代金彩 聶竹蘭 趙年樺 任永麗 魏 杰

塔里木裂腹魚(yú)尾鰭細(xì)胞系的建立及鹽堿度對(duì)其增殖的影響*

代金彩 聶竹蘭①趙年樺 任永麗 魏 杰

(塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院 新疆建設(shè)兵團(tuán)塔里木畜牧科技重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 塔里木珍稀魚(yú)類研究中心 新疆 阿拉爾 843300)

為了建立塔里木裂腹魚(yú)()尾鰭細(xì)胞系，本研究采用組織塊法，分別用含胎牛血清(FBS)的DME/F12培養(yǎng)基體外培養(yǎng)塔里木裂腹魚(yú)尾鰭組織，初步建立了塔里木裂腹魚(yú)尾鰭細(xì)胞系(BICF1)。采用MTT法測(cè)定分析鹽度(NaCl)和堿度(NaHCO3)對(duì)其增殖的影響。結(jié)果顯示，BICF1懸浮培養(yǎng)傳至45代，最適培養(yǎng)液為DME/F12，最適FBS濃度為20%，最適溫度為25℃。第10代BICF1的群體倍增時(shí)間為28.11 h，呈“S”型生長(zhǎng)。第6代BICF1液氮凍存180 d后復(fù)蘇，經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)，BICF1有(87.85±0.66)%的細(xì)胞具有活性，復(fù)蘇后可增殖并傳代。BICF1無(wú)細(xì)菌、真菌、支原體污染。第10代BICF1線粒體16S rRNA測(cè)序結(jié)果與GenBank基因序列進(jìn)行一致性對(duì)比，結(jié)果顯示，BICF1與JQ844133.1的一致率為100%，表明BICF1來(lái)自于塔里木裂腹魚(yú)。BICF1增殖數(shù)量在鹽度為1、2、4、6時(shí)呈上升趨勢(shì)，在鹽度為6、8、10時(shí)呈下降趨勢(shì)；鹽度為6時(shí)，BICF1增殖數(shù)量最高。BICF1增殖數(shù)量在堿度為2、3、4、5、6 g/L時(shí)呈上升趨勢(shì)，在堿度為6、7、8、10 g/L時(shí)呈下降趨勢(shì)；堿度為6 g/L時(shí)，BICF1增殖數(shù)量最高。細(xì)胞增殖數(shù)量隨鹽堿度增加呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)。本研究旨在為合理開(kāi)發(fā)和利用塔里木裂腹魚(yú)遺傳資源以及建立和保護(hù)其種質(zhì)資源提供一定的科學(xué)依據(jù)。

塔里木裂腹魚(yú)；尾鰭組織；細(xì)胞培養(yǎng)

國(guó)家二級(jí)保護(hù)動(dòng)物塔里木裂腹魚(yú)()屬鯉形目(Cypriniformes)、鯉科(Cyprinidae)、裂腹魚(yú)亞科(Schizothpracinae)、裂腹魚(yú)屬()，俗稱“尖嘴魚(yú)”，是我國(guó)的特有物種(王德忠, 1998)。有關(guān)塔里木裂腹魚(yú)的報(bào)道主要集中在其地理分布(張人銘等, 2007)、形態(tài)特征(楊天燕等, 2018)、繁殖特性(魏杰等, 2011)、線粒體基因組DNA結(jié)構(gòu)分析(楊天燕等, 2011)、遺傳標(biāo)記開(kāi)發(fā)(Luo, 2012)及遺傳多樣性(海薩等, 2016)等方面。

鹽堿度水平是影響硬骨魚(yú)類生存、繁殖、發(fā)育、生長(zhǎng)和生理功能的最重要環(huán)境因素之一，會(huì)由于自然因素或人為因素而發(fā)生變化，從而對(duì)養(yǎng)殖魚(yú)類造成滲透調(diào)節(jié)脅迫，影響其正常生長(zhǎng)(Resley, 2006)。水體中鹽堿度水平對(duì)魚(yú)類的存活有顯著影響，鹽堿度過(guò)高或過(guò)低都會(huì)使魚(yú)類的存活率顯著的降低(Yao, 2010)。魚(yú)類細(xì)胞系是進(jìn)行病毒學(xué)、環(huán)境毒理學(xué)、分子遺傳學(xué)、基因功能分析、細(xì)胞遺傳學(xué)與種質(zhì)保存等研究的材料和模型(周廣舟等, 2011)。草魚(yú)鰭細(xì)胞系可用于研究草魚(yú)源維氏氣單胞菌()對(duì)宿主細(xì)胞的毒性及致死機(jī)制(劉明珠等, 2019)；異育銀鯽()尾鰭細(xì)胞(GiCF)可用于辛硫磷對(duì)GiCF毒性研究 (趙燕楠等, 2020)；泥鰍()鰭細(xì)胞系用于研究銅、鋅對(duì)泥鰍鰭細(xì)胞DNA損傷及金屬硫蛋白表達(dá)的影響(姜姍等, 2020)。

