賈麗娟，張云強(qiáng)，張百紅，岳紅云

0 引言

胃癌是全球最常見的惡性腫瘤之一，位居全國癌癥發(fā)病率及死亡率排名的前兩位，嚴(yán)重威脅著人們的健康和生活質(zhì)量[1]。研究胃癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制對預(yù)防、診斷和治療具有十分重要的意義。鋅指CCCH結(jié)構(gòu)域蛋白13（zinc finger CCCH domain containing protein 13,ZC3H13）作為m6A 甲基化轉(zhuǎn)移酶，與甲基轉(zhuǎn)移酶樣因子3（methyltransferase like 3,METTL3）、METTL14、METTL16、Wilms’腫瘤1相關(guān)蛋白（Wilms’ tumor 1-associated protein,WTAP）、RNA結(jié)合基序蛋白15（RNA-binding motif protein 15,RBM15）等形成甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體共同調(diào)控RNA m6A甲基化[2]。許多研究已經(jīng)證實ZC3H13在多種腫瘤組織中異常表達(dá)，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要的角色：ZC3H13在膀胱癌[3]、透明細(xì)胞腎癌[4]、甲狀腺旁腺癌[5]、子宮內(nèi)膜癌[6]中低表達(dá)；在肺腺癌[7]、宮頸鱗狀細(xì)胞癌[8]、原發(fā)性肛門鱗狀細(xì)胞癌[9]、卵巢癌[10]中高表達(dá)。目前尚缺乏ZC3H13在胃癌中作用的報道。本文擬探討ZC3H13在胃癌組織和血清中的表達(dá)及其與臨床病理特征的關(guān)系，旨在尋找一種新的胃癌生物標(biāo)志物。

1 資料與方法

1.1 病例資料

收集2020年12月—2021年12月中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九四〇醫(yī)院因胃癌入院行根治性手術(shù)，并經(jīng)病理證實為胃腺癌的患者血清標(biāo)本80例，其中男65例，女15例；年齡23～83歲，平均61.71±11.81歲。采用同期體檢的50例健康者血清標(biāo)本作為正常對照組，兩組性別、年齡差異無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）；另隨機(jī)選取2012年12月—2014年6月行手術(shù)治療的74例胃腺癌患者的癌組織以及40例非配對的癌旁正常組織，其中胃腺癌患者中男59例，女15例；年齡29～81歲，平均58.07±10.83歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：首次診治；未經(jīng)化療、放療或其他腫瘤相關(guān)生物學(xué)治療；標(biāo)本組織學(xué)分類、腫瘤分期明確；患者或其委托人知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：曾行腫瘤相關(guān)放化療、免疫治療；嚴(yán)重心、肺、肝、腎等重要臟器功能不全者；臨床資料不全者。本研究經(jīng)中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九四〇醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 試劑

ZC3H13 ELISA試劑盒購自中國江蘇酶標(biāo)生物科技有限公司；兔抗人ZC3H13多克隆抗體購自美國Sigma公司；即用型免疫組織化學(xué)SP試劑盒和PBS緩沖液購自福州邁新公司、檸檬酸組織抗原修復(fù)液、DAB顯色試劑盒購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。

1.3 數(shù)據(jù)庫

UALCAN（http://ualcan.path.uab.edu）是基于癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas,TCGA）和MET500隊列數(shù)據(jù)的交互式網(wǎng)絡(luò)資源，用來分析腫瘤與正常組織差異基因的表達(dá)及與臨床病理學(xué)參數(shù)的關(guān)系[11]。GEPIA（http://gepia.cancer-pku.cn）將TCGA癌癥大數(shù)據(jù)和GTEx正常組織兩者數(shù)據(jù)整合在一起，用來揭示癌癥亞型、驅(qū)動基因、差異基因表達(dá)等，挖掘新型癌癥靶點和標(biāo)志物[12]。Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫用來評估差異基因?qū)?1種癌癥類型生存率的影響[13]。

1.4 標(biāo)本制備

取胃癌患者、正常對照組晨起空腹靜脈血3 ml置于促凝管中，靜置15 min后3000 r/min離心15 min，取血清置于-80℃冰箱備用。癌旁正常組織取自距離癌灶5 cm處，術(shù)后病理證實均為正常胃壁組織，并制作成石蠟標(biāo)本。

