王 倩, 徐劍豪, 顧婷婷, 干文娟

(1. 蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部, 江蘇 蘇州, 215000;2. 江蘇大學(xué)附屬昆山市第一人民醫(yī)院 病理科, 江蘇 昆山, 215300;3. 蘇州大學(xué)附屬獨(dú)墅湖醫(yī)院 病理科, 江蘇 蘇州, 215000)

卵巢癌是全球范圍內(nèi)第3大常見的婦科惡性腫瘤，且病死率高居?jì)D科惡性腫瘤的第1位[1], 患者5年生存率低于45%[2]。漿液性癌是卵巢癌最常見的病理類型[3], 可分為卵巢高級(jí)別漿液性癌(HGSOC)和卵巢低級(jí)別漿液性癌(LGSOC), 而兩者的臨床預(yù)后相差甚遠(yuǎn)[4]。本研究從GEO數(shù)據(jù)庫中下載GSE73638、GSE27651、GSE14001數(shù)據(jù)集，應(yīng)用GEO2R在線分析工具篩選卵巢漿液性癌的差異表達(dá)基因(DEGs), 并對(duì)DEGs進(jìn)行基因本體(GO)和京都基因與基因組百科全書(KEGG)富集分析，發(fā)現(xiàn)桿狀病毒凋亡抑制蛋白5(BIRC5)是卵巢漿液性癌的關(guān)鍵分子。BIRC5屬于細(xì)胞凋亡抑制蛋白家族成員[5], 是含有細(xì)胞凋亡重復(fù)(BIR)結(jié)構(gòu)域的142個(gè)氨基酸的多功能小蛋白質(zhì)[6]。已有眾多研究發(fā)現(xiàn)BIRC5在乳腺癌[7]、肺腺癌[8]、胰腺癌[9]、尤文肉瘤[10]等多種腫瘤中過度表達(dá)，并與患者的預(yù)后密切相關(guān)[11], 但BIRC5在卵巢癌中的表達(dá)情況及潛在機(jī)制等尚有待進(jìn)一步探索。本研究分析BIRC5在卵巢漿液性癌中的表達(dá)及病理意義，并初步探討 BIRC5對(duì)卵巢漿液性癌發(fā)展過程的調(diào)控機(jī)制，以期為卵巢漿液性癌的個(gè)性化治療、診斷和預(yù)后評(píng)估提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 生物信息學(xué)檢測(cè)方法

1.1.1 數(shù)據(jù)集篩選: 從GEO數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)[12]中篩選人類HGSOC、LGSOC的芯片數(shù)據(jù)集，包括GSE73638、GSE27651和GSE14001數(shù)據(jù)集。GSE73638的平臺(tái)是GPL20967, 包含13個(gè)HGSOC樣本和7個(gè)LGSOC樣本; GSE27651和GSE14001的平臺(tái)是GPL570, GSE27651包含21個(gè)HGSOC樣本和13個(gè)LGSOC樣本, GSE14001包含10個(gè)HGSOC樣本和10個(gè)LGSOC樣本。

1.1.2 DEGs篩選: 以P<0.05和|logFC|>1為閾值，應(yīng)用GEO2R在線分析工具對(duì)GSE73638數(shù)據(jù)集和GSE27651數(shù)據(jù)集的DEGs進(jìn)行交集檢測(cè)。由于上述閾值篩選到的DEGs有限，為了保證有足夠的DEGs用于后續(xù)分析, GSE14001數(shù)據(jù)集中的DEGs僅以P<0.05為閾值進(jìn)行檢測(cè)。應(yīng)用GSE14001數(shù)據(jù)庫對(duì)第1次檢測(cè)到的DEGs(GSE73638、GSE27651數(shù)據(jù)集的重疊DEGs)進(jìn)行交集分析，再使用在線Venn軟件獲取數(shù)據(jù)集之間的重疊DEGs。

1.1.3 DEGs的GO和KEGG富集分析: 應(yīng)用WebGestalt在線分析工具對(duì)DEGs進(jìn)行GO和KEGG通路富集分析，并用R軟件(ggplot2包)繪制結(jié)果，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.1.4 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和關(guān)鍵基因篩選: 首先，應(yīng)用String在線工具(http://string-db.org)對(duì)重疊DEGs構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)(設(shè)置相互作用得分>0.700); 然后，應(yīng)用Cytoscape軟件的插件MCODE根據(jù)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)對(duì)給定的網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行聚類，從而找到緊密連接的區(qū)域; 最后，應(yīng)用Cytoscape軟件的另一個(gè)插件程序CytoHubba以Radiality算法對(duì)頂級(jí)節(jié)點(diǎn)進(jìn)行排序，篩選前10個(gè)關(guān)鍵基因。

