鄒大軍，胡福德，周啟立，徐曉青

新生兒壞死性小腸結(jié)腸炎（NEC）是導致新生兒死亡的重要原因，而幸存的嬰兒也常出現(xiàn)嚴重的后遺癥，包括短腸綜合征、膽汁淤積和神經(jīng)發(fā)育受損［1］。NEC的病理生理機制仍不完全清楚。研究表明，在潰瘍性結(jié)腸炎的組織標本中發(fā)現(xiàn)了差異表達的miRNAs［2］。miRNAs在消化系統(tǒng)疾病中扮演關(guān)鍵角色［3］。miR-301a作為重要的miRNA已被視為結(jié)腸癌、胃癌的生物活性標志物［4-5］。然而，miR-301a在NEC中的作用尚不清楚。因此，本研究通過檢測miR-301a及相關(guān)炎性因子在小鼠NEC中的表達水平，探索miR-301a在NEC疾病進展中的可能作用及機制，為NEC的臨床研究提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 SPF級10日齡BALB/c小鼠60只，體質(zhì)量4.2～8.0 g，平均（6.0±1.3）g，購自承德醫(yī)學院動物研究中心（動物生產(chǎn)許可證號：SYXK冀2017-001），飼養(yǎng)在濕度45%～65%，溫度28～30℃的環(huán)境中。miR-301a拮抗劑（序列：mGmCmUmUmUmGmAmCmAmAmUmAmCmUmAmUmUmGm CmAmCmUmG）購自中國武漢金凱瑞生物工程有限公司。腫瘤壞死因子（TNF）-α（貨號：ml059766）、白細胞介素（IL）-6（貨號：ml63159）和IL-8（貨號：ml058632）酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測試劑盒均購自上海酶聯(lián)生物技術(shù)有限公司。兔抗人胱天蛋白酶（Caspase）-1抗體（貨號：22915-1-AP）購自美國Proteintech Group；兔抗人β-actin抗體（貨號：AC038）購自武漢ABclonal公司。Esbilac幼犬配方奶粉購自美國PetAg公司。QT-MIX-3型缺氧箱購自長沙長錦科技有限公司。Trizol試劑（貨號：15596026）購自賽默飛公司。反轉(zhuǎn)錄試劑盒（貨號：1708890）、SYBR Premix Ex TaqⅡ系統(tǒng)（貨號：1725124）、Image Lab 3.0軟件均購自伯樂公司。HE染色試劑盒（貨號：B0001 B0002）購自武漢博爾夫生物科技有限公司。細胞凋亡試劑盒（貨號：11684817910）購自羅氏公司。RIPA緩沖液（貨號：BL504A）購自北京蘭杰柯科技有限公司。

1.2 實驗動物分組 60只小鼠采用隨機數(shù)字表法分為對照組、NEC組、miR-301a拮抗劑組，每組20只。對照組小鼠與母鼠同籠，由母鼠喂養(yǎng)；NEC組和miR-301a拮抗劑組采用Esbilac幼犬配方奶粉每天經(jīng)口插管喂養(yǎng)4次，起始喂食量為0.1 mL，逐漸增加至0.25 mL。每天早晚2次喂養(yǎng)后將小鼠放入缺氧箱（5%O2、95%N2）持續(xù)10 min，隨即打開缺氧箱，將其置入冰箱冷藏，給予4℃刺激持續(xù)10 min，連續(xù)5 d，誘導NEC［6］。miR-301a拮抗劑組誘導NEC的同時給予miR-301a拮抗劑（20μL/d）喂養(yǎng)5 d。

1.3 取材 實驗期間每日觀察小鼠的一般情況，測體質(zhì)量。最后1次冷刺激后12 h，小鼠在麻醉下心臟采血，分離保存血清，取出十二指腸下段至直腸上段腸組織，保存一半新鮮組織，一半組織甲醛固定，石蠟包埋。

1.4 實時熒光定量PCR（qPCR）法檢測miR-301a和Caspase-1 mRNA表達 使用Trizol試劑從小腸組織中分離出總RNA。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后使用SYBR Premix Ex TaqⅡ系統(tǒng)行PCR。miR-301a引物：上游5′-ACACTCCAGCTGGGGCTCTGACTTTATTGC-3′，下 游5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGAGTAGT-3′；Caspase-1引物：上游5′-ATGGCCGACAAGGTCCTGAGG-3′，下游5′-GACATGATCGCACAGGTCTCGTG-3′；U6引物：上 游 5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下 游 5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。qPCR反應(yīng)條件：94℃2 min；94℃5 s，60℃30 s，40個循環(huán)。使用2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量。