本研究建立了塔里木裂腹魚(yú)尾鰭組織細(xì)胞系，測(cè)定了鹽度(NaCl)和堿度(NaHCO3)對(duì)其增殖的影響。本研究旨在為合理開(kāi)發(fā)和利用塔里木裂腹魚(yú)遺傳資源以及建立和保護(hù)其種質(zhì)資源提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)用塔里木裂腹魚(yú)于2019年9月取自新疆克孜勒河，飼養(yǎng)在新疆建設(shè)兵團(tuán)塔里木畜牧科技重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。取其中1條健康雌塔里木裂腹魚(yú)，體重為21.37g，全長(zhǎng)為15.46 cm。

DME/F12、L-15、MEM、RPMI-1640、M199培養(yǎng)基購(gòu)自Hyclone公司；胎牛血清(FBS)購(gòu)自Gibco公司；磷酸緩沖液(PBS)、青霉素–鏈霉素雙抗、二甲基亞砜(DMSO)購(gòu)自Solarbio公司；臺(tái)盼藍(lán)和0.25%胰酶購(gòu)自Biotopped公司；MS-222購(gòu)自漁夫?qū)毠荆换蚪MDNA提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技有限公司；其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 原代培養(yǎng)與傳代培養(yǎng) 取健康塔里木裂腹魚(yú)，加入0.1 μL/g的MS-222麻醉劑麻醉后，剪取上尾鰭。用75%的酒精對(duì)尾鰭進(jìn)行消毒，置于超凈臺(tái)中。取4個(gè)培養(yǎng)皿，其中，1個(gè)加入75%的酒精，3個(gè)加入添加含500 IU/mL青霉素、500 μg/mL鏈霉素、12.5μg/mL兩性霉素B的PBS。尾鰭放入酒精中30 s，然后依次在另外3個(gè)培養(yǎng)皿中浸泡，之后將其放入2 mL無(wú)菌離心管中，并用無(wú)菌眼科剪將其剪成大約1～2 mm3的組織碎塊，向其中加入500 μL的DME/F12培養(yǎng)液，將組織碎塊移到25 mm2培養(yǎng)瓶中，正相放入25℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中，觀察細(xì)胞貼壁情況。4 h后反相放置，培養(yǎng)2 h后，向其中加入1 mL DME/F12培養(yǎng)液(含20% FBS、500 IU/mL青霉素、500 μg/mL鏈霉素、12.5 μg/mL兩性霉素B)，正相放入25℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，12 h后加入9 mL培養(yǎng)液，繼續(xù)正相放置培養(yǎng)。每天用倒置熒光顯微鏡(AMG EVOS F1)觀察組織塊遷移情況。

原代培養(yǎng)過(guò)程中，更換培養(yǎng)液的時(shí)間為2～4 d。當(dāng)組織碎塊周圍遷出細(xì)胞，細(xì)胞濃度達(dá)106cells/mL時(shí)，按1∶2的比例進(jìn)行傳代。直到第5代后，青霉素、鏈霉素的濃度降低到200 IU/mL和200 μg/mL，F(xiàn)BS濃度也降低到15%。到第8代后，使用含10% FBS和1% P/S的DME/F12培養(yǎng)液。

1.2.2 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線 將一定濃度的細(xì)胞接種到24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，分成8組，每組6孔，連續(xù)7 d常規(guī)培養(yǎng)，用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)，每天記1組，分析數(shù)據(jù)并繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的縱坐標(biāo)為每天計(jì)數(shù)的細(xì)胞平均個(gè)數(shù)，時(shí)間為橫坐標(biāo)。根據(jù)下面公式計(jì)算細(xì)胞的群體倍增時(shí)間：