1.1.5 關(guān)鍵基因與預(yù)后的關(guān)系分析: 通過GEPIA數(shù)據(jù)庫(http://gepia.cancer-pku.cn/index.html)驗(yàn)證關(guān)鍵基因在卵巢癌組織和癌旁組織中的表達(dá)水平，并分析關(guān)鍵基因與卵巢癌患者總體生存情況和分期的相關(guān)性。

1.2 臨床標(biāo)本收集

收集2014年1月—2021年8月在昆山市第一人民醫(yī)院接受手術(shù)治療的58例卵巢漿液性癌患者的卵巢癌組織(石蠟包埋)，包括38例HGSOC和20例LGSOC(分別納入HGSOC組和LGSOC組)，病理診斷參照國際癌癥研究機(jī)構(gòu)發(fā)布的2014版世界衛(wèi)生組織(WHO)女性生殖系統(tǒng)腫瘤分類。所有患者術(shù)前均未接受放療和化療，且臨床病理資料完整。根據(jù)國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(FIGO)2014年分期標(biāo)準(zhǔn)對(duì)卵巢漿液性癌組織標(biāo)本進(jìn)行病理分期。

1.3 免疫組織化學(xué)檢測(cè)方法

BIRC5、Ki-67和TP53蛋白檢測(cè)采用免疫組織化學(xué)GTvisionTM二步染色法。兔抗人BIRC5單克隆抗體(貨號(hào)GT204802，即用型)、鼠抗人Ki-67單克隆抗體(貨號(hào)GT209429, 即用型)、鼠抗人TP53單克隆抗體(貨號(hào)GM700102, 即用型)均購自上?；蚩萍脊荆被?lián)苯胺(DAB)試劑購自上海基因科技公司，用已知陽性組織作為陽性對(duì)照，用磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作為陰性對(duì)照，檢測(cè)步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行。以出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性, BIRC5陽性反應(yīng)定位于細(xì)胞膜和細(xì)胞漿, Ki-67、TP53陽性反應(yīng)定位于細(xì)胞核，背景無染色。采用Allred評(píng)分法[13]對(duì)BIRC5、TP53免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分級(jí): ① 染色強(qiáng)度，陰性為0分、弱棕黃色為1分、中等棕黃色為2分、強(qiáng)棕黃色為3分; ② 陽性細(xì)胞所占比例, 0～1/100為1分、>1/100～1/10為2分、>1/10～1/3為3分、>1/3～2/3為4分、>2/3為5分。總積分為染色強(qiáng)度評(píng)分與陽性細(xì)胞所占比例評(píng)分相加所得, 0～2分為陰性，≥3分記為陽性。Ki-67表達(dá)水平的判定以20%陽性腫瘤細(xì)胞為臨界值, ≤20%為低表達(dá), >20%為高表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，不同臨床病理特征的卵巢漿液性癌患者BIRC5蛋白表達(dá)情況比較采用卡方檢驗(yàn)。繪制受試者工作特征(ROC)曲線，評(píng)價(jià)BIRC5、Ki-67、TP53對(duì)LGSOC與HGSOC的鑒別診斷價(jià)值。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 生物信息學(xué)檢測(cè)結(jié)果

Venn圖顯示, GSE73638數(shù)據(jù)集與GSE27651數(shù)據(jù)集的重疊DEGs包括157個(gè)上調(diào)基因和204個(gè)下調(diào)基因(圖1A)，進(jìn)一步應(yīng)用GSE14001數(shù)據(jù)集對(duì)上述重疊DEGs進(jìn)行交集分析，最終得到79 個(gè)上調(diào)基因和85個(gè)下調(diào)基因(圖1B)。

A: GSE73638、GSE27651數(shù)據(jù)集的重疊DEGs; B: GSE14001數(shù)據(jù)集與GSE73638+GSE27651數(shù)據(jù)集的重疊DEGs。圖1 GSE73638、GSE27651和GSE14001數(shù)據(jù)集重疊DEGs的Venn圖

