王慶慧， 蔡維震， 姚 蔓， 王 若， 傅安妮， 王靜鳳??

(1. 中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院， 山東 青島 266003； 2. 中國(guó)人民解放軍95958部隊(duì)， 上海 200120)

高尿酸血癥(Hyperuricemia, HUA)是因血清尿酸(Uric acid, UA)過(guò)度升高導(dǎo)致的系統(tǒng)性疾病[1]。流行病學(xué)研究表明，中國(guó)沿海地區(qū)HUA的發(fā)病率已高達(dá)20%[2]，其中60%的HUA患者會(huì)出現(xiàn)脂代謝紊亂[3-4]。高尿酸已被認(rèn)為是高脂血癥的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[5-6]?？笻UA藥物和降血脂藥物的組合雖能同時(shí)降低血清UA和脂質(zhì)水平，但仍存在肝損傷、腎纖維化、腎結(jié)石等不良反應(yīng)[7]，因此針對(duì)HUA和脂代謝異常的安全、有效的治療仍然是目前研究的重點(diǎn)。

南極磷蝦(Euphausiasuperba)是生活在南極海域的一種甲殼類浮游動(dòng)物，全球儲(chǔ)量上億噸，尚待大量開發(fā)、利用[8]。南極磷蝦富含蛋白質(zhì)，且生物價(jià)值優(yōu)于肉類和牛奶[9-10]。本課題組已初步證實(shí)，來(lái)源于南極磷蝦的活性肽(Peptides from Antarctic krill, AKP)具有降UA[11]和加速軟骨內(nèi)骨化過(guò)程、促進(jìn)骨折小鼠愈合[12]的功效。但作為HUA并發(fā)癥的脂代謝異常，AKP對(duì)其是否有作用尚不清楚。因此，本文以HUA小鼠為研究對(duì)象，探究AKP對(duì)其脂代謝改善效果和作用機(jī)制，以期為AKP的高值化利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、材料與試劑

8周齡健康(SPF級(jí))Balb/c小鼠，雄性，體質(zhì)量(22.0±2.0)g，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)公司，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(京)2014—0001。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)程序均符合中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院動(dòng)物倫理委員會(huì)的政策(批準(zhǔn)號(hào)：SPXY2015012)。

脫脂南極磷蝦粉購(gòu)于遼寧省大連海洋漁業(yè)集團(tuán)，用于制備AKP。

甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、腺苷脫氨酶(ADA)普通試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程研究所；尿酸(UA)、黃嘌呤氧化酶(XO)ELISA試劑盒購(gòu)于蘇州卡爾文生物科技有限公司；氧嗪酸鉀(PO)購(gòu)于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；酵母浸粉購(gòu)于北京普納德科技有限公司；目的基因引物由上海生工生物工程公司合成；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.2 儀器與設(shè)備

GL-20M高速冷凍離心機(jī)購(gòu)自上海盧湘儀離心機(jī)儀器公司，1100型液相色譜儀購(gòu)自美國(guó)Agilent公司，Model 680型酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司，Light Cycler 480型Real-time PCR購(gòu)自瑞士Roche公司，Tanon-520型全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)購(gòu)自上海天能科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 高嘌呤飼料的配制 以25%酵母浸粉和75%基礎(chǔ)飼料配制高嘌呤飼料。

1.3.2 南極磷蝦肽的制備 根據(jù)薛長(zhǎng)湖[13]的方法，將10 g脫脂南極磷蝦粉與水按1∶10(m/v)配成均勻溶液，將pH調(diào)至7.5，加入2%中性蛋白酶，50 ℃酶解6 h，沸水浴滅酶，在4 500 r/min(離心力2 248g)下離心20 min取上清。采用30 mL 0.3 mol/L鹽酸脫氟，靜置后在4 500 r/min(離心力2 248g)下離心20 min，取上清，噴霧干燥即得AKP。其中AKP分子量為400～2 000 Da，蛋白質(zhì)含量為85.4%，氟含量為1.66 mg/kg[12]。

1.3.3 動(dòng)物模型建立、分組及實(shí)驗(yàn) 40只雄性Balb/c小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，采用高嘌呤飲食聯(lián)合腹腔注射PO建立HUA小鼠模型[11]。除正常組(N組，n=8)飼喂普通飼料，腹腔注射生理鹽水，其余組飼喂高嘌呤飼料，隔天腹腔注射PO(200 mg·kg-1)，造模21 d后，隨機(jī)分為模型組(M組，0.85%生理鹽水)、陽(yáng)性藥組(P組，7.5 mg·kg-1非布司他)、AKP低、高劑量組(AKP-L和AKP-H，450和900 mg·kg-1)，n=8。持續(xù)造模并干預(yù)30 d后，單只收集尿液、糞便。于末次給藥后，禁食不禁水12 h，摘眼球取血，分離血清于-20 ℃保存。仔細(xì)剝離肝臟，每只各取0.1 g置于液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 血清UA和血清、肝臟、糞便中TG、TC測(cè)定 按試劑盒說(shuō)明測(cè)定血清UA和血清、肝臟、糞便中TG、TC含量。參照Folch[14]的方法，取0.1 g肝臟以1 mL氯仿-甲醇混合溶液(2∶1，v/v)提取肝臟脂質(zhì)。參照Evrard[15]的方法，取0.1 g糞便以4 mL 95%乙醇提取糞便脂質(zhì)。

