王慶慧， 蔡維震， 姚 蔓， 王 若， 傅安妮， 王靜鳳??

(1. 中國海洋大學食品科學與工程學院， 山東 青島 266003； 2. 中國人民解放軍95958部隊， 上海 200120)

高尿酸血癥(Hyperuricemia, HUA)是因血清尿酸(Uric acid, UA)過度升高導致的系統(tǒng)性疾病[1]。流行病學研究表明，中國沿海地區(qū)HUA的發(fā)病率已高達20%[2]，其中60%的HUA患者會出現(xiàn)脂代謝紊亂[3-4]。高尿酸已被認為是高脂血癥的獨立危險因素[5-6]?？笻UA藥物和降血脂藥物的組合雖能同時降低血清UA和脂質水平，但仍存在肝損傷、腎纖維化、腎結石等不良反應[7]，因此針對HUA和脂代謝異常的安全、有效的治療仍然是目前研究的重點。

南極磷蝦(Euphausiasuperba)是生活在南極海域的一種甲殼類浮游動物，全球儲量上億噸，尚待大量開發(fā)、利用[8]。南極磷蝦富含蛋白質，且生物價值優(yōu)于肉類和牛奶[9-10]。本課題組已初步證實，來源于南極磷蝦的活性肽(Peptides from Antarctic krill, AKP)具有降UA[11]和加速軟骨內(nèi)骨化過程、促進骨折小鼠愈合[12]的功效。但作為HUA并發(fā)癥的脂代謝異常，AKP對其是否有作用尚不清楚。因此，本文以HUA小鼠為研究對象，探究AKP對其脂代謝改善效果和作用機制，以期為AKP的高值化利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

8周齡健康(SPF級)Balb/c小鼠，雄性，體質量(22.0±2.0)g，購于北京維通利華實驗動物技術公司，動物合格證號：SCXK(京)2014—0001。所有動物實驗程序均符合中國海洋大學食品科學與工程學院動物倫理委員會的政策(批準號：SPXY2015012)。

脫脂南極磷蝦粉購于遼寧省大連海洋漁業(yè)集團，用于制備AKP。

甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、腺苷脫氨酶(ADA)普通試劑盒購于南京建成生物工程研究所；尿酸(UA)、黃嘌呤氧化酶(XO)ELISA試劑盒購于蘇州卡爾文生物科技有限公司；氧嗪酸鉀(PO)購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；酵母浸粉購于北京普納德科技有限公司；目的基因引物由上海生工生物工程公司合成；其他試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 儀器與設備

GL-20M高速冷凍離心機購自上海盧湘儀離心機儀器公司，1100型液相色譜儀購自美國Agilent公司，Model 680型酶標儀購自美國Bio-Rad公司，Light Cycler 480型Real-time PCR購自瑞士Roche公司，Tanon-520型全自動化學發(fā)光成像分析系統(tǒng)購自上海天能科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 高嘌呤飼料的配制 以25%酵母浸粉和75%基礎飼料配制高嘌呤飼料。

1.3.2 南極磷蝦肽的制備 根據(jù)薛長湖[13]的方法，將10 g脫脂南極磷蝦粉與水按1∶10(m/v)配成均勻溶液，將pH調(diào)至7.5，加入2%中性蛋白酶，50 ℃酶解6 h，沸水浴滅酶，在4 500 r/min(離心力2 248g)下離心20 min取上清。采用30 mL 0.3 mol/L鹽酸脫氟，靜置后在4 500 r/min(離心力2 248g)下離心20 min，取上清，噴霧干燥即得AKP。其中AKP分子量為400～2 000 Da，蛋白質含量為85.4%，氟含量為1.66 mg/kg[12]。

1.3.3 動物模型建立、分組及實驗 40只雄性Balb/c小鼠適應性喂養(yǎng)3 d后，采用高嘌呤飲食聯(lián)合腹腔注射PO建立HUA小鼠模型[11]。除正常組(N組，n=8)飼喂普通飼料，腹腔注射生理鹽水，其余組飼喂高嘌呤飼料，隔天腹腔注射PO(200 mg·kg-1)，造模21 d后，隨機分為模型組(M組，0.85%生理鹽水)、陽性藥組(P組，7.5 mg·kg-1非布司他)、AKP低、高劑量組(AKP-L和AKP-H，450和900 mg·kg-1)，n=8。持續(xù)造模并干預30 d后，單只收集尿液、糞便。于末次給藥后，禁食不禁水12 h，摘眼球取血，分離血清于-20 ℃保存。仔細剝離肝臟，每只各取0.1 g置于液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 血清UA和血清、肝臟、糞便中TG、TC測定 按試劑盒說明測定血清UA和血清、肝臟、糞便中TG、TC含量。參照Folch[14]的方法，取0.1 g肝臟以1 mL氯仿-甲醇混合溶液(2∶1，v/v)提取肝臟脂質。參照Evrard[15]的方法，取0.1 g糞便以4 mL 95%乙醇提取糞便脂質。