本研究先利用String數(shù)據(jù)庫構(gòu)建重疊DEGs的PPI網(wǎng)絡(luò)(圖2A)，再應(yīng)用Cytoscape軟件進(jìn)行可視化分析并構(gòu)建出一個(gè)包括115個(gè)節(jié)點(diǎn)和894條邊的 PPI 網(wǎng)絡(luò)(圖2B); 應(yīng)用MCODE插件將PPI網(wǎng)絡(luò)分為4個(gè)模塊(圖2C), 第1個(gè)模塊有38個(gè)節(jié)點(diǎn)和661條邊(MCODE得分35.730分)，第2個(gè)模塊有7個(gè)節(jié)點(diǎn)和21條邊(MCODE得分7.000分)，第3個(gè)模塊有5個(gè)節(jié)點(diǎn)和10條邊(MCODE得分5.000分), 第4個(gè)模塊有3個(gè)節(jié)點(diǎn)和3條邊(MCODE得分3.000分); 應(yīng)用CytoHubba插件篩選出前10個(gè)Hubba節(jié)點(diǎn)，即BIRC5、CDC20、CDK1、CDKN3、MKI67、NUSAP1、RRM2、TOP2A、TPX2和UBE2C基因，以便使用徑向拓?fù)浼夹g(shù)進(jìn)一步研究(圖2D)。

A: String數(shù)據(jù)庫中重疊DEGs的PPI網(wǎng)絡(luò); B: Cytoscape軟件建立的PPI網(wǎng)絡(luò); C: MCODE插件拆分的PPI網(wǎng)絡(luò)的4個(gè)模塊; D: CytoHubba插件篩選出的關(guān)鍵基因。圖2 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和關(guān)鍵基因篩選結(jié)果

GEPIA數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果顯示，10個(gè)關(guān)鍵基因中，僅BIRC5與卵巢癌患者總體生存情況相關(guān)。GEPIA在線網(wǎng)站包含了TCGA數(shù)據(jù)庫中的426例卵巢癌組織和8例癌旁組織的信息，相較于癌旁組織,BIRC5在卵巢癌組織中高表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖3A; Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期卵巢癌的BIRC5表達(dá)水平依次呈下降趨勢(shì)，但組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=2.314,P=0.109), 見圖3B; TCGA數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果提示,BIRC5表達(dá)與卵巢癌患者的總生存期呈正相關(guān)(P=0.014), 即BIRC5表達(dá)水平越高，卵巢癌患者的總生存期越長，見圖3C。

A: BIRC5在卵巢癌組織(n=426)和癌旁組織(n=8)中的表達(dá)水平; B: BIRC5表達(dá)與卵巢癌分期的關(guān)系; C: BIRC5低表達(dá)與高表達(dá)患者的生存分析。圖3 基于GEPIA數(shù)據(jù)庫分析BIRC5與卵巢癌分期和總生存期的相關(guān)性

GO和KEGG富集分析結(jié)果顯示, 164個(gè)DEGs主要富集在有絲分裂細(xì)胞周期、細(xì)胞器分裂、核分裂等生物學(xué)過程(圖4A)和癌癥相關(guān)的微小RNA等通路(圖4B)中。

A: GO富集分析的前10個(gè)生物學(xué)過程; B: KEGG通路富集分析的前10個(gè)通路。圖4 HGSOC和LGSOC重疊DEGs的GO和KEGG通路富集分析結(jié)果

2.2 BIRC5蛋白在癌組織和癌旁組織中的表達(dá)情況

免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示, LGSOC組中，癌組織的BIRC5蛋白陽性表達(dá)率與癌旁組織比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.026,P=0.311); HGSOC組中，癌組織的BIRC5蛋白陽性表達(dá)率高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=44.333,P<0.001)。見表1。

表1 BIRC5蛋白在卵巢癌組織及癌旁組織中的表達(dá)[n(%)]

2.3 卵巢癌組織中BIRC5、TP53和Ki-67蛋白表達(dá)情況

觀察LGSOC、HGSOC的蘇木素-伊紅(HE)染色形態(tài)表現(xiàn)和BIRC5、TP53、Ki-67蛋白免疫組織化學(xué)表達(dá)情況，結(jié)果顯示，BIRC5、TP53和Ki-67蛋白在HGSOC癌組織中高表達(dá)，在LGSOC癌組織中低表達(dá)，見圖5。