1.5 血清ZC3H13蛋白檢測

ZC3H13試劑盒采用ELISA法，R＞0.95；批內(nèi)變異系數(shù)與批間變異系數(shù)應(yīng)分別小于10%和15%；檢測范圍：0.3125～10 ng/ml；最低檢測濃度小于0.1 ng/ml；嚴(yán)格依據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行操作。酶標(biāo)儀在450 nm波長處依序測量各孔的吸光度（OD值）。

1.6 免疫組織化學(xué)檢測組織中ZC3H13表達(dá)

石蠟標(biāo)本4 μm厚切片，二甲苯及不同濃度乙醇對組織進(jìn)行脫蠟復(fù)水，檸檬酸鹽高壓修復(fù)，3%H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，山羊血清室溫封閉。一抗孵育：ZC3H13抗體使用一抗稀釋液稀釋至1:500，滴加生物素標(biāo)記的二抗和鏈霉素-過氧化物酶溶液。DAB顯色，蘇木精對比染色。中性樹膠封片，顯微鏡觀察。

結(jié)果判定：由2名病理科副主任以上資歷醫(yī)師采取雙盲法閱片。半定量法進(jìn)行評分，以細(xì)胞核著色為主，偶有細(xì)胞質(zhì)著色。腫瘤細(xì)胞胞核著色強(qiáng)度分為四個等級：0（無染色）、1（淡黃色）、2（棕黃色）、3（棕褐色或黑色）；陽性腫瘤細(xì)胞占總體腫瘤細(xì)胞數(shù)百分率：1%～25%為1分、26%～50%為2分、51%～75%為3分、76%～100%為4分。將細(xì)胞陽性率及染色強(qiáng)度兩者結(jié)果相乘，≥4分為高表達(dá)或陽性表達(dá)。

1.7 隨訪

對于2012年12月—2014年6月的74例患者采用電話或門診復(fù)查的方式進(jìn)行隨訪，并通過病歷系統(tǒng)進(jìn)行查詢和補(bǔ)充。隨訪截至2021年10月31日，出院后第一年內(nèi)1、3、6、12月隨訪，以后每半年隨訪一次。失訪病例按照刪失值進(jìn)行統(tǒng)計。OS定義為從患者確診至隨訪結(jié)束或死亡。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS25.0 軟件進(jìn)行分析。計量資料呈正態(tài)分布時以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩樣本間的比較采用t檢驗，多個樣本間比較采用單因素方差分析。計數(shù)資料分析采用χ2檢驗或Fisher精確檢驗；生存曲線分析采用Kaplan-Meier法及Log rank檢驗；繪制ROC曲線以評價ZC3H13對胃癌的診斷價值。采用Cox比例風(fēng)險模型進(jìn)行多因素分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 數(shù)據(jù)庫分析

利用UALCAN及GEPIA兩個數(shù)據(jù)庫進(jìn)行驗證，發(fā)現(xiàn)ZC3H13在胃癌組織中顯著高表達(dá)（P＜0.05），見圖1A、B。檢索Kaplan-Meier Plotter及GEPIA數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)，ZC3H13蛋白高表達(dá)組的患者總生存期（overall survival,OS）與低表達(dá)組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見圖1C、D。

圖1 數(shù)據(jù)庫分析ZC3H13蛋白在胃癌中的表達(dá)及與OS的關(guān)系Figure 1 Expression of ZC3H13 in gastric cancer and its relation with OS analyzed by databases

2.2 ZC3H13在胃癌患者血清中的表達(dá)

ELISA法檢測結(jié)果顯示，胃癌組血清ZC3H13蛋白濃度明顯高于正常對照組（（6.920±1.418）ng/mlvs.（4.969±1.360）ng/ml），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=7.749,P＜0.0001），見圖2。

圖2 ELISA法檢測胃癌患者和正常對照組血清ZC3H13的濃度表達(dá)水平Figure 2 ZC3H13 levels in serum of gastric cancer patients and healthy controls detected by ELISA

