陳耿仟，吳國平，洪麗明，林 潤

心血管疾病，如心力衰竭、冠心病和急性心肌梗死等與心肌結(jié)構(gòu)和功能失調(diào)密切相關(guān)，嚴(yán)重威脅人類生命安全[1]。溶栓、冠狀動脈介入是治療心血管疾病的有效手段，可使病人受到不同程度的心肌缺血/再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)損傷[2]。因此，開發(fā)新策略預(yù)防I/R損傷對改善心血管疾病具有重要的臨床意義[3]。miR-19a在糖尿病誘導(dǎo)的心肌組織中過表達(dá)，可能參與糖尿病心肌損傷過程。Liu等[4]研究顯示，激活細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制蛋白3(SOCS3)可抑制蛋白質(zhì)酪氨酸激酶-1(JAK1)及轉(zhuǎn)錄活化蛋白3(STAT3)磷酸化水平，抑制SOCS3表達(dá)可抑制肝癌細(xì)胞自噬。有研究顯示，I/R導(dǎo)致心肌細(xì)胞過度自噬，抑制I/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞自噬，進(jìn)而保護(hù)心臟功能[5]。miR-19能否參與調(diào)控缺氧(hypoxia，H)和復(fù)氧(reoxygenation，R)誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞自噬過程及其與SOCS3/JAK1/STAT3通路的關(guān)系尚未明確。本研究在體外模擬H/R模型[6]，探討miR-19a過表達(dá)對H/R誘導(dǎo)下心肌細(xì)胞增殖、凋亡及自噬變化情況，并分析潛在的作用機(jī)制，為預(yù)防心肌細(xì)胞I/R損傷提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與儀器

1.1.1 實驗材料 大鼠心肌細(xì)胞H9c2(GNR5)購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫；DMEM高糖(11995)/無糖(90113)培養(yǎng)基、優(yōu)級胎牛血清(11011-8611)、胰蛋白酶消化液(0.25%)(T1350)、雙抗(青鏈霉素混合液)(P1400)、Matrigel基底膠(M8370)、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(T2210-200T)、電化學(xué)發(fā)光(ECL)液(PE0010)購自北京Solarbio公司；miR-19a模擬(mimics)、miR-19a陰性對照(negative control，NC)由廣州銳博生物科技有限公司設(shè)計；膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶(annexin V-fluorescein isothiocyanate/propidium iodide，Annexin V-FITC/PI)細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(C1062M)、RIPA裂解液(P0013B)、Trizol試劑盒(R0016)、細(xì)胞計數(shù)試劑盒-8(cell counting kit-8，CCK-8)(C0037)上海碧云天生物技術(shù)有限公司；LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒(11668019)、磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde phosphate Dehydrogenase，GAPDH)兔抗人多克隆抗體(PA1-16777)、SOCS3兔抗人多克隆抗體(PA5-87485)、Beclin-1兔抗人多克隆抗體(PA5-96649)、微管相關(guān)蛋白輕鏈3Ⅱ/Ⅰ(microtubule-associated protein light chain 3 Ⅱ/Ⅰ，LC3Ⅱ/Ⅰ)兔抗人多克隆抗體(PA5-109226)、核孔蛋白(nucleoporin 62，p62)兔抗人多克隆抗體(PA5-27247)、JAK1兔抗人多克隆抗體(PA5-105265)、JAK1磷酸化(p-JAK1)兔抗人多克隆抗體(44-4222G)、STAT3兔抗人多克隆抗體(710077)、STAT3磷酸化(p-STAT3)兔抗人多克隆抗體(44380G)、山羊抗兔IgG(H+L)二級抗體(A32731)購自美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.1.2 實驗儀器 二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱(BBD6220)購自美國Thermo Fisher Scientific公司；低氧工作站(DY-S)購自黑龍江邁沃德工貿(mào)有限公司；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)儀(T100)購自美國Bio-Rad公司；酶標(biāo)儀(ST-360)購自上?？迫A生物工程股份有限公司；倒置顯微鏡購自(MA100N)購自日本Nikon；流式細(xì)胞儀(ZS-AE7S)購自中生(蘇州)醫(yī)療科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 心肌細(xì)胞培養(yǎng) 將H9c2心肌細(xì)胞用含10%胎牛血清(v/v)、1%雙抗(v/v)、89%高糖DMEM培養(yǎng)基(v/v)的培養(yǎng)瓶培養(yǎng)，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱，每日更換1次新鮮培養(yǎng)液。細(xì)胞融合度>80%時進(jìn)行傳代并保種，胰酶消化收集3～5代細(xì)胞用于后續(xù)實驗。