圖5 HGSOC、LGSOC的HE染色形態(tài)表現(xiàn)和BIRC5、TP53、Ki-67蛋白免疫組織化學(xué)染色圖(GTvisionTM二步染色法,放大100倍)

2.4 卵巢漿液性癌患者BIRC5蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

HGSOC患者的BIRC5蛋白陽性表達(dá)率高于LGSOC患者，年齡>60歲、FIGO分期Ⅲ～Ⅳ期、Ki-67蛋白>20%患者的BIRC5蛋白陽性表達(dá)率分別高于年齡≤60歲、FIGO分期Ⅰ～Ⅱ期、Ki-67蛋白≤20%的患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); 不同糖類抗原125水平、不同TP53蛋白表達(dá)情況患者的BIRC5蛋白表達(dá)情況比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05), 見表2。由此提示，卵巢漿液性癌患者BIRC5蛋白表達(dá)情況與年齡、FIGO分期、Ki-67蛋白表達(dá)和病理類型相關(guān)(P<0.05)，與糖類抗原125、TP53蛋白表達(dá)無關(guān)(P>0.05)。

表2 不同臨床病理特征的卵巢漿液性癌患者BIRC5蛋白表達(dá)情況比較[n(%)]

2.5 BIRC5、Ki-67、TP53對(duì)卵巢漿液性癌的診斷價(jià)值

ROC曲線分析結(jié)果顯示, BIRC5、Ki-67鑒別診斷LGSOC與HGSOC的曲線下面積(AUC)分別為0.909、0.931, 均大于TP53的0.790, 見表3、圖6。

表3 BIRC5、Ki-67、TP53對(duì)卵巢漿液性癌的診斷價(jià)值

圖6 BIRC5、Ki-67、TP53鑒別診斷LGSOC與HGSOC的ROC曲線

2.6 LGSOC、HGSOC患者的生存預(yù)后分析

HGSOC組患者的總體生存率低于LGSOC組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=3.522,P=0.061), 見表4。根據(jù)BIRC5蛋白檢測(cè)結(jié)果將58例卵巢漿液性癌患者分為BIRC5陽性組和BIRC5陰性組，每組29例。BIRC5陽性組患者與BIRC5陰性組患者的總體生存率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.074,P=0.300), 見表5。

表4 LGSOC、HGSOC患者的預(yù)后結(jié)局比較[n(%)]

表5 BIRC5陽性、BIRC5陰性卵巢漿液性癌患者的預(yù)后結(jié)局比較[n(%)]

3 討 論

卵巢癌是臨床常見的女性生殖道惡性腫瘤，居全球女性癌癥相關(guān)死亡原因的第8位[2]。近年來，卵巢癌的診斷、治療和預(yù)后判斷方面并無顯著改善[14], 因此亟需尋找可用于卵巢癌診斷、治療和預(yù)后評(píng)估的分子標(biāo)志物。BIRC5又稱Survivin，定位于人類染色體17q25位點(diǎn)，是細(xì)胞凋亡抑制蛋白家族的成員，可抑制細(xì)胞凋亡。研究[15]表明, BIRC5受到染色體區(qū)域維持因子1(CRM1)的正向調(diào)控，促進(jìn)了卵巢癌的發(fā)展。YIN S N等[16]對(duì)卵巢癌 OVDM1細(xì)胞系進(jìn)行生物信息學(xué)分析，證實(shí)BIRC5在卵巢癌中具有關(guān)鍵作用。HE X Y等[17]進(jìn)行Meta分析發(fā)現(xiàn)，BIRC5高表達(dá)與卵巢癌FIGO分期密切相關(guān)。OZRETIC P等[18]發(fā)現(xiàn), Hedgehog信號(hào)通路與卵巢癌的病理分型有關(guān)，且BIRC5是該通路的一個(gè)新靶點(diǎn)。WANG B J等[19]也利用原位卵巢癌小鼠模型驗(yàn)證了微小RNA-203(miR-203)通過靶向BIRC5抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT), 進(jìn)而抑制卵巢腫瘤轉(zhuǎn)移。

