王嘉菲, 田 洲, 王 蕾, 陳 娟

(北京市大興區(qū)人民醫(yī)院 消化內(nèi)科, 北京, 102699)

胃潰瘍是世界范圍內(nèi)常見的一種消化系統(tǒng)疾病，主要由感染幽門螺桿菌(Hp)、分泌大量胃酸、服用大量非甾體消炎藥造成，此外不良生活習(xí)慣也會(huì)導(dǎo)致胃潰瘍的發(fā)生，嚴(yán)重時(shí)良性胃潰瘍還會(huì)向惡性胃潰瘍轉(zhuǎn)變[1]。部分胃潰瘍會(huì)發(fā)生癌變，而盡早治療可減少癌變的發(fā)生，對(duì)保障患者的生命健康極為重要[2]。顆粒蛋白前體(PGRN)是分泌型生長(zhǎng)因子的上皮蛋白家族成員之一，在腫瘤發(fā)生、胚胎發(fā)育、炎癥調(diào)節(jié)、傷口愈合中起重要作用[3]。研究[4]表明, PGRN高表達(dá)與癌癥擴(kuò)散的發(fā)生相關(guān)。E-鈣黏附蛋白(E-cadherin)是一種跨膜糖蛋白，屬于鈣黏蛋白家族成員之一，鈣黏蛋白間的相互作用可確保細(xì)胞間緊密接觸，已有研究[5-6]發(fā)現(xiàn)胃癌的發(fā)生一定程度上與上皮鈣黏蛋白的表達(dá)異常有關(guān)。既往關(guān)于PGRN、E-Cadherin的研究多集中于子宮頸鱗癌、卵巢癌、結(jié)直腸癌等方面，目前關(guān)于良惡性胃潰瘍中PGRN、E-Cadherin的研究較少。本研究探討了PGRN、E-Cadherin在良惡性胃潰瘍組織中的表達(dá)及臨床意義，以期為探究PGRN、E-Cadherin在胃潰瘍中的作用機(jī)制提供一定的理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年4月—2017年7月北京市大興區(qū)人民醫(yī)院收治的190例胃潰瘍患者作為研究對(duì)象。將85例良性胃潰瘍患者納入良性胃潰瘍組，男40例，女45例，平均年齡(50.32±15.31)歲，取其胃鏡活檢組織作為樣本; 將105例惡性胃潰瘍(潰瘍型胃癌)患者納入潰瘍型胃癌組，男54例，女51例，平均年齡(52.33±16.85)歲，取其手術(shù)切除潰瘍型胃癌組織作為樣本。納入標(biāo)準(zhǔn): ① 經(jīng)鏡檢、活檢確診，臨床資料完整者; ② 首次患病，無Hp根除治療史者; ③ 未接受其他方法治療者; ④ 潰瘍型胃癌患者均接受手術(shù)切除治療。排除標(biāo)準(zhǔn): 患有自身免疫系統(tǒng)疾病者。本研究經(jīng)北京市大興區(qū)人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，所有患者和家屬知情并簽署同意書。

1.2 主要材料

兔抗人PGRN多克隆抗體(貨號(hào)251319, 深圳市豪地華拓生物); E-cadherin多克隆抗體(貨號(hào)ABP57182, 艾美捷科技); 即用型SP免疫組織化學(xué)試劑盒(貨號(hào)CDJ-1593C-SJH, 武漢純度生物); 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)試劑盒[貨號(hào)HEPENGBIO-TG646，赫澎(上海)生物]。

1.3 方法

1.3.1 樣本采集: 良性胃潰瘍組取患者胃鏡活檢組織作為樣本，潰瘍型胃癌組取患者手術(shù)切除胃癌組織作為樣本。用生理鹽水清理組織樣本，一部分樣本于甲醛固定、石蠟包埋后進(jìn)行5 μm切片，一部分樣本于-80 ℃保存。

1.3.2 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)PGRN、E-Cadherin蛋白表達(dá): 將上述石蠟切片進(jìn)行二甲苯脫蠟、水化，并用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗5 min。先根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行SP法染色，再用蘇木精復(fù)染、重新水化后封片進(jìn)行觀察。結(jié)果判定: ① 染色強(qiáng)度，未染色記0分，弱陽性染色記1分，中等陽性染色記2分，強(qiáng)陽性染色記3分; ② 陽性細(xì)胞占比，≤25%為0分, >25%～50%為1分, >50%～75%為2分, >75%為3分。染色強(qiáng)度評(píng)分和陽性細(xì)胞占比評(píng)分的乘積即染色指數(shù)(SI), SI≤1判為陰性, SI>1～3判為弱陽性, SI>3～<6判為中等陽性, SI≥6判為強(qiáng)陽性[7]。