=×lg/lg(N/0)

式中，N為時(shí)間后的細(xì)胞數(shù)，0接種細(xì)胞數(shù)(Nicholas, 1991)。

1.2.3 最佳培養(yǎng)基 檢測(cè)DME/F12、M199、L-15、MEM、RPMI-1640共5種不同培養(yǎng)基維持細(xì)胞生長(zhǎng)的能力。每種培養(yǎng)基中均補(bǔ)充10% FBS和1% P/S。分別將一定濃度的細(xì)胞接種在不同的培養(yǎng)基中，在25℃、5%的CO2條件下培養(yǎng)96 h，在5個(gè)時(shí)間點(diǎn)，即0、24、48、72及96 h利用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，繪制細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線。

1.2.4 最適培養(yǎng)溫度 檢測(cè)20℃、25℃、30℃和37℃不同溫度對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。所用培養(yǎng)液為含10% FBS和1% P/S的DME/F12培養(yǎng)液。在25℃、5%的CO2條件下培養(yǎng)96 h，在5個(gè)時(shí)間點(diǎn)即0、24、48、72及96 h利用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，繪制細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線。

1.2.5 最適血清濃度 確定最適合的培養(yǎng)液及溫度后，其他條件一致，設(shè)置不同F(xiàn)BS濃度(0、5%、10%和20%)，在25℃、5%的CO2條件下培養(yǎng)，在5個(gè)時(shí)間點(diǎn)，即0、24、48、72及96 h利用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.2.6 細(xì)胞凍存與復(fù)蘇 配制10% DMSO、20% FBS、70% DME/F-12的細(xì)胞凍存液，細(xì)胞濃度為2×106cells/mL，倒入冷凍管，液氮凍存。按細(xì)胞∶培養(yǎng)液=1∶5比例加入培養(yǎng)液使細(xì)胞懸浮，復(fù)蘇培養(yǎng)。

1.2.7 細(xì)胞污染鑒定 選用觀察法與PCR法檢測(cè)細(xì)胞是否被細(xì)菌、真菌、支原體污染。所用引物見(jiàn)表1。

1.2.8 細(xì)胞來(lái)源鑒定 利用動(dòng)物組織基因組DNA提取試劑盒(DP304)提取塔里木裂腹魚(yú)尾鰭細(xì)胞的基因組DNA。通過(guò)PCR擴(kuò)增提取DNA。根據(jù)塔里木裂腹魚(yú)16S rRNA設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增引物為16SF和16SR (表1)。配制50 μL反應(yīng)體系：25 μL 2×PCR MasterMix，引物各2.5 μL，5 μL模板DNA，15 μL的滅菌超純水。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，56.8℃退火30 s，72℃延伸40 s，循環(huán)35次；72℃延伸10 min。擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，取1 μL PCR產(chǎn)物在核酸蛋白檢測(cè)儀上檢測(cè)DNA的濃度；取8 μL PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳檢測(cè)。PCR產(chǎn)物測(cè)序，比較獲得序列與已發(fā)表序列的一致率。

1.2.9 鹽堿度對(duì)塔里木裂腹魚(yú)細(xì)胞系增殖數(shù)量的影響 NaCl鹽度設(shè)置1、2、4、6、8、10共6個(gè)梯度。稱取NaCl加入DME/F12培養(yǎng)液溶解，溶解后再用0.22 μm過(guò)濾篩過(guò)濾。

NaHCO3堿度設(shè)置2、3、4、5、6、7、8、10 g/L共8個(gè)梯度。稱取NaHCO3加入DME/F12培養(yǎng)液溶解，溶解后再用0.22 μm過(guò)濾篩過(guò)濾。

細(xì)胞鋪板：將第10代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期BICF1用含10%胎牛血清DME/F12培養(yǎng)液調(diào)整密度為1×104cells/mL的細(xì)胞懸液，鋪置于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，每種材料鋪6孔。每孔加入100 μL細(xì)胞懸液，25℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h后，按分組分別加入不同濃度鹽和堿，各孔20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h。之后將每個(gè)液體孔加入20 μL MTT后繼續(xù)培養(yǎng)4 h，小心吸出各孔內(nèi)液體，然后，每孔加入150 μL DMSO。搖床培養(yǎng)20 min，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀490 nm波長(zhǎng)下測(cè)定各孔的OD值。通過(guò)計(jì)算，得出細(xì)胞相對(duì)增殖率：

