè)領(lǐng)域，以滿足CNAS能力驗(yàn)證規(guī)則的 要求。

1 材料與方法

1.1 檢驗(yàn)依據(jù)

《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 大腸埃希氏菌O157:H7/NM檢驗(yàn)》（GB 4789.36—2016）[2]和大連中食國(guó)實(shí)檢測(cè)技術(shù)有限公司《食品中大腸埃希氏菌O157:H7的測(cè)定能力驗(yàn)證計(jì)劃作業(yè)指導(dǎo)書》（CFAPA—1190）。

1.2 材料與設(shè)備

1.2.1 儀器

電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；高壓蒸汽滅菌器（日本株式會(huì)社平山制作所）；電子天平（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）；法國(guó)AES均質(zhì)器（法國(guó)AES儀器有限公司）；超純水機(jī)（Thermo Fisher SCIENTIFIC 公司）；數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市榮華儀器制造有限公司）；顯微鏡（德國(guó)LEICA）；酸度計(jì)（北京賽多利斯儀器有限公司）；暗箱式紫外分析儀（上海寶山顧村電光儀器廠）；超低溫冰箱（青島海爾特種電器有限公司）；藥品保存箱（青島Haier）；二級(jí)生物安全柜B2（新加坡ESCO）。

1.2.2 試劑

改良EC肉湯（mEC＋n）；改良山梨醇麥康凱瓊脂（CT-SMAC）；三糖鐵瓊脂（TSI）；營(yíng)養(yǎng)瓊脂；半固體瓊脂；月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯-MUG（MUG-LST）；氧化酶試劑；革蘭氏染色液；大腸埃希氏菌O157:H7/NM生化鑒定試劑盒。

1.2.3 菌種

大腸埃希氏菌（ATCC 25922）、大腸埃希氏菌O157/H7（NCTC 12900），均購(gòu)自廣東省食品微生物安全工程技術(shù)研究開發(fā)中心。

1.2.4 樣品

大腸埃希氏菌O157:H7能力驗(yàn)證樣品是添加特定菌株的乳粉冷凍干燥樣品，共3瓶，瓶號(hào)分別為349、143和142。樣品由大連中食國(guó)實(shí)檢測(cè)技術(shù)有限公司提供。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 增菌

根據(jù)組織方作業(yè)指導(dǎo)書要求，樣品前處理按照作業(yè)指導(dǎo)書進(jìn)行，從冰箱中取出樣品后，待樣品達(dá)到室溫時(shí)方可開啟使用。西林瓶中處于高真空狀態(tài)，開啟時(shí)應(yīng)按照要求。樣品中含有活微生物，不可直接用手接觸西林瓶?jī)?nèi)樣品，從開啟樣品到測(cè)試結(jié)束均按照無菌操作進(jìn)行，在生物安全柜內(nèi)將大腸埃希氏菌O157:H7樣品的西林瓶打開，立即加入少量（2～4 mL）生理鹽水稀釋液進(jìn)行再水化，稀釋液合計(jì)40 mL，待溶解后，吸出放入無菌三角瓶中，反復(fù)用剩余的生理鹽水稀釋液清洗西林瓶?jī)?nèi)壁，回收清洗液放入上述的無菌三角瓶中，此溶液即是待測(cè)樣品原液（該40 mL液體即為待測(cè)原液，即100），全過程在20 min內(nèi)完成。取25 mL待測(cè)液加入含有225 mL mEC＋n肉湯的均質(zhì)袋中，在拍擊式均質(zhì)器上連續(xù)均質(zhì)1 min，充分勻質(zhì)混勻。依此方法，分別對(duì)3件樣品進(jìn)行處理。同時(shí)按照《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 大腸埃希氏菌O157:H7/NM檢驗(yàn)》（GB 4789.36—2016）作陽性對(duì)照實(shí)驗(yàn)。上述增菌液在36 ℃環(huán)境下培養(yǎng)24 h。

1.3.2 分離

取增菌后的mEC＋n肉湯，劃線接種于CTSMAC平板和大腸埃希菌O157顯色瓊脂平板上， 36 ℃培養(yǎng)24 h，觀察菌落形態(tài)。在CT-SMAC平板上，典型菌落為圓形、光滑、較小的無色菌落，中心呈現(xiàn)較暗的灰褐色；在大腸埃希菌O157顯色瓊脂平板上呈現(xiàn)紫紅色菌落。結(jié)果顯示，349、142在CTSMAC平板及大腸埃希菌O157顯色瓊脂平板上均無可疑菌落，143及標(biāo)準(zhǔn)菌株均有典型菌落生長(zhǎng)。

1.3.3 初步生化試驗(yàn)

