劉凌云，毛涵，朱襲嘉

在人類肝臟原發(fā)腫瘤中，肝內膽管細胞癌（intrahepatic cholangiocarcinoma，ICC）發(fā)病率僅次于肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC），占肝臟原發(fā)惡性腫瘤的10%～15%［1］。全球范圍內ICC發(fā)病率及病死率呈快速增長趨勢［2］。由于ICC惡性程度高，根治性切除術后患者的5年生存率僅為20%～40%［3］。叉頭盒蛋白M1（forkhead box protein M1，FoxM1）是叉頭基因家族成員，人類FoxM1基因位于染色體12p13.3末端著絲粒區(qū)域，長約25 kb，包括10個外顯子。FoxM1在細胞由G1期至S期分化過程中及保持染色體穩(wěn)定性方面起到關鍵作用，是調節(jié)細胞增殖和凋亡的重要轉錄因子［4］。FoxM1可通過增強細胞增殖能力促進腫瘤形成，而且在晚期腫瘤中促進腫瘤侵襲和轉移［5］。目前研究發(fā)現FoxM1在多種實體瘤中高表達，如乳腺癌［6］、HCC［7］及胃癌［8］等，并且與其預后、復發(fā)及轉移相關。然而，FoxM1在ICC中的作用及機制尚未完全清楚。基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）是鋅鈣依賴肽鏈內切酶家族成員，其中MMP-9和MMP-2與腫瘤轉移密切相關［9］。阻斷FoxM1信號轉導能通過抑制MMP-2表達，從而降低肝細胞癌干細胞樣細胞的遷移和侵襲［10］。目前MMP-9和MMP-2在ICC中的作用尚不十分清楚，探索其對ICC的影響及是否與FoxM1相互關聯(lián)具有重要意義。本研究利用慢病毒載體轉染ICC細胞株，構建FoxM1上調及下調的穩(wěn)定轉染細胞株，并觀察FoxM1表達變化對ICC細胞生物學行為及MMP-9和MMP-2表達的影響，為臨床ICC的診治奠定實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 人ICC細胞株HCCC-9810、RBE和SSP-25（中國科學院上海生命科學研究院）；RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清（美國Life Technologies公司）；LV-FoxM1-RNAi、FoxM1過表達慢病毒、聚凝胺（中國吉凱基因公司）；Trizol（美國Invitrogen公司）；SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ（Tli RNase H Plus，貨號RR820A，日本TaKaRa公司）；RIPA蛋白提取試劑盒、PMSF蛋白酶抑制劑、BCA蛋白含量檢測試劑盒（南京凱基生物科技公司）；超敏ECL化學發(fā)光試劑盒（美國Millipore公司）；FoxM1兔抗人多克隆抗體（英國Abcam公司）；MMP-9及MMP-2兔抗人多克隆抗體（美國Proteintech公司）；山羊抗兔二抗、GAPDH抗體（北京博奧森生物有限公司）；MTT細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒（南京凱基生物科技公司）；Transwell小室（美國Corning公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 將復蘇的HCCC-9810、RBE和SSP-25細胞分別置于含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中進行常規(guī)的細胞培養(yǎng)和傳代。

1.2.2 Western blot檢測ICC細胞系FoxM1及MMP-9、MMP-2蛋白表達 收集各種生長狀態(tài)良好的ICC細胞，加入RIPA和PMSF提取總蛋白，然后BCA法檢測總蛋白含量，將已定量的總蛋白液與加樣緩沖液以5∶1比例混合，經蛋白變性后制成待檢測樣品。配制5%濃縮膠和10%分離膠，將蛋白質樣品加入各孔道配平，進行SDS-PAGE電泳。電泳產物以恒壓電轉至PVDF膜（80 V 30 min，110 V 60 min），室溫下用5%蛋白封閉液于搖床上緩慢封閉2 h，用TBST漂洗后加入稀釋的一抗（FoxM1、MMP-9、MMP-2：1∶1 000；GAPDH：1∶2 000）低速水平搖床上4℃孵育過夜，次日TBST漂洗后加入稀釋的山羊抗兔二抗（1∶10 000），室溫低速搖床孵育1 h，洗膜后滴加配好的ECL化學發(fā)光液曝光成像。以GAPDH為內參，圖像處理軟件Image J對蛋白條帶進行半定量分析。