表1 通用引物序列

Tab.1 Universal primer sequence

相對(duì)增殖率=OD實(shí)驗(yàn)組/OD空白對(duì)照組×100%。

使用SPSS 20軟件包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示，<0.05為差異具有顯著性。多組間比較用方差分析，兩組間比較采用檢驗(yàn)。=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 塔里木裂腹魚(yú)尾鰭細(xì)胞原代培養(yǎng)與傳代培養(yǎng)

觀察塔里木裂腹魚(yú)尾鰭細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)。3 d后，細(xì)胞貼壁且組織塊周圍逐漸有細(xì)胞遷出；7 d后，細(xì)胞正常遷出；13 d后，細(xì)胞鋪滿細(xì)胞瓶70%；18 d后，細(xì)胞出現(xiàn)懸浮現(xiàn)象(圖1)；19 d后，進(jìn)行原瓶傳代。細(xì)胞濃度到106cells/mL時(shí)，進(jìn)行1∶2傳代，此后每隔2～4 d傳代1次。細(xì)胞懸浮生長(zhǎng)，成功傳至45代。

2.2 塔里木裂腹魚(yú)尾鰭細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

塔里木裂腹魚(yú)尾鰭細(xì)胞系第10代細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線呈“S”型，0～1 d為潛伏期，1～4 d為指數(shù)生長(zhǎng)期，4～5 d為平臺(tái)期，5 d之后為衰退期(圖2)。第10代塔里木裂腹魚(yú)尾鰭細(xì)胞的群體倍增時(shí)間為28.11 h，細(xì)胞分裂旺盛。

圖1 塔里木裂腹魚(yú)尾鰭細(xì)胞原代培養(yǎng)的不同階段

2.3 塔里木裂腹魚(yú)尾鰭細(xì)胞最佳培養(yǎng)基

塔里木裂腹魚(yú)尾鰭細(xì)胞在DME/F12、M199、L-15、MEM、RPMI-1640不同培養(yǎng)基中維持細(xì)胞生長(zhǎng)的能力如圖3所示，在這些培養(yǎng)基中均能生長(zhǎng)，但在DME/F12培養(yǎng)基中細(xì)胞生長(zhǎng)最好。因此，DME/F12為最佳培養(yǎng)基(<0.05)。

2.4 塔里木裂腹魚(yú)尾鰭細(xì)胞最適培養(yǎng)溫度

塔里木裂腹魚(yú)尾鰭細(xì)胞在30℃生長(zhǎng)最慢，25℃生長(zhǎng)最快，20℃生長(zhǎng)較快，在20℃～25℃范圍內(nèi)，皆能良性生長(zhǎng)(圖4)，生長(zhǎng)的最適溫度為25℃(<0.05)。

2.5 塔里木裂腹魚(yú)尾鰭細(xì)胞最適血清濃度

塔里木裂腹魚(yú)尾鰭細(xì)胞在未加血清的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)明顯低于添加血清的細(xì)胞生長(zhǎng)，隨著血清濃度5%、10%、20%依次增大，細(xì)胞生長(zhǎng)依次加快，當(dāng)FBS濃度為20%時(shí)，塔里木裂腹魚(yú)尾鰭細(xì)胞生長(zhǎng)明顯最快(<0.05)(圖5)。

2.6 塔里木裂腹魚(yú)尾鰭細(xì)胞凍存與復(fù)蘇

對(duì)塔里木裂腹魚(yú)第6代尾鰭細(xì)胞系進(jìn)行液氮冷凍，保存40、90及180 d后復(fù)蘇，經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)染色并計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)，40 d存活率為(91.49±0.69)%，90 d存活率為(88.41±0.80)%，180 d存活率為(87.85±0.66)%，90和180 d存活率差異不顯著(>0.05)(表2)。細(xì)胞具有活性，且復(fù)蘇后增殖速度快(圖6)，可正常傳代(圖7)。

圖2 塔里木裂腹魚(yú)尾鰭細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

標(biāo)有不同字母者表示組間差異顯著(<0.05)。下同。

Means with different letters are significantly different (<0.05). The same as below.

圖3 塔里木裂腹魚(yú)尾鰭細(xì)胞最佳培養(yǎng)基

小寫字母表示同一時(shí)間下BICF1多重比較。下同。

Indicated with lowercase letters for BICF1 multiple comparisons at the same time. The same as below.

