胡仁智 夏 敏 趙世巧

（重慶市中醫(yī)院，重慶 400021）

急性髓性白血?。ˋML）是造血系統(tǒng)的惡性克隆性疾?。?］。目前主要采用放療、化療、基因治療、骨髓移植等方法，但是其治愈率較低，復(fù)發(fā)率高，且容易產(chǎn)生化療耐藥性［2］。中醫(yī)藥在抗腫瘤效應(yīng)、調(diào)節(jié)免疫、增強(qiáng)體質(zhì)、促進(jìn)骨髓抑制的恢復(fù)等方面具有一定的特色和優(yōu)勢［3］。雷公藤作為傳統(tǒng)中藥，其主要活性成分雷公藤甲素（TPL）主要來源于雷公藤根部，具有多種生物活性，如抗氧化、抗風(fēng)濕和抗癌等［4］。研究發(fā)現(xiàn)TPL可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生自噬、損傷DNA和抑制基因轉(zhuǎn)錄［5-6］。近年關(guān)于TPL對(duì)AML影響的文獻(xiàn)報(bào)道逐漸增多，但TPL在AML中的作用及機(jī)制研究尚不充分［7-8］。本研究旨在探討TPL對(duì)AML增殖與凋亡的影響及其分子機(jī)制，為TPL應(yīng)用于AML臨床治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 人源急性白血病細(xì)胞系HL-60、U937購自美國ATCC細(xì)胞庫；胎牛血清（FBS）、DMEM培養(yǎng)基、RPMI1640培養(yǎng)基購自Gibco公司；自Bio-Basic公司購買Western blot試劑；GAPDH抗體購自碧云天公司；PARP（46D11）、P62、LC3B抗體、Cleavage-Caspase 3均購自Cell Signaling Technology公司；Cytochrome c抗體從Santa Cruz公司購買，四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）均購自Sigma-Aldrich公司；自成都曼斯特生物科技有限公司購買TPL對(duì)照品；流式細(xì)胞儀（BD公司）；3-甲基腺嘌呤購自Selleck公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人源白血病細(xì)胞系HL-60、U937細(xì)胞用1640完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、1%谷氨酰胺）培養(yǎng)，培養(yǎng)條件包括37℃、5%CO2及飽和濕度，每2日傳代。

1.3 蛋白印跡檢測 處理HL-60和U937細(xì)胞后，提取線粒體和細(xì)胞質(zhì)蛋白質(zhì)和全細(xì)胞蛋白質(zhì)，并測定蛋白質(zhì)濃度，向蛋白質(zhì)溶液中加入負(fù)載緩沖液，96℃金屬浴10 min，在-80℃下保存。SDS-PAGE電泳后，PVDF膜通電3～4 h，5%脫脂奶粉密封1 h。加入抗體后，在4℃搖床上過夜，TBST 3次×洗滌，一抗4 min，二抗室溫孵育2 h，TBST洗滌3次后顯影。

1.4 MTT檢測 參考姜秀星等［9］實(shí)驗(yàn)方法，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)、分盤、培養(yǎng)，加入MTT工作液測量吸光度，計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.5 細(xì)胞凋亡率檢測 細(xì)胞計(jì)數(shù)后6孔板分盤，37℃培養(yǎng)24 h。加藥培養(yǎng)48 h。離心管收集細(xì)胞，每支管中加入 200 μL 1×binding buffer，再加入 Annexin VFITC 2 μL，5 μL PI，混勻后避光染色 15 min。加1×binding buffer 200 μL充分重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用Photoshop軟件分析Western blotting檢測結(jié)果，采用FlowJo軟件分析流式檢測數(shù)據(jù)，采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，兩樣本的組間比較采用t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.01。

2 結(jié) 果

2.1 TPL抑制急性髓性白血病細(xì)胞活性 MTT檢測TPL對(duì)HL-60、U937細(xì)胞的活性。藥物濃度設(shè)置為0、10、20、40、80 nmol/L，作用時(shí)間為24 h。結(jié)果顯示，梯度濃度雷公藤甲素均會(huì)導(dǎo)致兩種細(xì)胞存活率降低（P＜0.01），見表1。TPL對(duì)HL-60、U937細(xì)胞的IC50值為（36.67±3.15）、（33.86±2.84）nmol/L。