1.2.3 慢病毒轉染ICC細胞株 慢病毒載體帶有綠色熒光蛋白基因和嘌呤霉素抗性等特征，即轉染成功后的細胞可以正常表達綠色熒光并對嘌呤霉素耐藥。按照慢病毒轉染手冊，轉染前24 h，選取生長狀態(tài)良好的目標細胞，常規(guī)培養(yǎng)條件下，24孔板每孔加入（2～10）×104個細胞進行培養(yǎng)。24 h后細胞融合率達到70%～90%時，吸除舊培養(yǎng)基，每孔加入0.5 mL懸浮稀釋的慢病毒（5～8 mg/L，已加入含有聚凝胺的無血清RPMI 1640培養(yǎng)基，分為上調組HCCC-9810-FoxM1及下調組SSP-25-shFoxM1），同時以對照陰性慢病毒（加有聚凝胺）轉染目的細胞建立對照組細胞株（分為HCCC-9810-Control組及SSP-25-Control組），細胞常規(guī)于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。轉染后12 h觀察細胞生長狀態(tài)，如無明顯毒性作用，約48 h后更換常規(guī)培養(yǎng)基。轉染后96 h可在倒置相差熒光顯微鏡下觀察細胞綠色熒光蛋白表達情況。細胞綠色熒光蛋白表達亮度較好并生長穩(wěn)定情況下，加入嘌呤霉素（1 mg/L）篩選去除轉染差的細胞，Western blot檢測各組轉染后細胞中FoxM1蛋白表達變化情況，細胞熒光高表達及生長穩(wěn)定后可繼續(xù)培養(yǎng)進行后續(xù)細胞實驗。

1.2.4 MTT法檢測轉染后各組ICC細胞增殖力 取各組對數生長期的細胞計數，96孔板中每孔加入（5～10）×103個細胞（100μL），邊緣孔加入無菌PBS液，每組細胞設5個平行對照孔，5%CO2、37℃條件下培養(yǎng)，倒置顯微鏡觀察48 h和72 h細胞生長情況。實驗結束前4 h加入5 g/L MTT液10μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄去培養(yǎng)液，每孔加入200μL DMSO，37℃搖床震蕩10 min，待結晶充分溶解后在酶標儀上檢測490 nm波長下每孔的光密度（OD）值，繪制生長曲線。

1.2.5 Transwell實驗檢測FoxM1對ICC細胞侵襲的影響 將預冷的RPMI 1640無血清培養(yǎng)基與Matrigel Matrix基質膠按體積比1∶8比例充分混勻稀釋，每孔加入50μL上述稀釋液至小室聚碳酸酯膜（小室底膜）的上室面，37℃培養(yǎng)箱中放置4 h使其聚合成凝膠。上室加入準備好的細胞懸液（HCCC-9810組，1×105個/孔，100μL；SSP-25組，5×104個/孔，50μL）。下室加入600μL含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基。種板時需避免產生氣泡，常規(guī)細胞培養(yǎng)48 h后取出小室，用棉簽頭輕柔擦掉小室上層細胞，4%多聚甲醛固定小室30 min，再用0.1%結晶紫染色30 min，PBS洗凈風干后顯微鏡下隨機讀取5個視野（上、中、下、左及右）小室下表面細胞計數并拍照。該實驗同樣條件下重復3次。

1.2.6 qPCR檢測FoxM1變化對ICC細胞MMP-9及MMP-2 mRNA表達的影響 收集各組對數生長期細胞，用Trizol法提取其總RNA，按照逆轉錄試劑盒說明書合成cDNA。取逆轉錄產物2μL，總體系20μL，使用TaKaRa公司SYBR Green染料法進行qPCR反應，GAPDH為內參，反應條件為：95℃預變性30 s；95℃變性5 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，40個循環(huán)。使用NCBI在線Primer Blast設計引物，反應體系中引物序列見表1。每個樣本均設3個復孔，重復3次取平均值。記錄各階段Ct值，用2-ΔΔCt法計算mRNA相對表達量。

Tab.1 qPCR sequence of primers表1 qPCR檢測引物序列

1.3 統(tǒng)計學方法 使用GraphPad Prism 6.0和SPSS 20.0軟件包進行數據分析。符合正態(tài)分布的計量資料采用均數±標準差（±s）表示，2組間均數比較采用配對t檢驗，多組間均數比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用Tukey法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 ICC細胞株中FoxM1蛋白表達情況 Western blot檢測3種ICC細胞株HCCC-9810、RBE和SSP-25的FoxM1蛋白表達水平分別為0.24±0.05、0.82±0.04、1.74±0.10（F=347.600，P＜0.01），SSP-25細胞株表達最高，HCCC-9810表達最低，見圖1。