圖4 塔里木裂腹魚(yú)尾鰭細(xì)胞最適培養(yǎng)溫度

圖5 塔里木裂腹魚(yú)尾鰭細(xì)胞最適血清濃度

表2 凍存后復(fù)蘇存活率

Tab.2 Survival rate of recovery after freezing

圖6 MTT法測(cè)定復(fù)蘇細(xì)胞增殖

2.7 塔里木裂腹魚(yú)尾鰭細(xì)胞污染與檢測(cè)鑒定

塔里木裂腹魚(yú)尾鰭細(xì)胞中提取細(xì)菌、真菌和支原體，經(jīng)過(guò)PCR法鑒定細(xì)菌、真菌、支原體污染，樣品均無(wú)與陽(yáng)性對(duì)照組一致的條帶，樣品中無(wú)細(xì)菌、真菌、支原體，塔里木裂腹魚(yú)尾鰭細(xì)胞未被污染。

2.8 塔里木裂腹魚(yú)尾鰭細(xì)胞來(lái)源鑒定

用基因組DNA試劑盒提取塔里木裂腹魚(yú)尾鰭細(xì)胞DNA，經(jīng)PCR擴(kuò)增，在瓊脂糖凝膠中電泳檢測(cè)，PCR產(chǎn)物目的條帶大小符合16S rRNA的大小。經(jīng)測(cè)序后的序列片段與數(shù)據(jù)庫(kù)中的GenBank進(jìn)行Blast比對(duì)。塔里木裂腹魚(yú)尾鰭細(xì)胞同源性與GenBank中發(fā)布的來(lái)源于塔里木裂腹魚(yú)線粒體基因(JQ844133.1)的序列達(dá)到100%；證明尾鰭細(xì)胞來(lái)自于塔里木裂腹魚(yú)。

圖7 塔里木裂腹魚(yú)尾鰭細(xì)胞復(fù)蘇培養(yǎng)

2.9 MTT法檢測(cè)各組鹽堿度的細(xì)胞增殖數(shù)量

2.9.1 鹽度對(duì)塔里木裂腹魚(yú)尾鰭細(xì)胞增殖數(shù)量的影響 在鹽度一定的情況下，BICF1的增殖數(shù)量隨時(shí)間延長(zhǎng)而下降，鹽度對(duì)BICF1的相對(duì)增殖數(shù)量的抑制可隨時(shí)間延長(zhǎng)而增強(qiáng)。BICF1增殖數(shù)量在鹽度為1、2、4、6時(shí)呈上升趨勢(shì)，在鹽度為6、8、10呈下降趨勢(shì)，鹽度為6時(shí)，BICF1增殖數(shù)量最高。BICF1增殖數(shù)量隨鹽度增加呈先升高后下降的趨勢(shì)(表3和圖8)。

2.9.2 堿度對(duì)塔里木裂腹魚(yú)尾鰭細(xì)胞增殖數(shù)量的影響 在堿度一定時(shí)，BICF1的增殖數(shù)量隨時(shí)間(24、48、72 h)延長(zhǎng)而下降，堿度對(duì)BICF1的相對(duì)增殖數(shù)量的抑制隨時(shí)間延長(zhǎng)而增強(qiáng)。在同一時(shí)間點(diǎn)上，BICF1增殖數(shù)量在堿度2、3、4、5、6 g/L時(shí)呈上升趨勢(shì)，在堿度為6、7、8、10 g/L時(shí)呈下降趨勢(shì)，堿度為6 g/L時(shí)，BICF1增殖數(shù)量最高。BICF1增殖數(shù)量隨NaHCO3堿度增加呈先升高后下降的趨勢(shì)(表4和圖8)。