1.3.5 肝臟組織XO及ADA活力測(cè)定 肝臟勻漿上清制備：取0.1 g肝臟，用冰冷生理鹽水制成10%勻漿，在8 500 r/min(離心力8 020g)、4 ℃下離心15 min取上清，分別按照ELISA試劑盒和普通試劑盒說(shuō)明檢測(cè)XO和ADA酶活。

1.3.6 qRT-PCR分析 采用Trizol法提取肝臟總RNA，將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板，進(jìn)行qPCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性4 min;94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸15 s，變性、退火、延伸共35個(gè)循環(huán);最后72 ℃再延伸10 min。以β-actin作為內(nèi)參基因，基因相對(duì)表達(dá)量以目的基因與內(nèi)參基因的表達(dá)量之比表示。所用目的基因引物序列如表1所示。

表1 目的基因的引物序列

1.3.7 Western Blot分析 采用RIPA裂解液提取肝臟組織總蛋白。肝臟蛋白經(jīng)10%SDS-PAGE電泳，電泳條件為：恒壓80 V，電泳3 h。隨后電轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，加入4 mL稀釋的一抗(1∶1 000)于4 ℃孵育過(guò)夜。TBST洗滌3次后，加入4 mL稀釋的二抗(1∶2 000)于室溫孵育2 h后，TBST洗滌3次，采用發(fā)光試劑盒發(fā)光，化學(xué)發(fā)光成像儀對(duì)底片曝光、顯影、定影拍照，使用Image J軟件進(jìn)行定量，以β-actin作為內(nèi)參蛋白，蛋白相對(duì)表達(dá)量以目的蛋白與內(nèi)參蛋白的表達(dá)量之比表示。

1.3.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，使用SPSS 22.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA)，以P<0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著差異。

2 結(jié)果

2.1 AKP降低HUA小鼠血清UA、肝臟XO和ADA表達(dá)

血清UA含量是臨床判斷HUA的決定性因素。如圖1a所示，與正常組相比，模型組血清UA升高46.60%(P<0.01)，而AKP低、高劑量組較模型組分別降低了血清UA水平17.45%、25.16%(P<0.01)，這表明AKP具有改善HUA的功效。

XO和ADA是黃嘌呤、次黃嘌呤及腺苷轉(zhuǎn)化為尿酸的限速酶。如圖1b所示，AKP低、高劑量組的XO和ADA酶活較模型組均顯著降低(P<0.01)，這表明AKP能抑制尿酸生成酶活性來(lái)減少UA的生成，從而降低血清UA水平。

(##：P<0.01，與正常組比較；**：P<0.01，與模型組比較。N為正常組，M為模型組，P為陽(yáng)性藥組，AKP-L為AKP低劑量組，AKP-H為AKP高劑量組，XO為黃嘌呤氧化酶，ADA為腺苷脫氨酶，n=8。##：P<0.01， versus normal group; **：P<0.01， versus model group. The N represents normal group, the M represents model group, the P represents positive group, the AKP-L represent AKP low group, AKP-H represent AKP high group, the XO represents xanthine oxidase, the ADA represents adenosine deaminase, n=8.)

2.2 AKP降低HUA小鼠脂質(zhì)水平

HUA對(duì)脂代謝的影響直觀的反映在血清、肝臟和糞便中。如圖2所示，與正常組相比，模型組血清TG、TC顯著降低(P<0.01)，肝臟TG、TC顯著升高(P<0.01)，糞便TG、TC顯著降低(P<0.01)。經(jīng)AKP干預(yù)后，HUA小鼠體內(nèi)TG、TC生成減少，排泄增加，脂質(zhì)水平顯著改善。以上結(jié)果表明，AKP可有效控制HUA小鼠體內(nèi)脂質(zhì)水平，調(diào)節(jié)因HUA導(dǎo)致的脂代謝紊亂。

(##：P<0.01，與正常組比較；*：P<0.05，**：P<0.01，與模型組比較。N為正常組，M為模型組，P為陽(yáng)性藥組，AKP-L為AKP低劑量組，AKP-H為AKP高劑量組，n=8。##：P<0.01 versus normal group; *：P<0.05, **：P<0.01 versus model group.The N represents normal group, the M represents model group, the P represents positive group, the AKP-L represent AKP low group, the AKP-H represent AKP high group, n=8.)

