平靜，周東華，朱大江，田杰，陳瑩，范菊花

Musashi家族是一類進化保守的RNA結(jié)合蛋白，包 括Musashi1和Musashi2兩 個 亞 型［1］。Musashi2比Musashi1表達更為廣泛，參與多種人類遺傳疾病及腫瘤發(fā)生發(fā)展的過程［2］。乳腺癌是我國女性發(fā)病率較高的惡性腫瘤，乳腺浸潤性導管癌是乳腺癌最常見的病理類型［3］。乳腺癌的分子分型與其臨床生物學特征有關(guān)，對評估患者的預后有重要意義［4］。有關(guān)Musashi2在不同分子亞型乳腺浸潤性導管癌組織中的表達及其臨床意義鮮見報道。本研究擬采用免疫組織化學及熒光原位雜交對乳腺浸潤性導管癌進行分子分型，檢測Musashi2蛋白在不同分子亞型乳腺浸潤性導管癌中的表達，探討其表達與臨床和分子病理特征及術(shù)后無病生存時間的相關(guān)性，以期探索新的與乳腺癌進展和預后有關(guān)的標志物。

1 材料與方法

1.1 材料 收集佛山市婦幼保健院病理科2013年3月—2019年3月經(jīng)病理確診且臨床資料齊全的125例女性乳腺浸潤性導管癌標本?；颊咝腥橄侔┣谐g(shù)，標本離體后立即進行書頁狀切開并用4%中性甲醛固定后取材。其中65例伴導管原位癌，123例伴正常乳腺組織，以癌周導管原位癌和正常乳腺組織作為研究對照。乳腺浸潤性導管癌按照世界衛(wèi)生組織（WHO）乳腺腫瘤分類標準（2012）［5］進行組織學分級：Ⅰ級11例，Ⅱ級90例，Ⅲ級24例。根據(jù)美國癌癥聯(lián)合會（AJCC）第8版標準［6］進行TNM分期：早期（Ⅰ+Ⅱ期）85例，晚期（Ⅲ+Ⅳ期）40例。乳腺癌分子分型參照《中國抗癌協(xié)會乳腺癌診治指南與規(guī)范（2015版）》［7］，其中Luminal A型24例，Luminal B型67例，人表皮生長因子受體-2（HER-2）過表達型17例，三陰型17例?；颊吣挲g33～71歲，平均（48±10）歲，術(shù)前均未做放、化療及免疫治療。

1.2 主要試劑 免疫組織化學染色抗體濃縮型兔抗人多克隆抗體Musashi2（1∶100）購自SAB公司，其余抗體包括雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）、HER-2和Ki67等均購自羅氏（Roche）公司。HER-2基因擴增試劑盒購自北京金菩嘉公司。

1.3 HE及免疫組織化學染色 乳腺癌手術(shù)切除標本離體后立即用4%中性甲醛固定6 h以上，對取材后的組織塊進行常規(guī)脫水、石蠟包埋，4μm厚連續(xù)切片，并用蘇木素伊紅（HE）染色，置于光學顯微鏡下觀察。免疫組織化學檢測所用儀器為羅氏公司Ventana BenchMark XT全自動免疫組織化學染色儀，按照Ventana全自動染色說明書設(shè)置染色程序。

1.4 結(jié)果判定 免疫組織化學檢測以腫瘤細胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒為Musashi2陽性。ER、PR和Ki67陽性標準均為腫瘤細胞核著棕黃色顆粒。HER-2蛋白陽性定位于腫瘤細胞膜，呈棕黃色。HER-2蛋白和基因檢測結(jié)果判定標準參照《乳腺癌HER2檢測指南（2014版）》［8］。HER-2免疫組織化學陽性分級判定標準為“+”：＞10%的浸潤癌細胞呈現(xiàn)不完整的、微弱的細胞膜染色；“++”：（1）＞10%的浸潤癌細胞呈現(xiàn)不完整和（或）弱至中等強度的細胞膜染色；（2）≤10%的浸潤癌細胞呈現(xiàn)強而完整的細胞膜染色；“+++”：＞10%的浸潤癌細胞呈現(xiàn)強而完整的細胞膜染色。對HER-2免疫組織化學檢測結(jié)果為“++”的病例進一步做熒光原位雜交（FISH）檢測。