3 討論

本研究以塔里木裂腹魚(yú)尾鰭組織為材料，采用組織塊移植法成功進(jìn)行了塔里木裂腹魚(yú)尾鰭組織細(xì)胞原代培養(yǎng)，命名為BICFI。BICFI在10% FBS的DME/F12培養(yǎng)液中生長(zhǎng)良好。細(xì)胞培養(yǎng)常用的培養(yǎng)液有L-15、MEM和M199，但不同的魚(yú)類對(duì)環(huán)境要求不盡相同，因此，不同魚(yú)類的最適培養(yǎng)基亦不同。青魚(yú)()尾鰭細(xì)胞系(BC-Fin)的最佳培養(yǎng)液為L(zhǎng)-15(張雪萍等, 2016)；麥穗魚(yú)()鰭細(xì)胞系的最佳培養(yǎng)液為MEM(楊坤等, 2013)；匙吻鱘()鰭細(xì)胞系(PF-Fin)的最佳培養(yǎng)液為M199(肖藝等, 2010)；紅鰭東方鲀()鰭細(xì)胞系的最佳培養(yǎng)液為DMEM/F12(王縉云等, 2018)，本研究中篩選了DME/F12、L-15、MEM、RPMI-1640和M199培養(yǎng)基，得出DME/F12為最佳培養(yǎng)液。魚(yú)類組織細(xì)胞生長(zhǎng)溫度范圍和哺乳類組織細(xì)胞比較，范圍比較廣。BICFI在20℃～25℃均能正常生長(zhǎng)。研究表明，牙鲆()與鱸()鰭細(xì)胞系為廣溫性(童裳亮等, 1997)，本研究與已報(bào)道的魚(yú)類細(xì)胞的溫度適應(yīng)范圍是一致的(Wang, 2010)，這與魚(yú)類是變溫動(dòng)物有很大關(guān)系。在0、5%、10%、20%的FBS中生長(zhǎng)時(shí)，未加FBS的生長(zhǎng)速度明顯低于添加FBS的生長(zhǎng)速度，在FBS為20%時(shí)生長(zhǎng)最快，F(xiàn)BS濃度對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有明顯的影響，與已報(bào)道的研究相似(王縉云等, 2018)。本研究測(cè)定的第10代BICF1生長(zhǎng)曲線呈“S”型生長(zhǎng)曲線，1 d為指數(shù)生長(zhǎng)期。紅鰭東方鲀鰭細(xì)胞系在2～4 d為指數(shù)生長(zhǎng)期，4～5 d為平穩(wěn)期(王縉云等, 2018)，5 d之后為衰退期。與紅鰭東方鲀鰭細(xì)胞相比，BICF1進(jìn)入指數(shù)生長(zhǎng)期更快。

表3 鹽度對(duì)BICF1增殖的影響(Mean±SD)

Tab.3 Effects of salinity on BICF1 cell proliferation

注：標(biāo)有不同字母表示組間有顯著差異(<0.05)，其中，大寫字母為不同鹽度同一時(shí)間下BICF1多重比較，小寫字母為同一鹽度不同時(shí)間下BICF1多重比較。下同。

Note: The means with different letters are significantly different (<0.05). The capital letters are BICF1 multiple comparisons at the same time with different salinity, and the small letters are BICF1 multiple comparisons at the same time with the same salinity. The same as below.

表4 NaHCO3堿度對(duì)BICF1增殖的影響

Tab.4 Effect of NaHCO3 alkalinity on BICF1 cell proliferation (Mean±SD)