1.3.3 qRT-PCR檢測(cè)組織中PGRN、E-CadherinmRNA表達(dá): 將組織置于液氮預(yù)冷的研缽中研磨后，加入TRIzol試劑提取總RNA, 經(jīng)反轉(zhuǎn)錄為cDNA后行qRT-PCR擴(kuò)增，以β-actin為內(nèi)參，用2-△△CT法分析PGRN、E-CadherinmRNA表達(dá)水平，引物見表1。

表1 qRT-PCR引物

1.4 隨訪方法

通過電話隨訪或入院復(fù)查方式進(jìn)行為期3年的跟蹤隨訪，記錄患者預(yù)后生存情況，截止時(shí)間為患者死亡時(shí)間或2020年7月。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 一般資料比較

2組患者年齡、體質(zhì)量指數(shù)、性別比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05); 潰瘍型胃癌組患者病程短于良性胃潰瘍組, Hp感染率高于良性胃潰瘍組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 2組患者一般資料比較

2.2 組織樣本中PGRN、E-Cadherin蛋白陽性表達(dá)情況

免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示，潰瘍型胃癌組PGRN蛋白陽性表達(dá)率高于良性胃潰瘍組, E-Cadherin蛋白陽性表達(dá)率低于良性胃潰瘍組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=30.721、14.463,P<0.001), 見圖1、表3。

A: PGRN蛋白在良性胃潰瘍組織中陽性表達(dá); B: PGRN蛋白在潰瘍型胃癌組織中陽性表達(dá); C: E-Cadherin蛋白在良性胃潰瘍組織中陽性表達(dá); D: E-Cadherin蛋白在潰瘍型胃癌組織中陽性表達(dá)。圖1 PGRN、E-Cadherin蛋白在良性胃潰瘍組織、潰瘍型胃癌組織中的陽性表達(dá)情況(免疫組織化學(xué)法,放大400倍)

表3 2組組織樣本中PGRN、E-Cadherin蛋白表達(dá)情況比較[n(%)]

2.3 組織樣本中PGRN、E-Cadherin mRNA表達(dá)水平

qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，潰瘍型胃癌組PGRNmRNA表達(dá)水平高于良性胃潰瘍組,E-CadherinmRNA表達(dá)水平低于良性胃潰瘍組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=9.674、10.802,P<0.001), 見表4。

表4 2組組織樣本中PGRN、E-Cadherin mRNA表達(dá)水平比較

2.4 良性胃潰瘍和潰瘍型胃癌組織中PGRN、E-Cadherin蛋白陽性表達(dá)的相關(guān)性分析

Spearman相關(guān)分析法結(jié)果顯示，良性胃潰瘍組織中, PGRN、E-Cadherin蛋白陽性表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.529,P<0.001), 見表5; 潰瘍型胃癌組織中, PGRN、E-Cadherin蛋白陽性表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.426,P<0.001), 見表6。

表5 良性胃潰瘍組織中PGRN、E-Cadherin蛋白表達(dá)的相關(guān)性分析

表6 潰瘍型胃癌組織中PGRN、E-Cadherin蛋白表達(dá)的相關(guān)性分析

2.5 良性胃潰瘍和潰瘍型胃癌組織中PGRN、E-Cadherin mRNA表達(dá)水平的相關(guān)性分析

Pearson相關(guān)分析法結(jié)果顯示，良性胃潰瘍組織、潰瘍型胃癌組織中,PGRN、E-CadherinmRNA表達(dá)水平均呈負(fù)相關(guān)(r=-0.441、-0.306,P<0.001), 見圖2、圖3。

圖2 良性胃潰瘍組織中PGRN、E-Cadherin mRNA表達(dá)水平的相關(guān)性

圖3 潰瘍型胃癌組織中PGRN、E-Cadherin mRNA表達(dá)水平的相關(guān)性

2.6 PGRN、E-Cadherin蛋白陽性表達(dá)率與潰瘍型胃癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系

不同性別、年齡、腫瘤直徑、潰瘍部位患者的潰瘍型胃癌組織PGRN、E-Cadherin蛋白陽性表達(dá)率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05); 有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤程度T3～T4期、低分化和TNM分期Ⅲ～Ⅳ期患者的PGRN蛋白陽性表達(dá)率分別高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤程度T1～T2期、高分化和TNM分期Ⅰ～Ⅱ期患者, E-Cadherin蛋白陽性表達(dá)率分別低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤程度T1～T2期、高分化和TNM分期Ⅰ～Ⅱ期患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表7。