2.3 血清ZC3H13蛋白水平對胃癌的診斷效能

ROC曲線分析結(jié)果顯示，胃癌患者與健康對照者ROC曲線下面積為0.826（P＜0.0001），見圖3。胃癌患者與健康對照者的最佳臨界值為4.87 ng/ml，敏感度為98.8%，特異性為50%。

圖3 胃癌患者與健康對照者血清ZC3H13水平ROC曲線圖Figure 3 ROC curve of serum ZC3H13 levels in gastric cancer patients and healthy controls

2.4 ZC3H13蛋白在胃癌和癌旁組織中的表達(dá)

免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，ZC3H13蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞核，偶而表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，見圖4。癌組織中55（74.3%）例陽性表達(dá)，非配對的癌旁正常組織19（52.5%）例陽性表達(dá)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

圖4 ZC3H13在癌旁組織(A,×100)和胃癌組織(B,×100)中的免疫組織化學(xué)結(jié)果Figure 4 Immunohistochemical results of ZC3H13 expression in adjacent tissues(A,×100) and gastric cancer tissues(B,×100)

表1 胃癌與癌旁組織中ZC3H13的表達(dá)Table 1 Expression of ZC3H13 in gastric cancer and adjacent tissues

2.5 ZC3H13的表達(dá)與臨床病理因素的關(guān)系

胃癌組織和外周血清中ZC3H13的表達(dá)水平均與胃癌患者的性別、分化程度、浸潤深度和腫瘤分期相關(guān)（P＜0.05），見表2。

表2 ZC3H13在胃癌組織和血清中的表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系Table 2 Correlation of ZC3H13 expression in cancer tissues and serum with clinicopathological features of gastric cancer patients

2.6 胃癌組織中ZC3H13表達(dá)水平與患者生存時間的相關(guān)性

Kaplan-Meier生存曲線檢驗結(jié)果顯示ZC3H13蛋白的表達(dá)高低與患者的3年總生存期差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見圖5。

圖5 胃癌患者中ZC3H13高表達(dá)與3年OS的關(guān)系Figure 5 Relation between high ZC3H13 expression and 3-year OS of gastric cancer patients

2.7 ZC3H13蛋白表達(dá)水平及臨床病理參數(shù)與胃癌患者總體生存時間的多因素分析

多因素生存分析中，將臨床病理特征包括浸潤深度、腫瘤分期、分化程度、ZC3H13表達(dá)納入Cox回歸模型（因性別因素的模型系數(shù)檢驗P=0.645，故未納入分析）。結(jié)果顯示，ZC3H13蛋白表達(dá)不是胃癌的獨立預(yù)后因素（P＞0.05），見表3。

表3 ZC3H13蛋白表達(dá)水平及臨床病理參數(shù)與胃癌患者總生存時間的多因素分析Table 3 Multivariate analysis of ZC3H13 protein expression level,clinicopathological parameters and overall survival time of patients with gastric cancer

3 討論

在胃癌發(fā)病初期，患者一般無明顯癥狀或癥狀輕微、不典型，通常在進(jìn)展期才被發(fā)現(xiàn)，5年總生存率低于40%。如果患者能在早癌階段（限于胃壁的黏膜層）被檢出并進(jìn)行內(nèi)鏡黏膜下剝離術(shù)（endoscopic submucosal dissection,ESD）治療，其5年生存率可達(dá)85%，故早期發(fā)現(xiàn)并及早治療對改善胃癌患者的預(yù)后具有重要意義[14]。因此尋找高靈敏度和特異性的胃癌生物標(biāo)志物，將有助于了解胃癌發(fā)生發(fā)展機(jī)制，為臨床預(yù)防、早期診斷和治療胃癌提供有效的方法。

