楊夢(mèng)霞 毛 昀 蘆殿榮 朱世杰 周 磊

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029；2.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院望京醫(yī)院，北京 100102；3.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙 410005）

疼痛是骨轉(zhuǎn)移癌患者常見(jiàn)并發(fā)癥，發(fā)生率為40%～70%，給晚期腫瘤患者的生存質(zhì)量帶來(lái)了嚴(yán)重不良影響［1］。盡管現(xiàn)代醫(yī)學(xué)上各種癌痛管理指南不斷出現(xiàn)，但仍有50%的患者沒(méi)有得到足夠的疼痛緩解［2］，45%的晚期患者會(huì)經(jīng)歷中到重度的疼痛［3］，并且癌痛發(fā)生率在過(guò)去40年中并未降低［4］。近年來(lái)，中醫(yī)藥工作者在長(zhǎng)期臨床實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)，中醫(yī)作為一種癌痛輔助治療的方法，在臨床上取得了一定療效。

歷代中醫(yī)典籍中雖沒(méi)有癌痛的明確記載，但根據(jù)其臨床表現(xiàn)，多將其歸于“痛證”范疇?！督饏T要略·臟腑經(jīng)絡(luò)先后病脈證并治》中有“病人語(yǔ)聲寂寂然喜驚呼者，骨節(jié)間病”，其描述與骨轉(zhuǎn)移癌痛相似；此外亦有“骨節(jié)疼痛”“骨痛肉枯”等可與骨轉(zhuǎn)移癌痛相聯(lián)系。腎主骨生髓，故其病位在腎，腎精不充、骨髓失養(yǎng)、癌毒乘虛入骨膠結(jié)不去導(dǎo)致骨腫瘤形成是骨轉(zhuǎn)移癌痛形成的前提，而后癌毒盤踞，可致筋骨經(jīng)絡(luò)失養(yǎng)或肌肉、骨骼等受壓，進(jìn)而發(fā)生疼痛。故在臨床實(shí)踐中，中醫(yī)治療多以扶正祛邪為主。本研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)總結(jié)全國(guó)名老中醫(yī)李佩文教授臨床用藥經(jīng)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，歸腎經(jīng)方“陰陽(yáng)雙補(bǔ)方”不僅對(duì)骨轉(zhuǎn)移有效，在癌痛治療方面也有著較好的臨床療效，前者作用機(jī)制已在團(tuán)隊(duì)前期研究中闡明［5］，而后者作用機(jī)制尚未清楚。因此本研究擬從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)角度對(duì)“陰陽(yáng)雙補(bǔ)方”治療癌痛的作用機(jī)制進(jìn)行初步探討，以便為今后癌痛臨床治療提供更多參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 陰陽(yáng)雙補(bǔ)方主要化合物篩選 在中藥數(shù)據(jù)庫(kù)TCMSP中，檢索陰陽(yáng)雙補(bǔ)方所有化合物，保留OB≥30%且DL≥0.18的成分；當(dāng)某些藥物化合物在TCMSP中檢索不到時(shí)，使用TCMID及TCM Database@Taiwan數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行補(bǔ)充。

1.2 陰陽(yáng)雙補(bǔ)方藥物靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 使用化合物信息數(shù)據(jù)庫(kù)PubChem檢索陰陽(yáng)雙補(bǔ)方主要化合物所對(duì)應(yīng)的SMILES化學(xué)結(jié)構(gòu)，并在Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫(kù)中根據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)相似性，保留相似度高的靶點(diǎn)；最后使用Cytoscape3.8.2中的cytoHubba插件，篩選出藥物Hub靶點(diǎn)并進(jìn)行可視化。

1.3 骨轉(zhuǎn)移癌疾病基因篩選 使用GeneCards疾病數(shù)據(jù)庫(kù)分別查詢骨轉(zhuǎn)移及癌痛基因，保留“Score≥15”的疾病基因。