1.5 FISH檢測 將乳腺癌組織切片過夜烘烤后進行脫蠟、乙醇梯度復水、漂洗、蛋白酶K工作液孵育，再次漂洗，乙醇梯度脫水，丙酮液浸泡后待玻片自然干燥，加熱玻片至56℃，再按照HER-2基因擴增試劑盒說明書進行后續(xù)操作。

1.6 分子分型 自2013年以來，以Ki67界定不同乳腺癌分子分型的界值有所變化，本研究根據(jù)參考文獻［7］，采用14%作為判斷Ki67高低的界值。具體分子分型標準為“Luminal A型”：ER、PR陽性且PR＞20%，HER-2陰性，Ki67≤14%；“Luminal B型”：（1）ER、PR陽性，HER-2陰性，且Ki67＞14%或PR≤20%；（2）ER、PR陽性，HER-2陽性（蛋白過表達或基因擴增），任何狀態(tài)的Ki-67；“HER-2過表達型”：HER-2陽性（蛋白過表達或基因擴增），ER、PR陰性；“三陰型”：ER、PR和HER-2均陰性［7］。

1.7 隨訪 術(shù)后通過門診復查、電話等方式進行隨訪，隨訪截止于2020年3月，隨訪時間12～85個月，平均隨訪時間（65±14）個月。無病生存時間定義為手術(shù)至腫瘤復發(fā)或患者死亡的時間。

1.8 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 19.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，計數(shù)資料用例（%）表示，組間比較行χ2檢驗或Fisher精確檢驗，采用Bonferroni法校正P值；相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)；采用Kaplan-Meier法進行生存分析并行Log-rankχ2檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 Musashi2在不同乳腺組織中的表達 Musashi2在乳腺浸潤性導管癌、導管原位癌和正常乳腺組織中的陽性率分別為56.80%（71/125）、63.08%（41/65）和21.95%（27/123），差異有統(tǒng)計學意義（χ2=42.078，P＜0.01），在乳腺浸潤性導管癌和導管原位癌中的陽性率明顯高于正常乳腺組織（χ2分別為31.501和31.154，P＜0.01），但Musashi2在乳腺浸潤性導管癌和導管原位癌中的表達差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。不同乳腺組織中Musashi2的表達情況見圖1。

Fig.1 Immunohistochemistry staining and fluorescence in situ hybridization of different tissues in breast cancer圖1 乳腺癌不同組織免疫組織化學染色及熒光原位雜交

2.2 Musashi2在不同分子亞型乳腺浸潤性導管癌組織中的表達 Musashi2蛋白陽性表達率在Luminal A型、Luminal B型、HER-2過表達型和三陰型中分別為70.83%（17/24）、68.66%（46/67）、29.41%（5/17）和17.65%（3/17），差異有統(tǒng)計學意義（χ2=21.582，P＜0.05）。Musashi2在Luminal A型 和Luminal B型中的陽性率明顯高于HER2過表達型（χ2分別為6.866和8.756）和三陰型（χ2分別為11.267和14.516），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），但在Luminal A型和Luminal B型中的表達差異無統(tǒng)計學意義（χ2=0.039，P＞0.05）。

2.3 Musashi2表達與乳腺浸潤性導管癌臨床病理特征的關(guān)系 Musashi2在TNM分期早期乳腺浸潤性導管癌患者的陽性率明顯高于晚期患者，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。不同年齡、腫瘤直徑、組織學分級，脈管是否受累和淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移情況下，Musashi2在乳腺浸潤性導管癌中的表達差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表1。