1.3.5 肝臟組織XO及ADA活力測定 肝臟勻漿上清制備：取0.1 g肝臟，用冰冷生理鹽水制成10%勻漿，在8 500 r/min(離心力8 020g)、4 ℃下離心15 min取上清，分別按照ELISA試劑盒和普通試劑盒說明檢測XO和ADA酶活。

1.3.6 qRT-PCR分析 采用Trizol法提取肝臟總RNA，將RNA逆轉錄成cDNA，以cDNA為模板，進行qPCR擴增，反應條件為：95 ℃預變性4 min;94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸15 s，變性、退火、延伸共35個循環(huán);最后72 ℃再延伸10 min。以β-actin作為內(nèi)參基因，基因相對表達量以目的基因與內(nèi)參基因的表達量之比表示。所用目的基因引物序列如表1所示。

表1 目的基因的引物序列

1.3.7 Western Blot分析 采用RIPA裂解液提取肝臟組織總蛋白。肝臟蛋白經(jīng)10%SDS-PAGE電泳，電泳條件為：恒壓80 V，電泳3 h。隨后電轉至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，加入4 mL稀釋的一抗(1∶1 000)于4 ℃孵育過夜。TBST洗滌3次后，加入4 mL稀釋的二抗(1∶2 000)于室溫孵育2 h后，TBST洗滌3次，采用發(fā)光試劑盒發(fā)光，化學發(fā)光成像儀對底片曝光、顯影、定影拍照，使用Image J軟件進行定量，以β-actin作為內(nèi)參蛋白，蛋白相對表達量以目的蛋白與內(nèi)參蛋白的表達量之比表示。

1.3.8 統(tǒng)計學分析 實驗結果均以平均值±標準差表示，使用SPSS 22.0軟件進行單因素方差分析(One-way ANOVA)，以P<0.05為具有統(tǒng)計學上的顯著差異。

2 結果

2.1 AKP降低HUA小鼠血清UA、肝臟XO和ADA表達

血清UA含量是臨床判斷HUA的決定性因素。如圖1a所示，與正常組相比，模型組血清UA升高46.60%(P<0.01)，而AKP低、高劑量組較模型組分別降低了血清UA水平17.45%、25.16%(P<0.01)，這表明AKP具有改善HUA的功效。

XO和ADA是黃嘌呤、次黃嘌呤及腺苷轉化為尿酸的限速酶。如圖1b所示，AKP低、高劑量組的XO和ADA酶活較模型組均顯著降低(P<0.01)，這表明AKP能抑制尿酸生成酶活性來減少UA的生成，從而降低血清UA水平。

(##：P<0.01，與正常組比較；**：P<0.01，與模型組比較。N為正常組，M為模型組，P為陽性藥組，AKP-L為AKP低劑量組，AKP-H為AKP高劑量組，XO為黃嘌呤氧化酶，ADA為腺苷脫氨酶，n=8。##：P<0.01， versus normal group; **：P<0.01， versus model group. The N represents normal group, the M represents model group, the P represents positive group, the AKP-L represent AKP low group, AKP-H represent AKP high group, the XO represents xanthine oxidase, the ADA represents adenosine deaminase, n=8.)

2.2 AKP降低HUA小鼠脂質水平

HUA對脂代謝的影響直觀的反映在血清、肝臟和糞便中。如圖2所示，與正常組相比，模型組血清TG、TC顯著降低(P<0.01)，肝臟TG、TC顯著升高(P<0.01)，糞便TG、TC顯著降低(P<0.01)。經(jīng)AKP干預后，HUA小鼠體內(nèi)TG、TC生成減少，排泄增加，脂質水平顯著改善。以上結果表明，AKP可有效控制HUA小鼠體內(nèi)脂質水平，調(diào)節(jié)因HUA導致的脂代謝紊亂。

(##：P<0.01，與正常組比較；*：P<0.05，**：P<0.01，與模型組比較。N為正常組，M為模型組，P為陽性藥組，AKP-L為AKP低劑量組，AKP-H為AKP高劑量組，n=8。##：P<0.01 versus normal group; *：P<0.05, **：P<0.01 versus model group.The N represents normal group, the M represents model group, the P represents positive group, the AKP-L represent AKP low group, the AKP-H represent AKP high group, n=8.)