表7 不同臨床病理特征潰瘍型胃癌患者PGRN、E-Cadherin蛋白陽性表達(dá)情況比較[n(%)]

2.7 PGRN、E-Cadherin mRNA單獨(dú)和聯(lián)合應(yīng)用對(duì)潰瘍型胃癌的診斷價(jià)值

ROC曲線顯示,PGRNmRNA診斷潰瘍型胃癌的曲線下面積(AUC)為0.855(95%CI: 0.803～0.907), 敏感度為75.29%, 特異度為87.06%, 截?cái)嘀禐?.229;E-CadherinmRNA診斷潰瘍型胃癌的AUC為0.908(95%CI: 0.868～0.949), 敏感度為75.24%, 特異度為94.12%, 截?cái)嘀禐?.892;PGRN、E-CadherinmRNA聯(lián)合診斷潰瘍型胃癌的AUC為0.959(95%CI: 0.935～0.984), 敏感度為80.91%, 特異度為82.33%;PGRNmRNA聯(lián)合E-CadherinmRNA診斷潰瘍型胃癌的AUC顯著大于PGRN、E-CadherinmRNA單獨(dú)診斷的AUC(Z=3.471,P<0.001;Z=0.039,P=0.019)。見圖4。

圖4 PGRN、E-Cadherin mRNA單獨(dú)和聯(lián)合診斷潰瘍型胃癌的ROC曲線

2.8 潰瘍型胃癌影響因素的Logistic回歸分析

Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn), TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度、浸潤程度、PGRN蛋白表達(dá)和E-Cadherin蛋白表達(dá)均為潰瘍型胃癌的獨(dú)立影響因素(P<0.05), 見表8。

表8 潰瘍型胃癌影響因素的多元Logistic回歸分析

2.9 PGRN、E-Cadherin蛋白表達(dá)與潰瘍型胃癌患者生存預(yù)后的關(guān)系

3年隨訪結(jié)果顯示, 105例潰瘍型胃癌患者中, 31例死亡, 74例生存，生存率為70.48%。PGRN蛋白陽性表達(dá)患者生存率為66.67%, PGRN蛋白陰性表達(dá)患者生存率為93.33%, 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Log-rankχ2=3.884,P=0.049), 見圖5; E-Cadherin蛋白陽性表達(dá)患者生存率為90.91%, E-Cadherin蛋白陰性表達(dá)患者生存率為55.74%, 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Log-rankχ2=15.422,P<0.001), 見圖6。由此表明，潰瘍型胃癌組織中PGRN蛋白陽性表達(dá)、E-Cadherin蛋白陰性表達(dá)均與患者3年生存預(yù)后不良相關(guān)(P<0.05)。

圖5 潰瘍型胃癌組織中PGRN蛋白表達(dá)情況與患者生存預(yù)后的關(guān)系

圖6 潰瘍型胃癌組織中E-Cadherin蛋白表達(dá)情況與患者生存預(yù)后的關(guān)系

3 討 論

胃潰瘍是臨床常見的胃部疾病，其中良性胃潰瘍是Hp感染、膽汁反流等多種因素使得胃液中H+與胃黏膜接觸造成的黏膜屏障損壞，病程長(zhǎng)，而惡性胃潰瘍是由惡性腫瘤向漿膜方向生長(zhǎng)供血不足而局部脫落壞死所形成的凹陷，病程短[8]。潰瘍型胃癌是由胃黏膜病變引發(fā)的癌變，因此監(jiān)測(cè)病情發(fā)展可預(yù)防癌變的發(fā)生，而分析良惡性胃潰瘍的臨床特征對(duì)患者病情診斷和治療方案制訂具有重要作用[9]。