本研究通過GEO數(shù)據(jù)庫分析了HGSOC和LGSOC的3個(gè)數(shù)據(jù)集(GSE73638、GSE27651和GSE14001數(shù)據(jù)集)，共獲得164個(gè)重疊DEGs, 進(jìn)一步行GO和KEGG功能富集分析發(fā)現(xiàn)BIRC5是卵巢漿液性癌的關(guān)鍵基因; GEPIA生物信息學(xué)網(wǎng)站分析結(jié)果顯示,BIRC5基因與卵巢癌患者總體生存情況相關(guān)，即BIRC5表達(dá)越高，卵巢患者的生存周期就越長; 與癌旁組織相比,BIRC5在癌組織中的表達(dá)水平顯著更高。本研究分析臨床標(biāo)本后發(fā)現(xiàn), BIRC5蛋白在卵巢癌組織中的表達(dá)水平相較癌旁組織中顯著升高，且BIRC5表達(dá)與卵巢漿液性癌患者FIGO分期和Ki-67表達(dá)密切相關(guān)，即BIRC5高表達(dá)可能提示癌細(xì)胞出現(xiàn)浸潤、轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)，腫瘤惡性程度高，患者預(yù)后差。本研究還發(fā)現(xiàn)，BIRC5陽性組患者與BIRC5陰性組患者的總體生存率雖無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但BIRC5陽性組患者生存情況呈現(xiàn)劣于BIRC5陰性組患者的趨勢(shì)，與基于TCGA腫瘤樣本的GEPIA數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果不一致?？紤]原因如下: 首先，本研究樣本量有限(卵巢漿液性癌58例)，分可能存在選擇偏倚; 其次，數(shù)據(jù)庫BIRC5表達(dá)數(shù)據(jù)為mRNA水平，而非蛋白質(zhì)水平，因此需考慮BIRC5轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的情況，而本研究是通過免疫組織化學(xué)法檢測(cè)樣本的BIRC5蛋白質(zhì)表達(dá)量，更為準(zhǔn)確; 最后，數(shù)據(jù)庫檢測(cè)的癌組織中不僅包括癌成份，還含有很多間質(zhì)成分如炎細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等，因此BIRC5表達(dá)數(shù)據(jù)不能完全等同于癌組織的BIRC5表達(dá)情況，而本研究通過免疫組織化學(xué)法檢測(cè)樣本BIRC5水平，可在顯微鏡下精準(zhǔn)測(cè)量癌成份的BIRC5表達(dá)，更為準(zhǔn)確。

相關(guān)研究[20]指出，細(xì)胞核分裂增殖指標(biāo)Ki-67可作為卵巢漿液性癌的預(yù)后指標(biāo)。TP53常被用作鑒別診斷HGSOC和LGSOC的免疫組織化學(xué)指標(biāo)，且SU D等[21]發(fā)現(xiàn)TP53突變可促進(jìn)卵巢漿液性癌的發(fā)生與發(fā)展。本研究發(fā)現(xiàn), BIRC5、Ki-67在卵巢漿液性癌中均呈高表達(dá)，且BIRC5、Ki-67鑒別診斷LGSOC與HGSOC的AUC相似，均優(yōu)于TP53的AUC, 提示BIRC5未來或可作為診斷卵巢癌的新指標(biāo)。本研究中，HGSOC組患者的總體生存率低于LGSOC組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這可能是因?yàn)楸狙芯繕颖緮?shù)量較少。本研究還發(fā)現(xiàn), BIRC5表達(dá)與Ki-67表達(dá)有關(guān)，與TP53表達(dá)無關(guān)，提示BIRC5可能是通過調(diào)控Ki-67表達(dá)而非TP53信號(hào)通路來促進(jìn)卵巢癌的發(fā)生與發(fā)展，也提示BIRC5屬于一種促癌基因。本研究存在一定局限性，例如樣本量偏少，且未明確研究BIRC5對(duì)卵巢漿液性癌的具體調(diào)控機(jī)制，未來有待進(jìn)一步深入探討。

綜上所述,BIRC5是卵巢漿液性癌的關(guān)鍵基因，可作為該疾病診斷和生存預(yù)后判斷的新指標(biāo)。BIRC5屬于促癌基因，可能通過調(diào)控Ki-67表達(dá)而非TP53信號(hào)通路促進(jìn)卵巢漿液性癌的發(fā)生與發(fā)展。