表1 雷公藤甲素對(duì)U934、HL-60細(xì)胞活性的影響（±s）

注：與空白組比較，*P＜0.01。下同。

項(xiàng)目U937 HL-60空白組100.000±0.000 100.000±0.000 10 nmol/L組82.767±2.450*84.967±2.468*20 nmol/L組62.967±2.003*67.100±2.200*40 nmol/L組43.333±2.815*36.633±2.470*80 nmol/L組29.967±1.704*26.267±3.035*

2.2 TPL誘導(dǎo)U937、HL-60細(xì)胞凋亡 Annexin VFITC和PI雙染色的方法處理HL-60、U937細(xì)胞，設(shè)置藥物濃度為0、10、20、40、80 nmol/L，細(xì)胞凋亡采用流式細(xì)胞儀檢測，通過統(tǒng)計(jì)學(xué)處理進(jìn)行定量分析3次重復(fù)數(shù)據(jù)，結(jié)果顯示TPL可促進(jìn)HL-60、U937細(xì)胞凋亡（圖1A、B）。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示差異有統(tǒng)計(jì)意義（P＜0.01），見表2。

表2 TPL對(duì)U934、HL-60細(xì)胞凋亡的影響（±s）

表2 TPL對(duì)U934、HL-60細(xì)胞凋亡的影響（±s）

項(xiàng)目U937 HL-60空白組2.300±0.700 2.767±1.041 10 nmol/L組10.733±1.172*12.967±2.948*20 nmol/L組35.967±1.122*36.033±2.219*40 nmol/L組51.733±1.387*78.900±2.452*80 nmol/L組71.600±3.800*83.800±2.166*

2.3 TPL誘導(dǎo)自噬過程，促進(jìn)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá) Western blotting對(duì)藥物處理U937細(xì)胞后自噬與凋亡相關(guān)蛋白以及胞漿蛋白中的細(xì)胞色素C（Cyto c（c））進(jìn)行檢測，實(shí)驗(yàn)分組為0、10、20、40、80 nmol/L。結(jié)果顯示（圖2A），TPL可引起自噬關(guān)鍵蛋白LC3B-Ⅱ表達(dá)水平升高，自噬降解底物蛋白P62表達(dá)水平降低，提示TPL可誘導(dǎo)自噬過程。凋亡相關(guān)蛋白PARP-1和Cleavage-Caspase 3蛋白表達(dá)升高，細(xì)胞色素C釋放到胞漿，提示TPL可能導(dǎo)致線粒體損傷（圖2B）。

圖2 Western blotting檢測自噬與凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)

2.4 3-MA預(yù)處理細(xì)胞減少TPL誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡 自噬抑制劑3-MA預(yù)處理U937細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)分組為：對(duì)照組、TPL（40 nmol/L）組、3-MA（5 mmol/L）組、TPL（40 nmol/L）+3-MA（5 mmol/L）組。流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡，結(jié)果顯示：3-甲基腺嘌呤預(yù)處理細(xì)胞后可明顯減少TPL誘導(dǎo)的U937細(xì)胞凋亡（圖3）。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示U937細(xì)胞經(jīng)3甲基腺嘌呤預(yù)處理后的凋亡率下降約38%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見表3。

圖3 流式細(xì)胞儀檢測3-MA預(yù)處理細(xì)胞對(duì)U937細(xì)胞凋亡的影響

表3 3-MA預(yù)處理細(xì)胞對(duì)U937細(xì)胞凋亡的影響（±s）

表3 3-MA預(yù)處理細(xì)胞對(duì)U937細(xì)胞凋亡的影響（±s）

注：與TPL組比較，*P＜0.01。

項(xiàng)目凋亡率TPL+3-MA組24.000±2.646*對(duì)照組1.900±0.265 TLP組62.167±1.795 3-MA組6.700±2.193

2.5 TPL抑制自噬減少凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá) 結(jié)果顯示，3-MA預(yù)處理細(xì)胞顯著抑制自噬過程（圖4A），阻斷TPL導(dǎo)致的PARP、Caspase 3的激活以及細(xì)胞色素C的線粒體釋放（圖4B）。

