楊美豐，紀(jì)坤發(fā)，何 瑛，利志鋒，陳錦璇，楊愛君

廣東燕塘乳業(yè)股份有限公司，廣東廣州 511356

0 引言

生乳中亞硝酸鹽的含量，影響乳制品的質(zhì)量安全。亞硝酸鹽作為生態(tài)系統(tǒng)中氮循環(huán)的組成成分之一，廣泛地存在于自然環(huán)境中[1]。生乳中亞硝酸鹽含量超標(biāo)問題，可由奶牛場的衛(wèi)生不達標(biāo)，或者水質(zhì)、飼料成分等眾多原因造成。而亞硝酸鹽會使血液中正常攜氧的低鐵血紅蛋白氧化成高鐵血紅蛋白，因而失去攜氧的能力而導(dǎo)致人體呼吸衰竭，甚至導(dǎo)致大腦缺氧。在胃酸環(huán)境下，亞硝酸鹽可以與食物或胃中的仲胺、叔胺等發(fā)生反應(yīng)，生成致癌物亞硝胺[2]，其在人體內(nèi)聚集可引起食道癌、胃癌、大腸癌等[3，4]。根據(jù)《GB2762—2017 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中污染物限量》的要求[5]，生乳的亞硝酸鹽含量不得高于0.4 mg/kg，因此，監(jiān)控生乳中亞硝酸鹽的含量至關(guān)重要。

目前，檢測生乳中亞硝酸鹽含量的方法有色譜法、分光光度法、電化學(xué)分析法和快速檢測法[6]。我國國家標(biāo)準(zhǔn)《GB 5009.33—2016 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》主要檢測方法為離子色譜法和分光光度法[7]，但其中的分光光度法在液體乳前處理用的是“沸水浴”形式，并未指明其最適加熱溫度。加熱溫度過高會導(dǎo)致試樣沉淀液中洗脫游離出來的亞硝酸根離子分解，而當(dāng)加熱溫度達不到要求時，試樣沉淀液中的亞硝酸根離子不能完全洗脫游離出來，以上兩種情況都會導(dǎo)致試樣的加標(biāo)回收率偏低、重復(fù)性差。本研究通過改變其加熱溫度，以確定合適的加熱溫度，為企業(yè)日常檢測生乳中亞硝酸鹽含量提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與設(shè)備

1.1.1 試劑

亞硝酸鈉溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，北京海岸鴻蒙標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)技術(shù)有限責(zé)任公司；亞鐵氰化鉀、乙酸鋅、硼砂、鹽酸，廣州化學(xué)試劑廠；對氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；乳粉質(zhì)控樣，北京美正檢測技術(shù)有限公司。

生乳來自廣東、福建、甘肅等地的奶牛場。本方法所用試劑均為分析純。水為《GB/T 6682—2008分析試驗室用水規(guī)格和試驗方法》規(guī)定的一級水。

1.1.2 儀器設(shè)備

紫外可見分光光度計，日本島津公司；冷凍離心機，德國Sigma公司；電磁爐，九陽股份有限公司；振蕩水浴箱，德國Julabo公司；電冰箱，德國西門子股份公司；超純水系統(tǒng)，德國默克密理博公司；移液槍，德國普蘭德公司；渦旋振蕩器，廣州海太光電生物科技有限公司；50 mL離心管。

1.1.3 溶液配制

亞鐵氰化鉀溶液（150 g/L）：稱取15.0 g亞鐵氰化鉀，用水溶解，稀釋至100 mL。

乙酸鋅溶液（220 g/L）：稱取22.0 g乙酸鋅，先加3 mL冰乙酸溶解，用水稀釋至100 mL。

飽和硼砂溶液（50 g/L）：稱取25.0 g硼酸鈉，溶于500 mL熱水中，冷卻后備用。

鹽酸（20%）：量取20 mL鹽酸，用水稀釋至100 mL。

對氨基苯磺酸溶液（4 g/L）：稱取0.4 g對氨基苯磺酸，溶于100 mL20%鹽酸中，混勻，置棕色瓶中，避光保存。

鹽酸萘乙二胺溶液（2 g/L）：稱取0.2 g鹽酸萘乙二胺，溶于100 mL水中，混勻，置棕色瓶中，避光保存。

亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)儲備液（40 mg/L）：吸取10 mL亞硝酸鈉溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（濃度200 μg/mL）于50 mL容量瓶，用水稀釋至刻度，混勻后置于4 ℃避光保存。

亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)使用液（5 mg/L）：吸取3.125 mL亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)儲備液（40 mg/L）于25 mL容量瓶，用水稀釋至刻度。

1.2 方法

1.2.1 樣品前處理

吸取18 mL樣品于50 mL離心管，加入2.5 mL飽和硼砂溶液，混勻，再加入70 ℃左右的水約12 mL，混勻，分別于93 ℃、95 ℃、97 ℃、99 ℃水中加熱15 min，取出放于冷水中冷卻，放置至室溫后加入1 mL亞鐵氰化鉀溶液，搖勻，再加入1 mL乙酸鋅溶液，搖勻，以沉淀蛋白質(zhì)，最后加5.5 mL水定容至40 mL。放置沉淀2 h后離心（9000 r/min，3 min），過濾，濾液備用。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線