目前的研究證實ZC3H13是一個典型的CCCH型鋅指蛋白，位于人類染色體13q14.13，含有1729個氨基酸。在哺乳動物中高度保守，絕大多數(shù)存在于細(xì)胞質(zhì)中，而在細(xì)胞內(nèi)其他部位無明顯表達(dá)[15]。Knuckles等[2]研究發(fā)現(xiàn)ZC3H13能夠調(diào)節(jié)m6A甲基化，主要調(diào)控WTAP或甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物在RNA上的募集并促進(jìn)m6A修飾，負(fù)責(zé)與RBM15的連接，發(fā)揮支架作用協(xié)助ZC3H13/WTAP/KIAA1429/HAKAI的復(fù)合物進(jìn)行核定位，確保m6A沉積到靶向轉(zhuǎn)錄本。此外，ZC3H13還可以調(diào)控胚胎干細(xì)胞自我更新以及RNA代謝，從而影響細(xì)胞的生長發(fā)育和疾病的發(fā)生[2,16]。

近些年來，m6A RNA表觀遺傳修飾成為腫瘤研究的熱點，研究發(fā)現(xiàn)m6A不僅可以調(diào)控編碼RNAs，還可以修飾長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA,lncRNA），調(diào)控并影響m6A RNA的轉(zhuǎn)錄、加工、翻譯和代謝等過程，參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展[17]。越來越多的研究證實m6A RNA相關(guān)修飾酶與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[18]。

最近有文獻(xiàn)[19]報道，ZC3H13在結(jié)直腸癌組織中低表達(dá)，且其低表達(dá)與癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移和患者不良預(yù)后呈正相關(guān)。功能實驗證實ZC3H13過表達(dá)可通過調(diào)控RAS-ERK信號通路抑制結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展。Gong等[20]研究發(fā)現(xiàn)METTL14和ZC3H13在乳腺癌中表達(dá)顯著下調(diào)，其通過調(diào)控Wnt信號通路抑制劑抗原提呈細(xì)胞（antigen presenting cells,APC）m6A表達(dá)水平，異常激活腫瘤Wnt信號通路而促進(jìn)乳腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移。Guo等[21]研究發(fā)現(xiàn)ZC3H13在腎透明細(xì)胞癌（kidney renal clear cell carcinoma,KIRC）中低表達(dá)，而與患者的總生存期、無進(jìn)展生存期和腫瘤特異性生存期無關(guān)。此外，ZC3H13可參與形成非炎性反應(yīng)表型，并可預(yù)測KIRC患者免疫檢查點的預(yù)后、臨床反應(yīng)及對靶向治療的敏感度。

然而，到目前為止，ZC3H13在胃癌中的作用尚不清楚。因此，本研究分析了ZC3H13在胃癌組織和血清中的表達(dá)與臨床意義，結(jié)果與UALCAN和GEPIA數(shù)據(jù)庫中的一致。進(jìn)一步的臨床病理相關(guān)分析顯示：胃癌組織和外周血血清中ZC3H13表達(dá)水平與患者的性別、分化程度、腫瘤分期和浸潤深度相關(guān)。此外ZC3H13蛋白高表達(dá)組與低表達(dá)組的3年OS差異無統(tǒng)計學(xué)意義，與數(shù)據(jù)庫檢索結(jié)果一致。以上結(jié)果提示ZC3H13可能在胃癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，對胃癌的診斷有一定的價值，有望成為早期篩查胃癌的腫瘤標(biāo)志物。

本研究有一定局限性：（1）單中心的研究，患者主要來自單一省份地區(qū)，納入的患者例數(shù)相對較少，可能會增大樣本間的異質(zhì)性，存在一定的風(fēng)險偏倚；（2）納入的患者中腫瘤進(jìn)展或患者死亡的比例較低，隨訪結(jié)果可能無法達(dá)到預(yù)期目的；（3）未進(jìn)行細(xì)胞功能實驗及體內(nèi)實驗驗證等深入的作用機(jī)制研究；（4）因條件限制納入的樣本量較小，因此所得結(jié)論并不一定能全面客觀地反映ZC3H13在胃癌中的臨床應(yīng)用價值。

綜上，m6A甲基化轉(zhuǎn)移酶ZC3H13在胃癌組織中呈高表達(dá)，外周血血清中ZC3H13的濃度也明顯升高，有望成為胃癌的新型生物標(biāo)志物，未來有必要深入探究ZC3H13對胃癌細(xì)胞惡性表型的影響及其作用機(jī)制，為胃癌的診斷和治療提供新的線索。