Fig.1 Expression levels of FoxM1 protein in ICC cell lines圖1 ICC細胞株中FoxM1蛋白表達情況

2.2 ICC穩(wěn)定轉染細胞株的建立及鑒定 選取HCCC-9810作為上調FoxM1目標細胞株（HCCC-9810-FoxM1組），SSP-25作為下調FoxM1目標細胞株（SSP-25-shFoxM1組）。2株細胞轉染效率均達90%以上，進一步使用添加嘌呤霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基（1 mg/L）篩選，2株細胞均能持續(xù)表達綠色熒光蛋白且生長狀態(tài)良好，見圖2。Western blot檢測結果提示HCCC-9810-FoxM1組較HCCC-9810-Control組FoxM1表達穩(wěn)定上調（1.53±0.11vs.0.38±0.05，t=13.990，P＜0.01），而SSP-25-shFoxM1組較SSP-25-Control組FoxM1表達穩(wěn)定下調（0.20±0.05vs.0.87±0.07，t=10.480，P＜0.01），見圖3。

Fig.2 Representative graph of green fluorescent protein expression in ICC cell lines after lentivirus transfection圖2 慢病毒轉染后ICC細胞株綠色熒光蛋白表達圖

Fig.3 Expression of FoxM1 in ICC stably transfected cell lines圖3 ICC穩(wěn)定轉染細胞株FoxM1表達情況

2.3 ICC細胞增殖能力比較 MTT實驗結果顯示，實驗開始48 h后HCCC-9810-FoxM1組增殖能力明顯高于HCCC-9810-Control組，而SSP-25-shFoxM1組增殖能力明顯低于SSP-25-Control組（均P＜0.05），見表2。

Tab.2 Comparison of the proliferation ability between the four groups of ICC cells表2 各組ICC細胞增殖能力對比（n=3，OD490，±s）

Tab.2 Comparison of the proliferation ability between the four groups of ICC cells表2 各組ICC細胞增殖能力對比（n=3，OD490，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01。

組別HCCC-9810-Control組HCCC-9810-FoxM1組t SSP-25-Control組SSP-25-shFoxM1組t 24 h 0.36±0.01 0.34±0.02 1.107 0.35±0.01 0.36±0.01 0.725 48 h 0.76±0.07 1.07±0.10 4.544＊0.81±0.06 0.59±0.06 3.908＊72 h 1.21±0.08 2.08±0.08 11.322＊＊1.65±0.09 1.02±0.09 7.288＊＊

2.4 FoxM1表達變化影響ICC細胞的侵襲能力 Transwell小室侵襲實驗結果表明，HCCC-9810-FoxM1組的穿透細胞數目明顯高于HCCC-9810-Control組（單 位：個/視 野，394.00±9.64vs.219.00±12.53，t=21.650，P＜0.01）；而 SSP-25-shFoxM1組穿透細胞數目明顯低于SSP-25-Control組（197.00±10.58vs.463.67±20.50，t=32.000，P＜0.01），見圖4。

Fig.4 Transwell cell invasion test(×100)圖4 Transwell小室侵襲實驗（×100）

2.5 FoxM1表達變化影響ICC細胞MMP-9及MMP-2 mRNA表達 HCCC-9810-FoxM1組中MMP-9及MMP-2 mRNA表達水平較HCCC-9810-Control組明顯升高，而SSP-25-shFoxM1組中MMP-9及MMP-2 mRNA表達水平較SSP-25-Control組明顯降低（均P＜0.01），見表3。

3 討論

ICC的生物學行為較HCC更具侵略性，預后較HCC更差［11］。而ICC肝切除術后復發(fā)及轉移是導致ICC術后生存率低的主要因素［3，12］。目前，由于缺乏敏感性和特異性高的生物標志物，ICC早期診斷困難［11］，從而直接影響ICC的后續(xù)治療及預后。因此，尋找有效的生物標志物，對于提高ICC早期診斷率及療效具有重要的臨床意義。

Tab.3 Effects of FoxM1 expression changes on the relative expression levels of MMP-9 and MMP-2 mRNA in ICC cells表3 FoxM1表達變化對ICC細胞MMP-9及MMP-2 mRNA相對表達量的影響 （n=3，±s）