2.3 AKP降低NLRP3、caspase1蛋白表達(dá)

UA作為信號(hào)分子，能誘導(dǎo)NLRP3表達(dá)，引起下游炎癥反應(yīng)。由圖3可知，經(jīng)AKP干預(yù)后，NLRP3、caspase1表達(dá)較模型組均有所降低，分別下降了21.57%和24.44%(P<0.01)。上述結(jié)果表明，AKP能在翻譯水平上抑制HUA小鼠NLRP3及其下游效應(yīng)蛋白caspase1的表達(dá)。

(##:P<0.01，與正常組比較；**:P<0.01，與模型組比較。N為正常組，M為模型組，P為陽(yáng)性藥組，AKP-L為AKP低劑量組，AKP-H 為AKP高劑量組，NLRP3為炎癥小體(NOD)樣受體蛋白3，caspase1為半胱天冬酶-1，n=3。##:P<0.01 versus normal group; **:P<0.01 versus model group. The N represents normal group, the M represents model group, the P represents positive group, the AKP-L represent AKP low group, the AKP-H represent AKP high group, the NLRP3 represents NOD-like receptor protein 3, the caspase1 represents cysteinyl aspartate specific proteinase, n=3.)

2.4 AKP抑制HUA小鼠肝臟脂肪酸合成

SREBP-1c是脂肪酸合成的關(guān)鍵蛋白；ACC1催化丙二酰輔酶A的合成，充當(dāng)脂肪酸合成中的碳源；FAS催化CoA和丙二酰輔酶A合成棕櫚酸鹽，并調(diào)節(jié)脂肪酸鏈長(zhǎng)；SCD1是催化C16∶0和C18∶0分別轉(zhuǎn)化為C16∶1和C18∶1的關(guān)鍵限速酶。如圖4a所示，與正常組相比，模型組SREBP-1c蛋白表達(dá)提高了34.50%(P<0.01)，經(jīng)AKP干預(yù)后，AKP低、高劑量組均能顯著降低SREBP-1c蛋白表達(dá)(P<0.01)。如圖4b所示，與模型組相比，AKP劑量組的肝臟SREBP-1c基因表達(dá)量也顯著下降(P<0.01)。作為其靶基因的ACC、FAS和SCD1基因表達(dá)表現(xiàn)出了相同的變化趨勢(shì)，表明AKP可通過(guò)降低HUA小鼠肝臟SREBP-1c的基因和蛋白表達(dá)，從而降低脂肪酸合成相關(guān)基因的表達(dá)，抑制脂肪酸合成。

(##：P<0.01，與正常組比較；*：P<0.05，**：P<0.01，與模型組比較。N為正常組，M為模型組，P為陽(yáng)性藥組，AKP-L為AKP低劑量組，AKP-H為AKP高劑量組，SREBP-1c為固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1c，SREBP-1c為編碼SREBP-1c蛋白的基因，ACC為編碼乙酰輔酶A羧化酶的基因，F(xiàn)AS為編碼脂肪酸合成酶的基因，SCD1為編碼硬脂酰輔酶A去飽和酶1的基因，n=3。##：P<0.01 versus normal group; *：P<0.05, **：P<0.01 versus model group. The N represents normal group, the M represents model group, the P represents positive group, the AKP-L represent AKP low group, the AKP-H represent AKP high group, the SREBP-1c represents sterol-regulatory elementary binding protein-1c, SREBP-1c is the gene encoding SREBP-1c protein, ACC is the gene encoding acetyl-CoA carboxylase, FAS is the gene encoding fatty acid synthase, and SCD1 is the gene encoding stearoyl-CoA desaturase 1, n=3.)

2.5 AKP促進(jìn)HUA小鼠肝臟脂肪酸β氧化

PPARα是脂肪酸β氧化的首要轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子；CPT1是一種負(fù)責(zé)將長(zhǎng)鏈脂肪酰輔酶A轉(zhuǎn)移到線粒體的限速酶；而在線粒體基質(zhì)內(nèi)，CPT2能將?；鶑孽；≤辙D(zhuǎn)移回CoA，從而實(shí)現(xiàn)β-氧化；ACOX是啟動(dòng)長(zhǎng)鏈脂肪酸氧化過(guò)程的關(guān)鍵酶。如圖5a所示，模型組PPARα蛋白降低了25.39%(P<0.01)，表明HUA小鼠肝臟脂肪酸β氧化受到抑制。如圖5b所示，AKP劑量組較模型組均能顯著提高PPARα及其下游靶基因CPT-1、CPT-2和ACOX的 mRNA表達(dá)(P<0.01)，這表明AKP可在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上促進(jìn)HUA小鼠PPARα及其靶基因的表達(dá)，刺激肝臟脂肪酸β氧化，減少肝脂堆積。