1.4 陰陽(yáng)雙補(bǔ)方潛在治療靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 通過(guò)將“陰陽(yáng)雙補(bǔ)方”、骨轉(zhuǎn)移及癌痛基因進(jìn)行韋恩映射分析，篩選出潛在治療靶點(diǎn)；使用STRING11.5數(shù)據(jù)庫(kù)分析潛在治療靶點(diǎn)功能關(guān)聯(lián)情況并可視化。

1.5 “中藥-化合物-潛在治療靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖繪制 分別構(gòu)建“中藥-化合物-潛在治療靶點(diǎn)”關(guān)系表和節(jié)點(diǎn)屬性表，并將其導(dǎo)入Cytoscape3.8.2中，繪制多層次相互作用的“中藥-化合物-潛在治療靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖。

1.6 潛在治療靶點(diǎn)功能分析 在DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)中對(duì)潛在治療靶點(diǎn)進(jìn)行GO富集分析及KEGG通路富集分析（FDR ＜ 0.05）。

2 結(jié)果

2.1 陰陽(yáng)雙補(bǔ)方主要化合物 在中藥數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索到88個(gè)“陰陽(yáng)雙補(bǔ)方”主要化合物，見(jiàn)表1（根據(jù)每味藥OB值，僅列出排名前5的化合物）。

表1 陰陽(yáng)雙補(bǔ)方主要有效成分

2.2 陰陽(yáng)雙補(bǔ)方藥物靶點(diǎn) 檢索到陰陽(yáng)雙補(bǔ)方藥物靶點(diǎn)有673個(gè)；將這些靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape3.8.2中，發(fā)現(xiàn)這些靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)由657個(gè)節(jié)點(diǎn)、11 253條邊組成，同時(shí)使用cytoHubba插件篩選出排名前50的藥物靶點(diǎn)，見(jiàn)圖1。

圖1 陰陽(yáng)雙補(bǔ)方Hub靶點(diǎn)

2.3 陰陽(yáng)雙補(bǔ)方潛在治療靶點(diǎn) 在疾病基因數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索到483個(gè)骨轉(zhuǎn)移癌疾病基因、858個(gè)癌痛基因，將兩種疾病基因與673個(gè)藥物靶點(diǎn)進(jìn)行映射，得到94個(gè)交集基因即潛在治療靶點(diǎn)，見(jiàn)圖2。在STRING11.5數(shù)據(jù)庫(kù)中構(gòu)建潛在治療靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)，見(jiàn)圖3A；并在Cytoscape3.8.2中繪制“中藥-化合物-潛在治療靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖，見(jiàn)圖3B；同時(shí)進(jìn)行拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析，根據(jù)節(jié)點(diǎn)拓?fù)渲笜?biāo)Degree值，取排名前10的靶點(diǎn)繪制條形圖，見(jiàn)圖3C。

圖2 陰陽(yáng)雙補(bǔ)方靶點(diǎn)、骨轉(zhuǎn)移基因和癌痛基因的韋恩圖

圖3 陰陽(yáng)雙補(bǔ)方治療癌痛潛在靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)（3A）、“中藥-化合物-潛在治療靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖（3B）及關(guān)鍵靶點(diǎn)（3C）

2.4 陰陽(yáng)雙補(bǔ)方治療骨轉(zhuǎn)移癌痛潛在靶點(diǎn)的GO功能分析 根據(jù)“FDR＜0.05”，得到100個(gè)符合條件的條目（BP 57個(gè)、CC 12個(gè)、MF 31個(gè)），主要涉及磷脂酰肌醇磷酸化、MAPK級(jí)聯(lián)、質(zhì)膜、偽足及絲氨酸、蘇氨酸等各種激酶活性等，取各項(xiàng)排名前10的條目繪制氣泡圖，見(jiàn)圖4。

圖4 陰陽(yáng)雙補(bǔ)方治療癌痛潛在靶點(diǎn)的GO功能富集分析

2.5 陰陽(yáng)雙補(bǔ)方治療骨轉(zhuǎn)移癌痛潛在靶點(diǎn)的KEGG功能分析 根據(jù)“FDR＜0.05”，得到70條符合條件的通路，主要包含PI3K-Akt、FoxO、ErbB及VEGF信號(hào)通路等，取排名前30的通路繪制氣泡圖，見(jiàn)圖5。