從CT-SMAC平板和大腸埃希氏菌O157:H7顯色瓊脂平板上分別挑取5～10個(gè)可疑菌落，分別接種TSI瓊脂，同時(shí)接種MUG-LST肉湯，并用大腸埃希氏菌（ATCC 25922）作陽性對(duì)照和大腸埃希氏菌O157/H7（NCTC 12900）作陰性對(duì)照，于36 ℃培養(yǎng)24 h。同時(shí)進(jìn)行氧化酶和革蘭氏染色。在TSI瓊脂中，典型菌株為斜面與底層均呈黃色，產(chǎn)氣，不產(chǎn)硫化氫。置MUG-LST肉湯管于暗箱式紫外分析儀下觀察，MUG陽性的大腸埃希氏菌有熒光產(chǎn)生，MUG陰性的無熒光產(chǎn)生，大腸埃希氏菌O157:H7/NM為MUG試驗(yàn)陰性，無熒光。

1.3.4 鑒定

挑取可疑菌落，在營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上分純，于 36 ℃培養(yǎng)24 h，并進(jìn)行鑒定。①血清學(xué)試驗(yàn)。在營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上挑取分純的菌落，用O157和H7診斷血清作玻片凝集試驗(yàn)。②生化試驗(yàn)。自營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上挑取菌落，進(jìn)行生化試驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 初步生化試驗(yàn)

TSI、MUG-LST、氧化酶和革蘭氏染色結(jié)果見表1。

表1 TSI、MUG-LST、氧化酶和革蘭氏染色結(jié)果

2.2 血清學(xué)和生化試驗(yàn)鑒定結(jié)果與分析

①血清學(xué)試驗(yàn)。在營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上挑取分純的菌落，用O157和H7診斷血清作玻片凝集試驗(yàn)。143號(hào)及標(biāo)準(zhǔn)菌株在O157:H7血清上均凝集。②生化試驗(yàn)。自營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上挑取菌落，進(jìn)行生化試驗(yàn)，結(jié)果見表2。綜合生化和血清學(xué)試驗(yàn)結(jié)果，得知編號(hào)143的樣品檢出大腸埃希氏菌O157:H7，其余2個(gè)樣品均未檢出大腸埃希氏菌O157:H7。

表2 營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上可疑菌落生化結(jié)果

3 結(jié)論與討論

本次能力驗(yàn)證在規(guī)定時(shí)間內(nèi)提交結(jié)果，結(jié)果為滿意。通過此次試驗(yàn)總結(jié)出以下經(jīng)驗(yàn)。①能力驗(yàn)證工作較為復(fù)雜，對(duì)檢測(cè)人員的操作水平和檢測(cè)經(jīng)驗(yàn)要求極高[3]。因此，要提前熟悉檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，準(zhǔn)備好儀器設(shè)備，購(gòu)買相關(guān)試劑，確保滿足檢測(cè)需求。②在試驗(yàn)過程中應(yīng)注意，收到樣品后立即按要求于 -18 ℃冷凍保存，準(zhǔn)備開展檢測(cè)時(shí)，把樣品從冰箱取出后，待樣品達(dá)到室溫方可開啟使用，以防止出現(xiàn)假陰性。③確保能力驗(yàn)證的培養(yǎng)基試劑、菌株的質(zhì)量[4]。對(duì)培養(yǎng)基試劑、菌株按要求進(jìn)行全面的性能測(cè)試，避免因培養(yǎng)基試劑質(zhì)量問題導(dǎo)致結(jié)果偏差。④定性樣品中含有一些與目標(biāo)菌生化特征相似的背景菌，檢測(cè)中在挑取可疑菌落時(shí)應(yīng)按標(biāo)準(zhǔn)要求挑取足夠的可疑菌，避免沒有選中正確的陽性菌落，造成假陰性結(jié)果。⑤進(jìn)行生化試驗(yàn)時(shí)，對(duì)照生化鑒定試劑盒的說明書嚴(yán)格操作，注意賴氨酸脫羧酶、鳥氨酸脫羧酶應(yīng)用石蠟封層培養(yǎng)。不同的生化試驗(yàn)管培養(yǎng)溫度及時(shí)間有差異，培養(yǎng)過后還要進(jìn)一步滴加試劑，及時(shí)觀察結(jié)果并記錄。⑥檢測(cè)結(jié)束后，對(duì)所有使用過的玻璃器皿、增菌液、平板和生化試驗(yàn)管等及時(shí)進(jìn)行無害化處理，避免交叉污染[5]。

綜上所述，通過能力驗(yàn)證可充分了解檢測(cè)過程中存在的不足，因此實(shí)驗(yàn)室應(yīng)積極參加外部質(zhì)量控制活動(dòng)，注重能力驗(yàn)證活動(dòng)的開展，逐步提升實(shí)驗(yàn)室的技術(shù)水平，增強(qiáng)樣品檢測(cè)過程中的質(zhì)量意識(shí)。