圖8 不同濃度NaCl/NaHCO3對(duì)BICFI細(xì)胞增殖數(shù)量的影響

本研究塔里木裂腹魚(yú)BICF1呈懸浮生長(zhǎng)。貼壁培養(yǎng)型的細(xì)胞，細(xì)胞膜表面含有大量黏附因子。這些黏附因子可激活不同的信號(hào)通路調(diào)節(jié)貼壁細(xì)胞的活性和增殖，如整合素(integrins)活化黏著斑激酶(focal adhesion kinase)激活信號(hào)通路抑制細(xì)胞內(nèi)源性的凋亡(Zhong, 2012; Hofmann, 2007)。懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞一般為淋巴細(xì)胞等血液系統(tǒng)來(lái)源的細(xì)胞，細(xì)胞體積小，缺乏粘附分子的表達(dá)(姬廣超等, 2020; 徐偉等, 2020)。在塔里木裂腹魚(yú)BICF1染色體的制備中發(fā)現(xiàn)，用0.075 mol/L的KCl低滲時(shí)間達(dá)90 min。有研究報(bào)道，棕點(diǎn)石斑魚(yú)(♀)×鞍帶石斑魚(yú)(♂) F1染色體制備中低滲時(shí)間為25 min (劉莉等, 2016)；鯉()染色體標(biāo)本的制備中低滲的時(shí)間控制在35 min (耿波等, 2003)；黃顙魚(yú)()染色體標(biāo)本的制備中低滲的時(shí)間控制在40 min (宋立民等, 2010)；灰海馬()染色體標(biāo)本的制備中低滲的時(shí)間為50 min (劉鑫等, 2020)；報(bào)道的研究中低滲的時(shí)間在25～50 min。因此，推測(cè)塔里木裂腹魚(yú)BICF1細(xì)胞膜不易破裂，與BICF1細(xì)胞膜的堅(jiān)韌程度有關(guān)。用物理方法進(jìn)行貼壁型細(xì)胞的懸浮馴化時(shí)，使細(xì)胞發(fā)生失巢凋亡(anoikis)(王朋朋等, 2021)，無(wú)血清與生物反應(yīng)器馴化使貼壁細(xì)胞產(chǎn)生失巢凋亡的拮抗。目前，MDCK(吳培培等, 2016)、BHK-21(趙彩紅等, 2019)、Hi5-SF(馬偉等, 2017)、PK15(劉天倫等, 2019)等被馴化。塔里木裂腹魚(yú)BICF1培養(yǎng)中可能產(chǎn)生類似于失巢凋亡的調(diào)節(jié)。塔里木裂腹魚(yú)腎細(xì)胞呈懸浮生長(zhǎng)的狀態(tài)，可能與其體積和細(xì)胞膜表面粘附分子的表達(dá)及細(xì)胞膜堅(jiān)韌程度有關(guān)，可能與類似于失巢凋亡的調(diào)節(jié)有關(guān)，具體原因有待于進(jìn)一步研究。

細(xì)胞來(lái)源的鑒定通常采用16S rRNA、12S rRNA和Cytb等基因片段，本研究選擇16S rRNA進(jìn)行鑒定，BICF1序列分析結(jié)果與塔里木裂腹魚(yú)基因序列一致性為100%，證明細(xì)胞系來(lái)自于塔里木裂腹魚(yú)。

塔里木裂腹魚(yú)曾是新疆博斯騰湖主要經(jīng)濟(jì)魚(yú)類，由于開(kāi)荒造田，農(nóng)田鹽堿水大量排入湖水，鹽堿度逐年升高(劉立彭, 1983)。水體中鹽堿度水平對(duì)魚(yú)類存活有顯著影響，鹽堿度過(guò)高或過(guò)低都會(huì)顯著降低魚(yú)類的存活率(張雅芝等, 2009; 秦志清等, 2010)。在尼羅羅非魚(yú)()鹽堿度的耐受性研究中發(fā)現(xiàn)，鹽度為20時(shí)，僅少數(shù)個(gè)體能存活96 h；NaHCO3堿度為12 g/L時(shí)，96 h全部死亡(趙麗慧等, 2014)；對(duì)縊蟶()急性低鹽脅迫，并檢測(cè)當(dāng)鹽度由2到0時(shí)，其存活率隨鹽度的下降而降低(李智等, 2020)；當(dāng)碳酸鹽堿度為0～44.58 mmol/L、pH為9.0～10.0時(shí)，隨著碳酸鹽堿度濃度的上升，縊蟶的存活率明顯下降(葉博等, 2019)。本研究中，鹽度為1～6時(shí)，BICF1增殖數(shù)量上升；鹽度為6～10時(shí)，BICF1增殖數(shù)量下降；鹽度為6時(shí)，BICF1增殖數(shù)量最高。NaHCO3堿度為2～6 g/L時(shí)，BICF1增殖數(shù)量上升；堿度為6～10 g/L時(shí)，BICF1增殖數(shù)量下降；堿度為6 g/L時(shí)，BICF1增殖最高。本研究中，鹽堿度過(guò)高或過(guò)低都會(huì)使塔里木裂腹魚(yú)尾鰭細(xì)胞的存活率降低。紅鯽(red)鰭細(xì)胞系被建立被用于抗藥性和抗病性的研究，細(xì)胞系可用于毒性篩選和病毒分離的材料(Xiao, 2018)。草魚(yú)鰭細(xì)胞系用于研究草魚(yú)源維氏氣單胞菌對(duì)宿主細(xì)胞的毒性致死機(jī)制(劉明珠等, 2019)；異育銀鯽()尾鰭細(xì)胞(GiCF)用于辛硫磷對(duì)GiCF毒性研究，表明GiCF可作為農(nóng)藥的細(xì)胞毒性研究材料(趙燕楠等, 2020)。本研究中，塔里木裂腹魚(yú)尾鰭細(xì)胞系可作為研究鹽堿度對(duì)塔里木裂腹魚(yú)的影響的材料，可為其選擇育種和功能基因研究提供良好的載體。