Tab.1 Comparison of positive expression rate of Musashi2 in invasive ductal carcinoma of breast between patients with different clinicopathological features表1 不同臨床病理特征的乳腺浸潤性導管癌患者Musashi2表達陽性率比較 ［例（%）］

2.4 Musashi2表達水平與ER、PR、HER-2和Ki67的相關(guān)性結(jié)果 Musashi2在ER、PR陽性的乳腺浸潤性導管癌組織中陽性率較高，而在ER、PR陰性的乳腺浸潤性導管癌組織中陽性率較低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），Musashi2表達水平與ER、PR呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）。Musashi2在乳腺浸潤性導管癌中的表達與HER-2和Ki67無相關(guān)性（P＞0.05），見表2。

Tab.2 The relationship between Musashi2 expression and molecular pathological features of breast invasive ductal carcinoma表2 Musashi2表達與乳腺浸潤性導管癌分子病理特征的關(guān)系 ［例（%）］

2.5 Musashi2表達與乳腺浸潤性導管癌患者預后的關(guān)系 術(shù)后隨訪125例乳腺浸潤性導管癌患者中Musashi2陽性表達71例，Musashi2陰性表達54例。Kaplan-Meier生存曲線表明Musashi2陽性組和陰性組術(shù)后無病生存時間差異無統(tǒng)計學意義［（67±12）個月vs.（63±15）個月，Log-rankχ2=0.752，P＞0.05］，見圖2。

3 討論

Fig.2 Survival curves of Musashi2 protein negative and positive expressions in patients with breast invasive ductal carcinoma圖2 Musashi2蛋白陰性和陽性乳腺浸潤性導管癌患者生存曲線

RNA結(jié)合蛋白Musashi1和Musashi2是與癌癥發(fā)生、進展和藥物耐受等多種關(guān)鍵生物學進程有關(guān)的調(diào)節(jié)因子［9］。人類Musashi2基因位于17q22染色體上，編碼分布于神經(jīng)、造血、胰腺和上皮組織干細胞的RNA結(jié)合蛋白［10］。Musashi2的識別基序通過與目標mRNA的3′端非翻譯區(qū)結(jié)合，在mRNA前處理或選擇性剪接過程中增加或減少其表達，干擾它們進入細胞質(zhì)或影響靶基因的穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)錄［11］。Musashi2在調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)和造血系統(tǒng)細胞增殖和分化過程中發(fā)揮重要作用。一些研究發(fā)現(xiàn)Musashi2在宮頸癌［12］、前列腺癌［13］、胃癌［14］和胰腺癌［15］等多種惡性腫瘤中高表達，并與其預后不良有關(guān)。