1.5 HE染色和損傷評分 將上述石蠟包塊進行連續(xù)5μm切片，用二甲苯脫蠟、梯度乙醇至脫水后，進行HE染色，光鏡下觀察組織切片的病理改變。采用雙盲法對腸道組織進行損傷評分，標準如下：0分，腸壁結(jié)構(gòu)正常，上皮完整；1分，輕度的黏膜下和（或）固有層分離；2分，輕度的黏膜下和（或）固有層分離，黏膜下和（或）肌肉層水腫；3分，重度黏膜下和（或）固有層腫脹分離，黏膜下和（或）肌肉層水腫，局部絨毛脫落；4分，腸絨毛消失伴腸壞死。

1.6 ELISA檢測血清TNF-α、IL-6和IL-8的含量 使用ELISA試劑盒檢測小鼠血清中TNF-α、IL-6和IL-8的含量。通過分光光度法測定450 nm處吸光度（A）。根據(jù)標準曲線計算含量。

1.7 TUNEL染色測定小鼠腸組織的細胞凋亡情況 組織切片，按TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒說明書進行操作，每張切片選擇5個染色典型的不重疊的高倍視野，計數(shù)凋亡的細胞數(shù)和細胞總數(shù)，計算凋亡細胞百分比。

1.8 Western blot檢測Caspase-1蛋白表達水平 將獲取的腸道組織溶解在RIPA緩沖液中，并以14 000 r/min離心10 min。離心后，用BCA測定總蛋白質(zhì)濃度。在12%的SDS聚丙烯酰胺凝膠上分離等量的蛋白質(zhì)，并轉(zhuǎn)移至聚氟乙烯膜上，將膜與Caspase-1（1∶1 250）和β-actin（1∶500）一抗在4℃冰箱孵育過夜。在TBST中洗膜后，二抗（1∶5 000）室溫孵育2 h，漂洗后ECL顯影。最后用Image Lab 3.0軟件進行定量分析。

1.9 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 25.0進行數(shù)據(jù)處理，符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較行單因素方差分析，多重比較采用LSD-t法；計數(shù)資料以例（%）表示，組間比較行Z檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠行為學改變表現(xiàn)及體質(zhì)量 入組實驗時3組小鼠體質(zhì)量差異無統(tǒng)計學意義。對照組小鼠每天進食正常，體質(zhì)量穩(wěn)定增長，結(jié)束時體質(zhì)量增長最明顯；NEC組小鼠從第2天開始相繼出現(xiàn)精神萎靡、腹脹、進食障礙，體質(zhì)量較實驗前明顯減輕，并出現(xiàn)血便。與NEC組相比，miR-301a拮抗劑組小鼠上述表現(xiàn)出現(xiàn)較晚，且癥狀較輕，體質(zhì)量下降趨勢變緩，見圖1。

2.2 各組腸組織病理形態(tài)變化及損傷評分 HE病理染色結(jié)果顯示對照組小鼠腸組織結(jié)構(gòu)正常，腸道絨毛及上皮完整；NEC組小鼠腸壁全層大量炎性細胞浸潤，黏膜層、黏膜下層及固有層可見明顯的分離水腫，絨毛變性水腫，部分壞死；miR-301a拮抗劑組小鼠腸黏膜下和固有層腫脹分離程度及肌層水腫程度減輕，絨毛脫落情況及壞死也減輕，見圖2。與對照組（0.7±0.3）相比，NEC組（3.4±0.7）小鼠腸組織損傷評分升高，而miR-301a拮抗劑組（1.2±0.5）小鼠腸組織損傷評分降低，差異有統(tǒng)計學意義（n=20，F(xiàn)=172.000，P＜0.01）。

2.3 各組小鼠血清中炎性因子表達水平比較 與對照組相比，NEC組小鼠中TNF-α、IL-6和IL-8含量升高（P＜0.05）；與NEC組相比，miR-301a拮抗劑組小鼠血清中TNF-α、IL-6和IL-8含量下降（P＜0.05），見圖3A～C。

2.4 各組腸組織細胞凋亡水平 與對照組相比，NEC組腸組織凋亡指數(shù)顯著升高（P＜0.01）；與NEC組相比，miR-301a拮抗劑組腸組織凋亡指數(shù)顯著降低（P＜0.01），見圖3D。

Fig.2 Variations of HE staining in 3 groups of mice(HE staining,×200)圖2 3組小鼠腸組織病理改變（HE染色，×200）

Fig.3 Comparison of inflammatory factor expression and apoptosis level in intestinal tissue between three groups of mice圖3 3組小鼠腸組織炎性因子表達及細胞凋亡水平比較