吸取15 μL、30 μL、60 μL、90 μL、120 μL、150 μL、180 μL亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)使用液（相當(dāng)于0.075 μg、0.15 μg、0.3 μg、0.45 μg、0.6 μg、0.75 μg、0.9 μg亞硝酸鈉）于10 mL比色管，加入0.6 mL 4 g/L對氨基苯磺酸溶液，混勻后靜置3～5 min，再加入0.3 mL 2 g/L鹽酸萘乙二胺溶液，加水至刻度，混勻，靜置15 min后以零管調(diào)節(jié)零點上機測定。

1.2.3 樣品測定

吸取4 mL樣品于10 mL比色管，加入0.6 mL 4 g/L對氨基苯磺酸溶液，混勻后靜置3～5 min，再加入0.3 mL 2 g/L鹽酸萘乙二胺溶液，加水至刻度，混勻，靜置15 min后，用1 cm的比色管，于波長為538 nm處測吸光度，同時做試劑空白。

1.2.4 計算公式

X-試樣中亞硝酸鈉的含量，mg/L；C-曲線得出亞硝酸鈉的濃度，mg/L；V0-試樣處理液總體積，40 mL；10-測定用樣液最終定容體積，mL；V1-取樣量，18 mL；V2-測定用樣液體積，4 mL。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

按照1.2.2的步驟進行試驗，以亞硝酸鈉濃度為橫坐標(biāo)，對應(yīng)的吸光度為縱坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。如圖1所示，得到回歸方程為y=0.76896x-0.00030，相關(guān)系數(shù)R2=0.99991，線性關(guān)系良好。

圖1 亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.2 在不同溫度下樣品加標(biāo)回收率試驗

制備3 個不同濃度水平的加標(biāo)奶樣，每個濃度的加標(biāo)樣做2 個平行，檢測的空白奶樣作為對比，按照樣品前處理方法進行檢測，計算回收率，結(jié)果見表1。

由表1可知，隨著水浴溫度的上升，亞硝酸鹽回收率上升，當(dāng)溫度增加到95 ℃時，回收率達到90.50%以上，此后，水浴溫度繼續(xù)上升，回收率反而是下降趨勢?？梢姡囟染S持在95 ℃時，可以較好地滿足試驗要求。

表1 加標(biāo)回收率試驗

2.3 同一溫度下重復(fù)性試驗

隨機選取奶牛場樣品，在加熱溫度95 ℃下，按照上述方法進行處理，平行測定6 次，分別記錄吸光度值，計算亞硝酸鹽檢測值，試驗結(jié)果見表2。

表2 重復(fù)性試驗（n=6）

由表2可知，在加熱溫度為95 ℃下，平行測定的6 個樣品的RSD為2.04%，低于5%，表明該溫度下亞硝酸鹽測定結(jié)果的重現(xiàn)性良好。

2.4 乳粉質(zhì)控樣品驗證試驗

參照樣品前處理方法對乳粉質(zhì)控樣品進行檢測，驗證方法的準(zhǔn)確性，測得結(jié)果見表3。

表3 質(zhì)控樣品測定結(jié)果

由表3可知，加熱溫度在95 ℃的前處理方法下，亞硝酸鹽的測定值在質(zhì)控樣品的標(biāo)準(zhǔn)值區(qū)間內(nèi)，相對平均偏差0.02%，方法的準(zhǔn)確性良好。

3 討論

目前，檢測生乳中亞硝酸鹽含量的方法有色譜法、分光光度法、電化學(xué)分析法和快速檢測法[6]。崔曉青等[8]建立的離子色譜法可以準(zhǔn)確地檢測乳制品中亞硝酸鹽含量，該方法標(biāo)準(zhǔn)曲線線性（R=0.9957），方法回收率（80.5%～116.87%），RSD值（4.195%）；杜曉旭等[9]研究設(shè)計了可用于快速定性檢測牛乳及乳制品中亞硝酸鹽的方法，該方法可以根據(jù)試樣的顯色結(jié)果快速的定性；戴興德等[10]設(shè)計研究了活化玻碳電極直接測定法檢測牛奶中亞硝酸鹽含量，該方法標(biāo)準(zhǔn)曲線線性（R=0.9994），方法回收率（97%～98%）。而本文建立的紫外分光光度法檢測生乳中亞硝酸鹽含量，其標(biāo)準(zhǔn)曲線線性（R2≥0.99991），方法回收率（90.50%～92.17%），RSD值（2.04%），均比上述方法有一定優(yōu)勢，具有操作簡便、分析快速、測定結(jié)果準(zhǔn)確、精密度好等優(yōu)點，能夠準(zhǔn)確而又快速檢測生乳中亞硝酸鹽含量。

4 結(jié)論

本文通過研究溫度對紫外分光光度法測定生乳中亞硝酸鹽含量的影響可得，試驗前處理加熱溫度設(shè)置在95 ℃，結(jié)果顯示試驗穩(wěn)定性良好，3 個（0.1 mg/L、0.2 mg/L、0.3 mg/L）不同水平的加標(biāo)平均回收率為91.00%、90.50%、92.17%，重復(fù)性試驗RSD＜5%，滿足檢測質(zhì)量的要求，該方法適合生乳中亞硝酸鹽含量的檢測。