陳 淼, 侯名語, 崔順立, 李 振, 穆國俊, 劉盈茹, 李秀坤, 劉立峰

華北作物改良與調(diào)控國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 華北作物種質(zhì)資源研究與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北省作物種質(zhì)資源實(shí)驗(yàn)室， 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院， 河北 保定 071001

引 言

花生是我國重要的經(jīng)濟(jì)作物， 年均總產(chǎn)量已達(dá)1 500萬噸， 約占世界總產(chǎn)的40%， 其中用來榨油的約占年產(chǎn)量的60%， 約30%的花生籽仁加工成喜聞樂見的小食品或直接被人們食用[1]。 花生籽仁中的糖含量是影響食味品質(zhì)的重要指標(biāo)， 直接影響消費(fèi)者的口感和花生的經(jīng)濟(jì)價值。 當(dāng)花生籽仁中蔗糖含量達(dá)到6%以上時， 口感較好。 已有研究結(jié)果表明花生籽仁中的總糖含量、 可溶性糖含量和蔗糖含量具有種質(zhì)差異。 李威濤[2]等采用高效液相色譜法檢測到28份花生品種的蔗糖含量為1.14%～8.38%。 Hou等[3]測定河北花生種質(zhì)57份， 總糖含量為7.81%～18.01%。 通過鑒定花生籽仁中各類型糖含量， 可篩選和培育到高糖含量的種質(zhì)， 滿足消費(fèi)者的需求。

鑒定花生糖含量最常用的方法有三種， 分別為比色法、 近紅外光譜法和示差折光法。 其中近紅外光譜分析法具有高效、 快速和不損傷種質(zhì)等特點(diǎn)， 在農(nóng)作物育種研究中已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用[4-5]。 在花生種子各成分含量鑒定上， 已建立了脂肪含量、 各脂肪酸含量和蛋白質(zhì)含量的近紅外模型。 秦利[6]、 唐月異[7]和雷永[8]等分別采用72份， 167份及185份基因型為材料， 分別構(gòu)建了適應(yīng)于瑞典波通DA7200近紅外分析儀、 Matrix-Ⅰ型傅里葉變換近紅外光譜儀及Spectra Star XL 近紅外光譜儀的花生籽粒蔗糖含量測定的近紅外模型。 花生籽仁總糖含量和可溶性糖含量鑒定的近紅外模型鮮有報道。

廣泛種植的栽培花生品種多為粉色種皮， 但為了適應(yīng)市場需求， 尤其是鮮食花生市場， 黑紫色、 紅色種皮花生因其含有豐富的花青素類抗氧化物質(zhì)， 更受消費(fèi)者青睞。 高通量篩選不同種皮顏色的高糖含量花生基因型是花生食味品質(zhì)育種的重要工作。 有研究表明樣品外觀顏色是影響近紅外分析的重要因素之一， 按樣品外觀顏色分類定標(biāo)(校正)更有利于提高模型的預(yù)測性能[9-10]。 已構(gòu)建的花生籽粒蔗糖含量近紅外模型[7-9]未涉及不同種皮顏色。

為更深入探索近紅外光譜分析法在花生籽仁糖含量鑒定上的應(yīng)用， 本研究選取不同種皮顏色的332份花生樣品進(jìn)行了可溶性糖、 蔗糖及總糖含量的測定， 采用近紅外儀掃描樣品的光譜， 構(gòu)建了不同種皮顏色花生籽仁的糖含量近紅外分析模型， 為高效選育食用型花生種質(zhì)提供技術(shù)支撐。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料

選用232份以四粒紅和冀農(nóng)黑3號為親本衍生的重組自交系群體和100份美國微核心種質(zhì)為試驗(yàn)材料。 并在本實(shí)驗(yàn)室資源庫中采用色差儀隨機(jī)選取三種種皮顏色各15份品種做模型驗(yàn)證。 所用到的種子均為2020年9月收獲于河北省河北農(nóng)業(yè)大學(xué)清苑試驗(yàn)基地。

1.2 花生種皮色度值測定

采用日本KONICA MINOLTA公司生產(chǎn)的CR-10 Plus色差儀測定花生種皮的色度值， 每個花生基因型分別取三粒飽滿， 無損壞的種子測定三次， 測定L*， a*， b*值， 取三次結(jié)果的平均值。 色差儀從L*(從黑到白， 0～100)、 a*(從綠到紅， -a～+a)， b*(從藍(lán)到黃， -b～+b)3個方面分別評價果實(shí)顏色。