圖5 陰陽(yáng)雙補(bǔ)方治療癌痛潛在靶點(diǎn)的KEGG通路富集分析

3 討 論

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為骨轉(zhuǎn)移癌痛的機(jī)制比較復(fù)雜，它包括炎癥和神經(jīng)病變等多個(gè)過(guò)程，涉及腫瘤微環(huán)境、骨細(xì)胞、激活的炎癥細(xì)胞和骨神經(jīng)支配神經(jīng)元之間的各種相互作用［6］。中醫(yī)學(xué)將癌痛的病機(jī)概括為“不通則痛”和“不榮則痛”：前者屬實(shí)證疼痛，包含痰、瘀、寒、毒等；后者屬虛證疼痛，病機(jī)多為正虛、陽(yáng)虛。在臨床實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)晚期惡性腫瘤骨轉(zhuǎn)移患者多以正虛為本，故治療上當(dāng)注重扶正。根據(jù)李佩文教授經(jīng)驗(yàn)化裁組成的陰陽(yáng)雙補(bǔ)方中以補(bǔ)骨脂、骨碎補(bǔ)補(bǔ)腎助陽(yáng)，肉蓯蓉補(bǔ)腎溫陽(yáng)，益精血，此外，骨碎補(bǔ)還可止痛，3藥相輔相成，補(bǔ)腎陽(yáng)止痛，共為君藥；熟地黃滋補(bǔ)腎精，山茱萸肉、山藥養(yǎng)肝補(bǔ)脾，俱為臣藥；淫羊藿、透骨草益腎強(qiáng)骨，透骨草還兼有舒筋通絡(luò)、活血止痛之效，兩藥合用，助君藥溫壯腎陽(yáng)止痛之功。諸藥合用，補(bǔ)腎之中兼顧養(yǎng)肝益脾，使腎精得充而虛損易復(fù)；溫陽(yáng)之中參以滋陰填精，則陽(yáng)得陰助而生化無(wú)窮，共奏補(bǔ)腎助陽(yáng)、益精止痛之效。

本研究通過(guò)構(gòu)建“中藥-化合物-潛在治療靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖發(fā)現(xiàn)，槲皮素、山柰酚及木樨草素等為其核心化合物。其中槲皮素不僅可通過(guò)調(diào)節(jié)RANKL/RANK/OPG信號(hào)通路和炎癥反應(yīng)來(lái)抑制破骨細(xì)胞活化，減少骨癌疼痛模型中的骨質(zhì)破壞，也可以通過(guò)調(diào)節(jié)PAR2/TRPV1信號(hào)通路來(lái)抑制骨癌疼痛中的外周/中樞致敏［7］。山柰酚可通過(guò)抑制白細(xì)胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等炎癥因子的聚集，降低對(duì)機(jī)械刺激和熱刺激的敏感性，從而有效緩解疼痛，這種鎮(zhèn)痛作用可能與MrgprD含量降低有關(guān)［8］。木樨草素可以通過(guò)抑制Lewis肺癌誘導(dǎo)的骨癌痛中的p38 MAPK磷酸化來(lái)抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的活化以及NLRP3炎癥小體，進(jìn)而緩解骨痛［9］。