PGRN表達(dá)于多種細(xì)胞內(nèi)，在腫瘤發(fā)生、癌癥擴(kuò)散、胚胎發(fā)育、炎癥調(diào)節(jié)、傷口愈合中起著重要作用，已被用作腫瘤標(biāo)志物[10-11]。相關(guān)報(bào)道[12-13]稱,PGRN基因敲除可阻斷小鼠核因子κB(NF-κB)通路，抑制JAK激酶(JAK)/信號(hào)傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)信號(hào)通路的激活，從而抑制乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲。李媛媛等[14]研究表明, PGRN在胃腸道間質(zhì)瘤患者瘤組織中的陽性表達(dá)率顯著增高，與患者預(yù)后不良相關(guān)。PGRN在胃癌組織中的免疫反應(yīng)性顯著增強(qiáng)，且與腫瘤病理學(xué)分期密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，與良性胃潰瘍組相比，潰瘍型胃癌組PGRN蛋白陽性表達(dá)率顯著增高，與相關(guān)研究[14]結(jié)論一致，提示PGRN表達(dá)增加可能與胃癌的發(fā)生相關(guān)。

E-cadherin在細(xì)胞膜上可通過相互作用確保細(xì)胞間的緊密接觸，研究[6]發(fā)現(xiàn)胃癌的發(fā)生與上皮鈣黏蛋白的表達(dá)異常有一定關(guān)系。抑制E-cadherin表達(dá)可促進(jìn)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT), 并減少細(xì)胞間相互作用[6]。E-cadherin參與多種信號(hào)通路，其表達(dá)降低可導(dǎo)致β-連環(huán)蛋白過度積累激活Wnt靶基因表達(dá)，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖和腫瘤發(fā)生[15]。在胃癌組織中, E-cadherin表達(dá)顯著降低，且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤程度、TNM分期關(guān)系密切[16]。相關(guān)研究[17]表明, E-cadherin表達(dá)下調(diào)能促進(jìn)胃癌細(xì)胞SGC7901的增殖和轉(zhuǎn)移，這可能與其抑制細(xì)胞凋亡有一定關(guān)聯(lián)。本研究發(fā)現(xiàn)，與良性胃潰瘍組相比，潰瘍型胃癌組E-Cadherin蛋白陽性表達(dá)率顯著降低，與相關(guān)研究[16]結(jié)果一致，提示E-Cadherin表達(dá)降低可能參與胃潰瘍患者的癌變過程。

研究[5]表明，微小RNA-29b-3p(miR-29b-3p)可通過靶向PGRN來改變下游Wnt信號(hào)傳導(dǎo)，刺激EMT發(fā)生[18], 然而抑制E-cadherin表達(dá)亦可促進(jìn)EMT的發(fā)生。本研究發(fā)現(xiàn), PGRN表達(dá)與E-cadherin表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，表明兩者可能相互作用并共同影響胃潰瘍的疾病進(jìn)展。本研究還發(fā)現(xiàn),PGRN、E-CadherinmRNA聯(lián)合診斷潰瘍型胃癌的AUC相較兩者單獨(dú)診斷時(shí)顯著增加，潰瘍型胃癌組織中PGRN、E-Cadherin蛋白表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤程度、分化程度和TNM分期有關(guān)，且PGRN蛋白陽性表達(dá)和E-Cadherin蛋白陰性表達(dá)均為潰瘍型胃癌的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，與相關(guān)研究[14, 16]結(jié)果一致。由此表明, PGRN、E-cadherin對(duì)潰瘍型胃癌具有較好的診斷價(jià)值，可作為早期診斷及臨床監(jiān)測(cè)指標(biāo)應(yīng)用于良惡性胃潰瘍患者中，從而改善治療效果。本研究結(jié)果還顯示，潰瘍型胃癌組織中PGRN蛋白陽性表達(dá)、E-Cadherin蛋白陰性表達(dá)均與患者3年生存預(yù)后不良相關(guān)，表明PGRN、E-cadherin可用于潰瘍型胃癌患者的生存預(yù)后分析，監(jiān)測(cè)PGRN、E-cadherin水平并盡早治療，可能對(duì)延長(zhǎng)患者生存期具有一定作用。

綜上所述，與良性胃潰瘍組織中相比，潰瘍型胃癌組織中PGRN表達(dá)顯著增加, E-Cadherin表達(dá)顯著降低; PGRN、E-cadherin對(duì)潰瘍型胃癌具有較高的診斷價(jià)值，且兩者與潰瘍型胃癌患者的臨床病理特征和生存預(yù)后有關(guān)。本研究初步探討了PGRN、E-Cadherin在良惡性胃潰瘍中的表達(dá)及臨床意義，對(duì)患者的臨床特征分析和預(yù)后評(píng)估具有一定參考價(jià)值，未來有待進(jìn)一步探究?jī)烧咴诹紣盒晕笣冎械木唧w作用機(jī)制。