1.3 光譜采集

采用瑞典波通 DA7250 近紅外分析儀(DA7250 Diode Array Analyzer)的SimplicityTM軟件進(jìn)行光譜信息采集， 如圖1所示。 光譜儀掃描波長范圍為950～1 650 nm， 環(huán)境溫度在24～25 ℃， 樣品在25 ℃左右恒溫放置48 h以上， 以減少溫度對樣品的影響。 儀器開機(jī)預(yù)熱30 min后， 每個樣品取均勻飽滿的種子裝入樣品杯中， 使表面平整。 掃描5次， 重復(fù)裝樣3次， 獲得平均光譜用于建模。

圖1 DA7250近紅外分析儀

1.4 花生籽粒中的糖含量測定

參照侯名語等[11]方法進(jìn)行樣品前處理， 將采集光譜后的花生籽仁去種皮， 稱取100 mg樣品用JXFSTPRP-24(上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司)砸樣機(jī)砸碎， 加石油醚(沸程： 60～90)脫脂三次， 作為脫脂樣品， 進(jìn)行不同糖含量的測定。 所有糖含量測定分別進(jìn)行三次生物學(xué)重復(fù)。

將準(zhǔn)備的100 mg脫脂樣品3份， 參照Hou[3]的3,5-二硝基水楊酸法測定花生籽粒中的總糖含量， 以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品。 參照王冬梅[12]的蒽酮比色法測定花生籽粒中的可溶性糖含量， 以蔗糖為標(biāo)準(zhǔn)品。 采用蔗糖含量檢測試劑盒G0531W(蘇州格銳思生物科技有限公司)進(jìn)行樣品的提取及測定。

1.5 模型構(gòu)建與優(yōu)化

采用挪威CAMO公司的化學(xué)計量學(xué)軟件The Unscrambler X10.4構(gòu)建模型， 將測得的糖含量化學(xué)值與采集的近紅外光譜導(dǎo)入The Unscrambler X10.4軟件， 采用多元散射校正(MSC)、 標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變量變換(SNV)、 一階導(dǎo)數(shù)(1stDerivative， 1st-der)、 二階導(dǎo)數(shù)(2ndDerivative， 2nd-der)、 S-G卷積平滑、 歸一化處理等預(yù)處理方法減少噪聲和誤差對光譜的影響[6]， 將預(yù)處理方法分別進(jìn)行單一處理及復(fù)合處理， 篩選出最佳的預(yù)處理方法。 對預(yù)處理后光譜及化學(xué)值用偏最小二乘回歸法(partial least squares regression， PLSR)建立定標(biāo)模型。 檢驗(yàn)時， 自動剔除較大剩余值的異常樣品， 然后再經(jīng)過反復(fù)交叉驗(yàn)證剔除異常值， 采用外部驗(yàn)證評價模型的穩(wěn)定性。 模型的評價參數(shù)主要由決定系數(shù)(R2)和標(biāo)準(zhǔn)誤差(RMSE)來衡量模型的預(yù)測精度[6]， 相關(guān)系數(shù)高且標(biāo)準(zhǔn)誤差小的模型穩(wěn)定性好。

1.6 模型的外部驗(yàn)證

三種顏色種皮的花生品種(系)各隨機(jī)選取15個， 采用建立的近紅外模型檢測其糖含量， 記錄近紅外模型的預(yù)測值和化學(xué)測定樣品的各種糖含量。 比較近紅外模型預(yù)測值與化學(xué)值的相關(guān)性和準(zhǔn)確性。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同種皮顏色花生的劃分