(##:P<0.01，與正常組比較；*:P<0.05，**:P<0.01，與模型組比較。N為正常組，M為模型組，P為陽(yáng)性藥組，AKP-L為AKP低劑量組，AKP-H為AKP高劑量組，PPARα為過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體，PPARα為編碼PPARα蛋白的基因，CPT-1/2為編碼肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶1/2的基因，ACOX為編碼?；o酶A氧化酶的基因，n=3。##:P<0.01 versus normal group; *:P<0.05, **:P<0.01 versus model group. The N represents normal group, the M represents model group, the P represents positive group, the AKP-L represent AKP low group, the AKP-H represent AKP high group, the PPARα represents peroxisome proliferators-activated receptors α, PPARα is the gene encoding PPARα protein, CPT-1/2 is the gene encoding carnitine palmitoyl transferase-1/2, and ACOX is the gene encoding acyl-CoA oxidase， n=3.)

3 討論

本研究前期測(cè)定AKP、沙丁魚肽、金槍魚肽等海洋肽體外XO抑制活性，發(fā)現(xiàn)AKP效果最佳，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也表明AKP具有降UA的功效[11]。因此，本文進(jìn)一步探究AKP對(duì)HUA小鼠脂質(zhì)水平的作用，證實(shí)了其改善效果，且作用機(jī)制與抑制NLRP3炎癥小體表達(dá)有關(guān)。

活性肽能顯著促進(jìn)體內(nèi)脂質(zhì)排泄。Lee等[16]研究發(fā)現(xiàn)酪蛋白水解物能升高高脂血癥小鼠腸道ABCG5表達(dá)，促進(jìn)膽固醇分泌來(lái)降低血清膽固醇水平。親水性膽鹽在腸道維持膽固醇穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著重要作用，它能激活FXR表達(dá)，促進(jìn)腸腔內(nèi)膽固醇排泄[17]。上述研究與本文的研究結(jié)果一致，AKP作為一種高活性的海洋生物肽，能促進(jìn)TC、TG排泄，改善因HUA引起的脂代謝紊亂，其作用機(jī)制可能與腸道中ABCG5的表達(dá)、以及膽汁酸對(duì)FXR的調(diào)控作用有關(guān)。

大量研究表明HUA小鼠會(huì)出現(xiàn)肝脂沉積、血脂異常情況[18]。尿酸作為信號(hào)分子，能激活NLRP3炎癥體[19]，影響脂質(zhì)生成和代謝。Wan等[20]發(fā)現(xiàn)UA激活NLRP3后，導(dǎo)致IL-1β和IL-18的產(chǎn)生和分泌，促進(jìn)肝細(xì)胞脂質(zhì)堆積。不僅如此，有研究[21]表明抑制NLRP3和caspase1表達(dá)可恢復(fù)果糖誘導(dǎo)的肝細(xì)胞中SREBP-1c、PPARα、CPT-1等脂肪酸代謝關(guān)鍵因子的轉(zhuǎn)錄水平。脂質(zhì)合成關(guān)鍵蛋白SREBP-1c能調(diào)控下游基因參與到脂肪酸的合成中。而PPARα作為脂肪酸β氧化的首要轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，不僅可以調(diào)控下游CPT-1和CPT-2催化脂肪酸進(jìn)入線粒體中，還可調(diào)控ACOX促進(jìn)過(guò)氧化物酶體脂肪酸β氧化[22]。本文對(duì)AKP改善因HUA引起的脂代謝紊亂的作用機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，AKP能顯著抑制NLRP3和caspase1的表達(dá)，從而調(diào)控脂肪酸合成關(guān)鍵蛋白SREBP-1c和脂肪酸β氧化關(guān)鍵蛋白PPARα的表達(dá)，降低HUA小鼠的脂質(zhì)水平。

4 結(jié)語(yǔ)

本研究構(gòu)建了HUA動(dòng)物模型，探究AKP對(duì)HUA小鼠體內(nèi)脂代謝紊亂的作用及機(jī)制。結(jié)果表明，首先AKP能顯著降低HUA小鼠體內(nèi)尿酸含量和脂質(zhì)水平；其次AKP能通過(guò)下調(diào)UA-NLRP3炎癥小體通路，抑制脂肪酸合成，促進(jìn)脂肪酸β氧化，從而減少體內(nèi)TG、TC累積。本研究首次證實(shí)了AKP對(duì)HUA小鼠脂代謝的改善作用，同時(shí)從營(yíng)養(yǎng)干預(yù)的角度為改善HUA引起的脂代謝異常提供了一種天然、有效、價(jià)廉的新型治療方法。