2.5 各組腸組織中miR-301a和Caspase-1的mRNA及蛋白表達水平比較 qPCR結(jié)果顯示，與對照組相比，NEC組miR-301a和Caspase-1 mRNA表達水平明顯升高，與NEC組相比，miR-301a拮抗劑組miR-301a和Caspase-1 mRNA表達水平顯著下降（P＜0.01），見圖4A、B。Western blot結(jié)果顯示，與對照組比較，NEC組Caspase-1的蛋白水平明顯升高，miR-301a拮抗劑組降低了上述指標的表達水平，見圖4C。

Fig.4 Comparison of miR-301a and Caspase-1 protein expression levels in intestinal tissue between the three groups of mice圖4 3組小鼠腸組織miR-301a和Caspase-1 mRNA及Caspase-1蛋白表達水平比較

3 討論

NEC是新生兒胃腸道炎癥死亡的重要原因。研究表明炎癥級聯(lián)反應(yīng)是導致NEC發(fā)展的途徑［7］，該炎癥理論涉及到大量的炎性因子、受體和信號轉(zhuǎn)導途徑，它們通過激活腸道免疫反應(yīng)系統(tǒng)，導致腸壁損傷和壞死［8］。在潰瘍性結(jié)腸炎組織標本中發(fā)現(xiàn)了差異表達的miRNA，miRNA在炎癥中的作用尤其重要，是介導炎癥與組織修復的重要因素。研究表明，miRNA在能量代謝、免疫調(diào)節(jié)、內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)、細胞凋亡、細胞增殖和分化中起重要作用，對這些功能的干擾會導致細胞凋亡和炎癥的增加以及細胞修復能力的下降，這些在NEC的發(fā)病機制中至關(guān)重要［9］。miR-124通過靶向Rho關(guān)聯(lián)含卷曲螺旋結(jié)合蛋白激酶1（ROCK1）來抑制Toll樣受體9（TLR9）的表達，進而促進腸道細胞凋亡和炎性細胞浸潤，導致NEC的進展［10］。研究表明，miR-301a通過誘導炎癥性腸病中的IL-17A和TNF-α來促進腸黏膜炎癥［11］。然而，miR-301a在NEC中的作用尚不清楚。

多項研究已經(jīng)證明，由miRNA介導的RNA通過各種干擾途徑參與調(diào)節(jié)眾多免疫過程，進而在腸道炎癥中發(fā)揮重要作用［12］。Chen等［13］對NEC的細胞和動物模型的研究表明，miR-146a-5p的表達下調(diào)可以促進NEC中NLRP3炎性小體下游炎性因子和氯通道蛋白4（CLIC4）的表達，進而加重NEC的腸道炎癥損傷。另有研究表明，在腸道炎癥組織中高表達的miR-301a可以降低B細胞易位基因1（BTG1）的表達，從而降低上皮細胞的完整性，促進小鼠結(jié)腸的炎癥以及刺激腫瘤的發(fā)生［14］。Caspase-1作為新興的生物標志物在多種疾病中表達升高，同樣也是NEC的常用監(jiān)測因子，用于NEC的病情評估［15-16］。本研究表明，miR-301a在NEC小鼠的腸組織中高度表達，同時伴隨Caspase-1的表達升高，使用miR-301a拮抗劑干預后，小鼠腸組織的病理炎癥等級降低，Caspase-1的表達下降，這表明miR-301a在NEC的炎癥進展中起了重要作用。

研究表明，對于NEC患兒，IL-8、IL-10和TNFα可用作早期診斷的生物標志物［17-19］。IL-8作為中性粒細胞和巨噬細胞的化學吸引劑，其腸道表達與NEC相關(guān)，IL-8可用作進行NEC術(shù)前風險評估的標記，手術(shù)前6 h內(nèi)獲得的IL-8水平與手術(shù)期間觀察到的實際疾病嚴重程度呈正相關(guān)，而IL-8水平的升高與60 d死亡率有關(guān)［20］。本研究結(jié)果證實，NEC組腸組織miR-301a高表達，同時伴隨TNF-α、IL-6和IL-8的表達增加以及細胞凋亡率升高，而給予miR-301a拮抗劑治療后，炎性因子的表達均降低，細胞凋亡率下降，這表明miR-301a可能是NEC的潛在治療靶點。

綜上所述，miR-301a通過促進腸道組織細胞的凋亡而導致NEC的進展，而miR-301a可能是NEC的潛在治療靶點和預后標志物。但由于NEC發(fā)病機制的復雜性，miR-301a促進細胞凋亡并導致NEC進展的具體機制仍需要進一步探索。此外，由于實驗條件的限制，目前也僅在小鼠模型中觀察到了miR-301a對于NEC的促進作用，而miR-301a增加TNF-α、IL-6、IL-8和細胞凋亡水平的具體機制仍有待進一步研究。