采用CR-10 Plus色差儀測定不同花生種皮的色度值， 由圖2(a,b,c)所示， 將332份花生樣品劃分成了黑紫色， 紅色和粉色三種不同顏色的種皮籽粒。 其中， 黑紫色種皮樣品120份， 紅色種皮樣品80份， 粉色種皮樣品132份。 花生不同種皮顏色(L*， a*， b*)最小值、 最大值、 均值以及標(biāo)準(zhǔn)差統(tǒng)計結(jié)果， 如表1所示。 從表1中可以看出， 不同種皮顏色綜合色度E值的均值分別為10.64(黑紫色)、 25.74(紅色)和29.23(粉色)。 隨著色澤參數(shù)L*均值的增大， 種皮的顏色越亮； 隨著色澤參數(shù)a*均值的增大， 顏色由淺紅色變?yōu)樯罴t色； 隨著色澤參數(shù)b*均值的增大， 顏色由低亮度黃色轉(zhuǎn)變?yōu)楦吡炼赛S色。 并將三個種皮顏色的綜合色差E值進(jìn)行了多重比較分析， 發(fā)現(xiàn)三個種皮顏色間均表現(xiàn)為差異極顯著， 說明采用顏色分類構(gòu)建模型是有意義的。

表1 不同種皮顏色色度值的統(tǒng)計分析

圖2 不同顏色種皮花生籽粒樣品

2.2 不同種皮顏色花生籽仁光譜采集

采集的黑紫色種皮樣品120份花生籽仁近紅外光譜如圖3所示， 紅色種皮樣品80份花生籽仁近紅外光譜如圖4所示， 粉色種皮樣品132份花生籽仁近紅外光譜如圖5所示， 由圖3—圖5可見， 花生樣品在950～1 650 nm范圍內(nèi)均有明顯吸收峰， 每個樣品存在多處吸收峰， 不同樣品的吸收峰強(qiáng)度不同。 表明掃描的近紅外光譜可以用于花生籽粒糖含量的定量分析。

圖3 黑紫色樣品的掃描光譜

圖4 紅色樣品的掃描光譜

圖5 粉色樣品的掃描光譜

2.3 花生仁中糖含量的化學(xué)分析

采用比色法測定332份花生籽粒中的糖含量， 樣品的化學(xué)測定結(jié)果如表2所示， 總糖含量范圍在6.42%～39.71%之間， 其中黑紫色籽仁差異最大， 在6.42%～39.53%之間； 可溶性糖含量范圍在2.19%～14.53%之間， 其中粉色籽仁差異最大； 蔗糖含量范圍在0.92%～7.99%之間， 其中粉色籽仁差異最大， 在0.95%～7.99%之間， 不同顏色種皮的籽粒糖含量變異系數(shù)在33.03%～44.89%之間。 秦利[6]和雷永[8]等在建立花生蔗糖模型時其變異系數(shù)分別為19.30%和40.66%。 結(jié)果表明， 本試驗(yàn)選擇花生材料的糖含量分布范圍廣， 變異系數(shù)大， 代表性好， 可以進(jìn)行近紅外光譜定標(biāo)預(yù)測。

表2 不同種皮顏色花生籽仁糖含量的化學(xué)測定結(jié)果

2.4 花生籽仁糖含量預(yù)測模型構(gòu)建

2.4.1 光譜預(yù)處理方法的選擇

一般常用的光譜預(yù)處理方法有多元散射校正(MSC)、 標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變量變換(SNV)、 一階導(dǎo)數(shù)(1stDerivative， 1st-der)和二階導(dǎo)數(shù)(2ndDerivative， 2nd-der)、 S-G卷積平滑、 歸一化處理(Normalize)、 基線校正(Baseline)等， 將其按基線校正， 散射校正， 平滑處理， 尺度與縮放等分別進(jìn)行單一預(yù)處理， 兩個預(yù)處理和三個預(yù)處理共計120種預(yù)處理方法對光譜進(jìn)行處理。 根據(jù)相關(guān)系數(shù)(R2)及標(biāo)準(zhǔn)誤差(RMSE)篩選出最佳的處理方法[13]。

本研究所建9個模型最佳光譜預(yù)處理方法如表3所示，均采用了兩種以上的預(yù)處理方法， 以保障模型的適用性。 用得比較多的處理方法是Detrend， Normalizalion和SNV三種處理方法。 其中， 黑紫色花生總糖含量、 可溶性糖含量和蔗糖含量的模型、 紅色花生蔗糖含量和總糖含量模型、 粉色花生總糖含量模型等6個模型用到了Detrend方法； 黑紫色花生總糖含量和蔗糖含量模型、 紅色花生可溶性糖含量模型、 粉色花生可溶性糖含量和蔗糖含量模型等5個模型用到了Normalizalion方法； 黑紫色花生總糖含量和蔗糖含量模型、 紅色花生總糖含量模型、 粉色花生總糖含量和蔗糖含量模型等5個模型用到了SNV處理方法。