通過(guò)Cytoscape軟件構(gòu)建陰陽(yáng)雙補(bǔ)方治療骨轉(zhuǎn)移癌痛的互作網(wǎng)絡(luò)圖，發(fā)現(xiàn)VEGFA、STAT3、ErbB2及Akt1等為其關(guān)鍵靶點(diǎn)。其中VEGFA可通過(guò)誘導(dǎo)感覺(jué)神經(jīng)元軸突生長(zhǎng)和存活作用于感覺(jué)神經(jīng)元，其受體VEGFR2在有髓A纖維和無(wú)髓C纖維感覺(jué)神經(jīng)元上都有表達(dá)［10］，且在外周和中樞感覺(jué)神經(jīng)系統(tǒng)中，當(dāng)VEGFA外顯子8可變剪接產(chǎn)生的VEGF-Axxxa增加、VEGFAxxxb表達(dá)降低時(shí)，VEGFR2即可被激活［11-12］。有研究認(rèn)為VEGF-Axxxa可使C纖維機(jī)械敏感的傷害感受器敏感，導(dǎo)致疼痛信號(hào)的傳遞增加和機(jī)械性異常性疼痛的發(fā)展［11］。STAT3磷酸化在骨癌疼痛中有重要作用，其抑制劑DR-1-55可延遲自發(fā)和誘導(dǎo)傷害性行為的發(fā)生和嚴(yán)重程度，降低促炎細(xì)胞因子IL-6和白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）的水平，因此認(rèn)為靶向磷酸化STAT3可能是治療癌痛的一種可行手段［13］。ErbB2可被高水平的NRG1激活，促進(jìn)脊髓中小膠質(zhì)細(xì)胞的生長(zhǎng)，這可能導(dǎo)致?lián)p傷后的神經(jīng)性疼痛［14-15］。研究認(rèn)為當(dāng)鞘內(nèi)施用外源性NRG1時(shí)可上調(diào)ErbB2、p-ErbB2 mRNA和蛋白質(zhì)水平、促進(jìn)Akt1的激活，進(jìn)而引發(fā)熱痛覺(jué)過(guò)敏和機(jī)械異常性疼痛［16］。

通過(guò)富集分析發(fā)現(xiàn)，陰陽(yáng)雙補(bǔ)方治療骨轉(zhuǎn)移癌痛的作用機(jī)制主要與抗炎、鎮(zhèn)痛、調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)等有關(guān)。PI3K-Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是體內(nèi)重要的信號(hào)通路之一，該通路激活后可以誘導(dǎo)和維持不同程度的痛敏反應(yīng)。有研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)向乳腺癌骨轉(zhuǎn)移疼痛模型大鼠鞘內(nèi)注射Akt抑制劑GSK690693后，可降低脊髓中Akt磷酸化水平并抑制PI3K/Akt信號(hào)通路，進(jìn)而緩解疼痛［17］。研究認(rèn)為FoxO信號(hào)通路可以調(diào)節(jié)與疼痛或神經(jīng)系統(tǒng)有關(guān)的凋亡活性［18］。VEGF可編碼基因VEGF-A、PLGF-2和VEGF-B，這些基因可以通過(guò)激活感覺(jué)神經(jīng)元中的VEGFR1來(lái)增強(qiáng)疼痛敏感性，而在同一模型中，阻斷VEGFR1可以減輕癌痛［19］；在疼痛模型中，周圍神經(jīng)系統(tǒng)和脊髓中mTOR活化水平可上調(diào)［20］，當(dāng)鞘內(nèi)注射mTOR抑制劑雷帕霉素時(shí)，可減輕神經(jīng)性疼痛［21］；同時(shí)，發(fā)現(xiàn)mTOR能夠通過(guò)使HIF失調(diào)來(lái)調(diào)節(jié)VEGF信號(hào)通路［22］，故認(rèn)為抑制mTOR/VEGF信號(hào)通路可以減輕神經(jīng)性疼痛［23］。

綜上所述，本研究首次運(yùn)用中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探索陰陽(yáng)雙補(bǔ)方治療骨轉(zhuǎn)移癌痛的多層次復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)“陰陽(yáng)雙補(bǔ)方”可能通過(guò)槲皮素、山柰酚及木樨草素等核心化合物作用于VEGFA、STAT3、ErbB2及Akt1等關(guān)鍵靶點(diǎn)，進(jìn)而調(diào)控PI3K-Akt、FoxO、VEGF及mTOR等信號(hào)通路，從而發(fā)揮抗炎、鎮(zhèn)痛、調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)等作用，對(duì)臨床應(yīng)用提供了一定的參考依據(jù)，也為其分子機(jī)制研究提供了新的思路。