2.3 AKP降低NLRP3、caspase1蛋白表達

UA作為信號分子，能誘導NLRP3表達，引起下游炎癥反應。由圖3可知，經(jīng)AKP干預后，NLRP3、caspase1表達較模型組均有所降低，分別下降了21.57%和24.44%(P<0.01)。上述結果表明，AKP能在翻譯水平上抑制HUA小鼠NLRP3及其下游效應蛋白caspase1的表達。

(##:P<0.01，與正常組比較；**:P<0.01，與模型組比較。N為正常組，M為模型組，P為陽性藥組，AKP-L為AKP低劑量組，AKP-H 為AKP高劑量組，NLRP3為炎癥小體(NOD)樣受體蛋白3，caspase1為半胱天冬酶-1，n=3。##:P<0.01 versus normal group; **:P<0.01 versus model group. The N represents normal group, the M represents model group, the P represents positive group, the AKP-L represent AKP low group, the AKP-H represent AKP high group, the NLRP3 represents NOD-like receptor protein 3, the caspase1 represents cysteinyl aspartate specific proteinase, n=3.)

2.4 AKP抑制HUA小鼠肝臟脂肪酸合成

SREBP-1c是脂肪酸合成的關鍵蛋白；ACC1催化丙二酰輔酶A的合成，充當脂肪酸合成中的碳源；FAS催化CoA和丙二酰輔酶A合成棕櫚酸鹽，并調(diào)節(jié)脂肪酸鏈長；SCD1是催化C16∶0和C18∶0分別轉化為C16∶1和C18∶1的關鍵限速酶。如圖4a所示，與正常組相比，模型組SREBP-1c蛋白表達提高了34.50%(P<0.01)，經(jīng)AKP干預后，AKP低、高劑量組均能顯著降低SREBP-1c蛋白表達(P<0.01)。如圖4b所示，與模型組相比，AKP劑量組的肝臟SREBP-1c基因表達量也顯著下降(P<0.01)。作為其靶基因的ACC、FAS和SCD1基因表達表現(xiàn)出了相同的變化趨勢，表明AKP可通過降低HUA小鼠肝臟SREBP-1c的基因和蛋白表達，從而降低脂肪酸合成相關基因的表達，抑制脂肪酸合成。

(##：P<0.01，與正常組比較；*：P<0.05，**：P<0.01，與模型組比較。N為正常組，M為模型組，P為陽性藥組，AKP-L為AKP低劑量組，AKP-H為AKP高劑量組，SREBP-1c為固醇調(diào)節(jié)元件結合蛋白-1c，SREBP-1c為編碼SREBP-1c蛋白的基因，ACC為編碼乙酰輔酶A羧化酶的基因，F(xiàn)AS為編碼脂肪酸合成酶的基因，SCD1為編碼硬脂酰輔酶A去飽和酶1的基因，n=3。##：P<0.01 versus normal group; *：P<0.05, **：P<0.01 versus model group. The N represents normal group, the M represents model group, the P represents positive group, the AKP-L represent AKP low group, the AKP-H represent AKP high group, the SREBP-1c represents sterol-regulatory elementary binding protein-1c, SREBP-1c is the gene encoding SREBP-1c protein, ACC is the gene encoding acetyl-CoA carboxylase, FAS is the gene encoding fatty acid synthase, and SCD1 is the gene encoding stearoyl-CoA desaturase 1, n=3.)