表3 不同種皮顏色花生籽仁糖含量光譜值的最佳預(yù)處理方法及預(yù)測模型

2.4.2 花生籽仁糖含量定標(biāo)模型的構(gòu)建與驗(yàn)證

對不同顏色種皮花生中總糖含量、 蔗糖含量和可溶性糖含量的化學(xué)值和采集的近紅外光譜數(shù)據(jù)分別進(jìn)行擬合光譜處理， 采用偏最小二乘回歸法(PLSR)的化學(xué)計量學(xué)方法建立定標(biāo)模型， 反復(fù)采用內(nèi)部交叉驗(yàn)證剔除異常值， 通過模型的決定系數(shù)(R2)和定標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)差(RMSE)衡量定標(biāo)模型， 篩選最佳模型。 對沒有進(jìn)行定標(biāo)模型建立的三個顏色各15份品種分別進(jìn)行近紅外分析和化學(xué)方法測定， 作為外部驗(yàn)證集， 進(jìn)行模型預(yù)測。 樣品的校正模型的相關(guān)系數(shù)分別如表3和圖6(a—i, a1—i1)所示， 決定系數(shù)均大于0.88， 最大的是粉色種皮總糖含量的模型， 相關(guān)系數(shù)Rc可達(dá)0.925， 所建模型可以進(jìn)行有效預(yù)測。

所建模型經(jīng)外部驗(yàn)證， 各模型預(yù)測值與化學(xué)值的相關(guān)系數(shù)均在0.88以上(圖6)， 黑紫色花生總糖含量預(yù)測模型的預(yù)測值與化學(xué)值相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.967[圖6(c)]。 并計算了每個模型預(yù)測值與化學(xué)值之間的偏差， 偏差范圍分別是-0.75%～0.41%(黑紫色蔗糖)， -1.24%～0.85%(黑紫色可溶性糖)， -3.32%～1.79%(黑紫色總糖)， -0.5%～0.52%(紅色蔗糖)， -1.54%～0.44%(紅色可溶性糖)， -3.52%～3.18%(紅色總糖)， -0.79%～0.78%(粉色蔗糖)， -3.34%～0.57%(粉色可溶性糖)， -2.22%～2.43%(粉色總糖)。 9個模型預(yù)測值與化學(xué)值之間的偏差在-3.52%～3.18%之間， 相關(guān)系數(shù)Rp在0.892～0.967之間， 結(jié)果表明本研究所構(gòu)建的模型預(yù)測結(jié)果準(zhǔn)確， 可用于不同種皮顏色花生總糖、 可溶性糖和蔗糖含量的測定。

圖6 不同種皮顏色花生籽仁糖含量的校正模型及預(yù)測模型

近年來， 近紅外技術(shù)在品質(zhì)篩選中得到了廣泛的應(yīng)用[4-5]。 與之前秦利[6]、 唐月異[7]和雷永[8]等建立的花生蔗糖含量的預(yù)測模型相比較， 本研究構(gòu)建了總糖含量、 可溶性糖含量和蔗糖含量的近紅外測定模型， 可更系統(tǒng)地綜合評價花生籽仁的口感食用品質(zhì)。 且采用色差儀將花生種質(zhì)劃分為粉色、 紅色和黑紫色種皮花生， 更有利于特色食用性花生品種的培育。 本研究采用Perten公司生產(chǎn)的DA7250近紅外光譜儀建立糖含量的預(yù)測模型， 分級清楚， 模型的適用性廣泛。

3 結(jié) 論

基于色差儀對種皮顏色分級的基礎(chǔ)上構(gòu)建了黑色、 紅色、粉色種皮的總糖含量、 可溶性糖含量和蔗糖含量近紅外光譜模型， 定標(biāo)模型相關(guān)系數(shù)最高達(dá)0.925。 在剔除樣品顏色影響因素后， 所構(gòu)建的模型可系統(tǒng)、 全面地反映花生籽仁中各糖類碳水化合物的含量。

本研究所構(gòu)建的蔗糖、 可溶性糖、 總糖模型與同款機(jī)型上已有的蛋白質(zhì)、 脂肪酸、 油酸、 亞油酸等模型可同步、 快速、 無損的整體評價花生基因型的品質(zhì)， 為高通量花生品質(zhì)鑒定研究提供技術(shù)支撐。