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Establishment and the Effect of Salinity of Cell Lines Derived from Tail Fin of

DAI Jincai, NIE Zhulan①, ZHAO Nianhua, REN Yongli, WEI Jie

(College of Animal Science, Tarim University; Key Laboratory of Tarim Animal Husbandry Science and Technology,Xinjiang Production and Construction, Alar, Xinjiang 843300, China)

To establish the caudal fin cell line of, this study employed the tissue block method with fetal bovine serum (FBS) DME/F12 medium forcultivation of the tail fin, using previously established tail-fin cell lines (BICF1) ofIn this study, the effect of NaCl salinity and NaHCO3alkalinity on the proliferation of tail fin cells was investigated using the MTT method. The main results are as follows: the BICF1 suspension culture was propagated to 45 generations. The optimum medium was DME/F12. The optimal FBS concentration was determined to be 20%. The optimum temperature was 25℃. The population doubling time of the 10th generation BICF1 was 28.11 h, showing an "S" type growth. The 6th generation BICF1 in liquid nitrogen was recovered after freezing for 180 days. Trypan blue staining showed that after recovery, (87.85±0.66)% of BICF1 cells were active, and the cells could proliferate and pass to next generation. The BICF1 cell line is free of contamination by bacteria, fungi, and mycoplasma. The sequencing results of mitochondrial 16S rRNA of the 10th generation BICF1 were consistent with the GenBank gene sequence, and the consistency rate of BICF1 and JQ844133.1 was 100%, proving that BICF1 was fromBICF1 cell proliferation increased with salinity of 1, 2, 4, and 6, but decreased with salinity of 6, 8, and 10; BICF1 cell proliferation was the highest at 6. The NaHCO3alkalinity of BICF1 increased at 2, 3, 4, 5, and 6 g/L, whereas the proliferation of BICF1 cells decreased at 6, 7, 8, and 10 g/L, respectively. BICF1 cell proliferation was the highest at 6 g/L. Cell proliferation first increased and then decreased with increasing salinity and alkalinity. This study aimed to provide a scientific basis for the rational development and utilization of genetic resources of,includingthe establishment and protection of the germplasm.

; Tail fin; Cell culture

NIE Zhulan, E-mail: niezhl2004@163.com

10.19663/j.issn2095-9869.20210412003

Q952

A

2095-9869(2022)04-0070-11

*國(guó)家自然科學(xué)基金(31560721; 31860729)、自治區(qū)研究生科研創(chuàng)新項(xiàng)目(TDGRI201918)、國(guó)家大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(202010757007)、中國(guó)海洋大學(xué)塔里木大學(xué)科研合作聯(lián)合基金項(xiàng)目(ZHYLH201902)和華中農(nóng)業(yè)大學(xué)塔里木大學(xué)科研合作聯(lián)合基金項(xiàng)目(TDHNLH201702; 2662017PY118)共同資助 [This work was supported by National Natural Science Foundation of China (31560721; 31860729), Research and Innovation Program for Graduate Students of Autonomous Region (TDGRI201918), Undergraduate Innovation and Entrepreneurship Training Program (202010757007), Joint Research Fund between Ocean University of China and Tarim University (ZHYLH201902), and Huazhong Agricultural University and Tarim University Research Cooperation Joint Fund Project (TDHNLH201702; 2662017PY118)].

代金彩，E-mail: 1477496028@qq.com

聶竹蘭，教授，E-mail: niezhl2004@163.com

2021-04-12,

2021-05-22

http://www.yykxjz.cn/

代金彩, 聶竹蘭, 趙年樺, 任永麗, 魏杰. 塔里木裂腹魚(yú)尾鰭細(xì)胞系的建立及鹽堿度對(duì)其增殖的影響. 漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展, 2022, 43(4): 70–80

DAI J C, NIE Z L, ZHAO N H, REN Y L, WEI J. Establishment and the effect of salinity of cell lines derived from tail fin of. Progress in Fishery Sciences, 2022, 43(4): 70–80

(編輯 馮小花)