圖4 3-MA預(yù)處理細(xì)胞對(duì)自噬與凋亡相關(guān)蛋白的影響

3 討 論

AML是一種具有高度異質(zhì)性的疾病群，常見于成人，發(fā)病機(jī)制包括造血干細(xì)胞異常增殖、異常自我更新以及異常分化引起造血系統(tǒng)克隆性疾病［10］。古典醫(yī)籍中沒有急性白血病的明確記載，當(dāng)代中醫(yī)參照其發(fā)熱、出血、貧血及肝脾淋巴結(jié)腫大等臨床癥狀體征，將其歸屬為“瘰疬”“癥積”“熱勞”“急勞”“血證”“虛勞”等范疇，也有醫(yī)家將其歸屬為毒勞、髓毒、淋毒病、血癌等范疇［11-12］。據(jù)國家癌癥研究所統(tǒng)計(jì)AML5年存活率僅為26.9%，發(fā)病率和死亡率呈逐年上升趨式［13］。急性髓性白血病還具有高轉(zhuǎn)移、高復(fù)發(fā)、病程進(jìn)展快等特點(diǎn)，造成臨床治療難度增加，臨床治療效果不盡如人意［14］。而治療達(dá)到臨床緩解的患者中，有60%出現(xiàn)復(fù)發(fā)并逐漸對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥［15］。研究證實(shí)，白血病細(xì)胞的化療耐藥性是導(dǎo)致AML難治及復(fù)發(fā)的主要因素［16］。因此，尋求新的治療藥物，尤其是傳統(tǒng)中醫(yī)藥，將有助于提高AML白血病的治療效果。

李時(shí)珍《本草綱目》中，雷公藤名為“莽草”，治風(fēng)疽，疝氣腫墜凝血，治瘰疬，除濕風(fēng)，不入湯服。趙學(xué)敏《本草綱目拾遺》對(duì)上書進(jìn)行補(bǔ)充，雷公藤可治瘰疬，亦可截瘧。TPL是天然藥物雷公藤內(nèi)的一種有效成分，具有免疫抑制和抗感染作用，以往多用于自身免疫性疾病和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等疾病治療。近年來，研究發(fā)現(xiàn)TPL對(duì)包括白血病在內(nèi)的多種腫瘤細(xì)胞具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性，但對(duì)其抗AML作用的具體分子機(jī)制卻不甚了解。本研究中TPL可明顯誘導(dǎo)HL-60、U937細(xì)胞凋亡，并且隨TPL濃度增加呈現(xiàn)良好的量效關(guān)系。TPL可降低自噬降解底物蛋白P62表達(dá)，自噬標(biāo)志蛋白LC3-Ⅱ表達(dá)上調(diào)，說明TPL可誘導(dǎo)自噬。

自噬（autophagy）是細(xì)胞自身代謝需求和保持細(xì)胞器更新的細(xì)胞內(nèi)生理生化過程，在個(gè)體發(fā)育、細(xì)胞分化和免疫反應(yīng)等方面起著舉足輕重的作用，自噬功能紊亂可導(dǎo)致多種疾病發(fā)生［17］。自噬是細(xì)胞在應(yīng)激狀態(tài)如饑餓、寒冷、缺氧等條件下，利用溶酶體降解細(xì)胞內(nèi)受損物質(zhì)或代謝廢物成小分子的蛋白質(zhì)或者化合物使其回收利用的物質(zhì)降解過程［18］。在消除細(xì)胞內(nèi)有害物質(zhì)的同時(shí)，自噬還可以為細(xì)胞內(nèi)的生命活動(dòng)和組織重塑提供新的物質(zhì)，從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的循環(huán)利用［19-20］。自噬在抵抗損傷的同時(shí)，也會(huì)因過度激活而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。目前大部分化療藥物都是自噬的誘導(dǎo)劑，過度降解腫瘤細(xì)胞內(nèi)容物，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞無法進(jìn)行正常的物質(zhì)循環(huán)與能量代謝［21-22］。

本研究加入自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤預(yù)處理U937細(xì)胞，結(jié)果顯示U937細(xì)胞經(jīng)3甲基腺嘌呤預(yù)處理后的凋亡率下降約38%，3-MA預(yù)處理細(xì)胞顯著抑制自噬過程，阻斷TPL導(dǎo)致的PARP、Caspase 3的激活以及細(xì)胞色素C的線粒體釋放，TPL誘導(dǎo)的白血病細(xì)胞凋亡明顯減少。本研究表明TPL可誘導(dǎo)自噬過程進(jìn)而導(dǎo)致急性髓性白血病細(xì)胞U937、HL-60細(xì)胞凋亡，且呈現(xiàn)良好的量效關(guān)系，為TPL成為臨床治療白血病藥物提供理論基礎(chǔ)。