2.5 AKP促進HUA小鼠肝臟脂肪酸β氧化

PPARα是脂肪酸β氧化的首要轉錄調(diào)節(jié)因子；CPT1是一種負責將長鏈脂肪酰輔酶A轉移到線粒體的限速酶；而在線粒體基質內(nèi)，CPT2能將?；鶑孽；≤辙D移回CoA，從而實現(xiàn)β-氧化；ACOX是啟動長鏈脂肪酸氧化過程的關鍵酶。如圖5a所示，模型組PPARα蛋白降低了25.39%(P<0.01)，表明HUA小鼠肝臟脂肪酸β氧化受到抑制。如圖5b所示，AKP劑量組較模型組均能顯著提高PPARα及其下游靶基因CPT-1、CPT-2和ACOX的 mRNA表達(P<0.01)，這表明AKP可在轉錄和翻譯水平上促進HUA小鼠PPARα及其靶基因的表達，刺激肝臟脂肪酸β氧化，減少肝脂堆積。

(##:P<0.01，與正常組比較；*:P<0.05，**:P<0.01，與模型組比較。N為正常組，M為模型組，P為陽性藥組，AKP-L為AKP低劑量組，AKP-H為AKP高劑量組，PPARα為過氧化物酶體增殖物激活受體，PPARα為編碼PPARα蛋白的基因，CPT-1/2為編碼肉堿棕櫚酰轉移酶1/2的基因，ACOX為編碼?；o酶A氧化酶的基因，n=3。##:P<0.01 versus normal group; *:P<0.05, **:P<0.01 versus model group. The N represents normal group, the M represents model group, the P represents positive group, the AKP-L represent AKP low group, the AKP-H represent AKP high group, the PPARα represents peroxisome proliferators-activated receptors α, PPARα is the gene encoding PPARα protein, CPT-1/2 is the gene encoding carnitine palmitoyl transferase-1/2, and ACOX is the gene encoding acyl-CoA oxidase， n=3.)

3 討論

本研究前期測定AKP、沙丁魚肽、金槍魚肽等海洋肽體外XO抑制活性，發(fā)現(xiàn)AKP效果最佳，動物實驗也表明AKP具有降UA的功效[11]。因此，本文進一步探究AKP對HUA小鼠脂質水平的作用，證實了其改善效果，且作用機制與抑制NLRP3炎癥小體表達有關。

活性肽能顯著促進體內(nèi)脂質排泄。Lee等[16]研究發(fā)現(xiàn)酪蛋白水解物能升高高脂血癥小鼠腸道ABCG5表達，促進膽固醇分泌來降低血清膽固醇水平。親水性膽鹽在腸道維持膽固醇穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著重要作用，它能激活FXR表達，促進腸腔內(nèi)膽固醇排泄[17]。上述研究與本文的研究結果一致，AKP作為一種高活性的海洋生物肽，能促進TC、TG排泄，改善因HUA引起的脂代謝紊亂，其作用機制可能與腸道中ABCG5的表達、以及膽汁酸對FXR的調(diào)控作用有關。

大量研究表明HUA小鼠會出現(xiàn)肝脂沉積、血脂異常情況[18]。尿酸作為信號分子，能激活NLRP3炎癥體[19]，影響脂質生成和代謝。Wan等[20]發(fā)現(xiàn)UA激活NLRP3后，導致IL-1β和IL-18的產(chǎn)生和分泌，促進肝細胞脂質堆積。不僅如此，有研究[21]表明抑制NLRP3和caspase1表達可恢復果糖誘導的肝細胞中SREBP-1c、PPARα、CPT-1等脂肪酸代謝關鍵因子的轉錄水平。脂質合成關鍵蛋白SREBP-1c能調(diào)控下游基因參與到脂肪酸的合成中。而PPARα作為脂肪酸β氧化的首要轉錄調(diào)節(jié)因子，不僅可以調(diào)控下游CPT-1和CPT-2催化脂肪酸進入線粒體中，還可調(diào)控ACOX促進過氧化物酶體脂肪酸β氧化[22]。本文對AKP改善因HUA引起的脂代謝紊亂的作用機制研究發(fā)現(xiàn)，AKP能顯著抑制NLRP3和caspase1的表達，從而調(diào)控脂肪酸合成關鍵蛋白SREBP-1c和脂肪酸β氧化關鍵蛋白PPARα的表達，降低HUA小鼠的脂質水平。

4 結語

本研究構建了HUA動物模型，探究AKP對HUA小鼠體內(nèi)脂代謝紊亂的作用及機制。結果表明，首先AKP能顯著降低HUA小鼠體內(nèi)尿酸含量和脂質水平；其次AKP能通過下調(diào)UA-NLRP3炎癥小體通路，抑制脂肪酸合成，促進脂肪酸β氧化，從而減少體內(nèi)TG、TC累積。本研究首次證實了AKP對HUA小鼠脂代謝的改善作用，同時從營養(yǎng)干預的角度為改善HUA引起的脂代謝異常提供了一種天然、有效、價廉的新型治療方法。