Musashi2是一種復雜的多功能蛋白，其功能不僅取決于細胞類型，還與其所處的微環(huán)境有關(guān)，Musashi2在不同腫瘤組織中的表達水平及其對腫瘤細胞的影響可能有所不同［16-17］。乳腺癌是一種高度異質(zhì)性的惡性腫瘤，具有不同的免疫表型、治療反應(yīng)及預后［18］。乳腺浸潤性導管癌的分子亞型中，Luminal A型對內(nèi)分泌治療敏感、預后好；Luminal B型在接受內(nèi)分泌治療后無病生存率較高；而HER-2過表達型和三陰型惡性程度較高，復發(fā)轉(zhuǎn)移較早，預后較差［19］。有關(guān)Musashi2在乳腺癌中的表達及與其分子分型的相關(guān)性研究鮮見報道。Katz等［20］分析來自癌癥基因組圖譜的RNA測序數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)Musashi2在至少50%的乳腺癌中表達上調(diào)，體外細胞培養(yǎng)研究發(fā)現(xiàn)管腔型（Luminal A型和Luminal B型）乳腺癌細胞系中Musashi1和Musashi2的表達高于三陰型。本研究結(jié)果證實，Musashi2在乳腺浸潤性導管癌和導管原位癌中的陽性率明顯高于正常乳腺組織。在進一步研究Musashi2在不同分子亞型乳腺浸潤性導管癌組織中的表達時發(fā)現(xiàn)，Musashi2在Luminal A型中陽性率最高，在Luminal A型和Luminal B型中的陽性率明顯高于HER-2過表達型和三陰型，與Katz等［20］的研究結(jié)果一致。筆者在對Musashi2與乳腺浸潤性導管癌臨床病理特征的關(guān)系進行研究時發(fā)現(xiàn)，Musashi2在早期乳腺浸潤性導管癌病例中的陽性率明顯高于晚期病例，但在不同年齡、腫瘤直徑、組織學分級，脈管是否受累和淋巴結(jié)有無轉(zhuǎn)移的乳腺潤性導管癌，Musashi2的表達差異無統(tǒng)計學意義。基于以上研究結(jié)果，筆者推測Musashi2可能在早期乳腺浸潤性導管癌中發(fā)揮作用。李菲菲［21］研究發(fā)現(xiàn)過表達Musashi2可抑制乳腺癌模型小鼠腫瘤細胞及新生血管的生長，從而降低其惡性程度。Musashi2高表達的乳腺浸潤性導管癌不容易發(fā)生增殖、浸潤和轉(zhuǎn)移，其機制可能是Musashi2蛋白過表達抑制了乳腺上皮細胞轉(zhuǎn)變成間充質(zhì)細胞所需因子Jagged1的翻譯，促使細胞維持在上皮狀態(tài)，從而抑制乳腺癌細胞轉(zhuǎn)移。因此，對乳腺浸潤性導管癌進行Musashi2檢測能在一定程度上評估其生物學行為。

一般來說，ER、PR陽性的乳腺癌分化程度較好、進展較慢，術(shù)后不易復發(fā)，且對激素治療的敏感性高，采用內(nèi)分泌治療能明顯改善患者預后［22］。雌激素受體1（ESR1）是乳腺癌治療與預后評價的分子標志物和治療靶點，ESR1可調(diào)控多個下游基因（例如FOXA1、GATA3、CCND1和TFF1等），Musashi2能與ESR1 mRNA及ESR1靶基因如GATA3和FOXA1相結(jié)合，在調(diào)節(jié)ESR1功能方面發(fā)揮協(xié)同作用。Kang等［23］研究發(fā)現(xiàn)Musashi2在ER和PR陽性的乳腺癌中高表達，Musashi2是ESR1的上游調(diào)節(jié)因子。Musashi2通過直接結(jié)合ESR1的3′端非翻譯區(qū)調(diào)節(jié)ESR1 mRNA并增強ESR1蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，從而維持ESR1功能。Musashi2與ESR1表達密切相關(guān)，并可能影響乳腺癌患者的預后。在接受內(nèi)分泌治療的ER陽性乳腺癌患者，Musashi2水平可以預測接受他莫昔芬治療患者的預后，Musashi2高表達患者的無復發(fā)生存率和總生存率明顯優(yōu)于Musashi2低表達患者［23］。本研究同樣發(fā)現(xiàn)Musashi2在ER、PR陽性的乳腺浸潤性導管癌組織中陽性率較高，且Musashi2表達水平與ER、PR呈顯著正相關(guān)，可輔助乳腺浸潤性導管癌患者合理地選擇內(nèi)分泌治療方案。筆者在對Musashi2表達與乳腺浸潤性導管癌患者的預后進行Kaplan-Meier生存分析時發(fā)現(xiàn)，Musashi2陽性組和陰性組患者無病生存時間差異無統(tǒng)計學意義，可能與本組研究納入的樣本數(shù)量偏少以及隨訪時間較短有關(guān)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)Musashi2蛋白在乳腺浸潤性導管癌組織中的表達與其分子分型和TNM分期有關(guān)，Musashi2高表達提示腫瘤惡性程度較低。Musashi2與乳腺浸潤性導管癌不同分子分型標志物之間相互作用的信號轉(zhuǎn)導機制仍需在細胞及分子水平深入研究。