Tab.3 Effects of FoxM1 expression changes on the relative expression levels of MMP-9 and MMP-2 mRNA in ICC cells表3 FoxM1表達變化對ICC細胞MMP-9及MMP-2 mRNA相對表達量的影響 （n=3，±s）

＊＊P＜0.01。

組別HCCC-9810-Control組HCCC-9810-FoxM1組t SSP-25-Control組SSP-25-shFoxM1組t MMP-9 1.08±0.12 2.29±0.25 10.464＊＊1.05±0.05 0.47±0.01 10.521＊＊MMP-2 1.00±0.09 2.40±0.31 15.640＊＊1.04±0.03 0.53±0.08 15.992＊＊FoxM1 1.05±0.11 2.71±0.28 15.044＊＊1.03±0.04 0.27±0.11 18.603＊＊

FoxM1在惡性腫瘤細胞發(fā)生、增殖和侵襲轉移等方面發(fā)揮重要作用。一項研究通過siRNA干擾非漿液性上皮性卵巢癌細胞株FoxM1表達，發(fā)現下調FoxM1表達可抑制腫瘤細胞生長和克隆形成［13］。另一項研究報道FoxM1影響HCC組織染色體穩(wěn)定性，在HCC發(fā)生發(fā)展中起到促進作用［14］。Yu等［15］發(fā)現FoxM1在高轉移潛能HCC細胞MHCCLM3中的表達較低轉移潛能細胞SMMC7721明顯升高，并且與HCC細胞遷移及侵襲密切相關，從而促進HCC轉移。FoxM1在多種惡性腫瘤包括HCC的發(fā)生發(fā)展及侵襲轉移等演進過程中具有重要作用，深入研究其特點及機制具有重要價值。而目前FoxM1影響ICC細胞惡性表型方面的功能尚不清楚，在ICC細胞的增殖、侵襲轉移方面的作用機制尚需進一步闡明。

本研究首先運用Western blot技術分別檢測3種ICC細胞株中FoxM1蛋白表達水平，發(fā)現SSP-25細胞株中FoxM1表達最高，HCCC-9810中表達最低，決定選取HCCC-9810作為上調FoxM1細胞株，SSP-25作為下調FoxM1細胞株。筆者選用目前已經廣泛使用且穩(wěn)定性高、特異性強的慢病毒載體作為FoxM1轉染實驗手段，經過反復實驗及摸索最佳轉染條件，成功建立了FoxM1穩(wěn)定轉染ICC細胞株。隨后經Western blot驗證，HCCC-9810-FoxM1、SSP-25-shFoxM1及兩種相應對照細胞株HCCC-9810-Control、SSP-25-Control均能持續(xù)穩(wěn)定表達FoxM1，且HCCC-9810-FoxM1上調FoxM1表達明顯，SSP-25-shFoxM1則下調明顯，達到后續(xù)實驗要求。接下來一系列體外細胞功能實驗證實，過表達HCCC-9810-FoxM1細胞較Control組細胞在增殖及侵襲能力上明顯增強，而下調FoxM1表達的SSP-25-shFoxM1細胞較Control組細胞在增殖及侵襲能力上明顯降低。上述實驗結果表明FoxM1能夠體外促進ICC細胞生長增殖及轉移。

研究表明，下調FoxM1表達降低了MMP-9及MMP-2的表達和活性，從而抑制了腎透明細胞癌的遷移及侵襲［16］。本研究發(fā)現，FoxM1過表達增強ICC細胞侵襲能力，而MMP-9和MMP-2表達增加，表明MMP-9及MMP-2表達變化可能在FoxM1參與調控ICC侵襲過程中起到一定作用，但MMP-9和MMP-2表達是否為FoxM1直接調控或者是間接控制，目前尚不明確。

綜上，本研究初步闡明了FoxM1在ICC中上調可明顯增強ICC細胞增殖及侵襲能力，而下調FoxM1表達可顯著抑制其增殖及侵襲能力，FoxM1可能促進ICC中MMP-9及MMP-2表達，促進ICC增殖及侵襲，并可能通過MMP-9及MMP-2起作用，但相關具體機制尚需進一步研究。FoxM1有望成為ICC新的生物標志物及ICC治療的新靶點。本研究為揭示ICC發(fā)生發(fā)展的分子機制提供了一定的理論基礎，并為探索ICC有效的診治策略提供了新思路。