1.2.2 miR-19a mimics轉(zhuǎn)染 將處于對數(shù)期生長的H9c2心肌細(xì)胞接種于6孔板(5×105個/孔)，待細(xì)胞完全貼壁后，隨機(jī)分為3組：H/R組、H/R-miR-19a mimics組和H/R-miR-19a陰性對照(NC)組。H/R-miR-19a模擬(mimics)組、H/R-miR-19a NC組分別使用無血清的培養(yǎng)基稀釋miR-19a mimics儲存液、miR-19a NC儲存液及LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染液處理6 h，更換新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞24 h，H/R組不進(jìn)行轉(zhuǎn)染處理，收集各組細(xì)胞用于后續(xù)實驗。

1.2.3 H/R模型建立 按1.2.2步驟收集的各組細(xì)胞參照文獻(xiàn)[6]，換用等量低糖無血清DMEM培養(yǎng)基(已用CO2和N2充分飽和3 h)，孵育2 h(37 ℃)，置于低氧培養(yǎng)箱(37 ℃、1%O2、5%CO2、94%N2)中培養(yǎng)10 h，胰酶消化處理，收集各組細(xì)胞，加入含有10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基，置于常氧培養(yǎng)箱(37 ℃、95%空氣、5%CO2)中復(fù)氧2 h。另按1.2.1收集的細(xì)胞，接種于6孔板上(5×105個/孔)，常規(guī)培養(yǎng)，設(shè)置為Control組。收集各組細(xì)胞用于后續(xù)實驗。

1.2.4 實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-qPCR) 使用Trizol試劑盒分別提取按1.2.3步驟收集的各組H9c2心肌細(xì)胞總RNA，取1 μg總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄、PCR擴(kuò)增反應(yīng)。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)處理1 min，95 ℃ 15 s，70 ℃ 30 s，擴(kuò)增40個循環(huán)。以U6為內(nèi)參，應(yīng)用2-△△Ct法計算miR-19a基因相對表達(dá)量。miR-19a及U6引物由上海生工生物工程有限公司設(shè)計合成，引物序列見表1。

表1 miR-19a和參考U6引物序列(5′-3′)

1.2.5 CCK-8實驗 將1.2.3收集的各組細(xì)胞分別重懸，接種于96孔細(xì)胞板(4.5×104個/孔)上，每組設(shè)置6個復(fù)孔，待細(xì)胞完全貼壁后，每孔添加100 μL CCK-8，避光孵育2.5 h，酶標(biāo)儀檢測450 nm波長下各孔OD值，計算各組細(xì)胞生存率，取平均值。細(xì)胞生存率(%)=各實驗組OD值/各空白Control組OD值×100%。

1.2.6 Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡 胰酶(不含EDTA)消化收集1.2.3各組細(xì)胞，磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗滌2次，離心(1 000 r/min，5 min)，Binding Buffer重懸(500 μL)，依次添加10 μL Annexin V-FITC和PI，充分混勻，常溫避光靜置15 min，流式細(xì)胞儀檢測凋亡率。凋亡率(%)=凋亡早期細(xì)胞比例+凋亡晚期細(xì)胞比例。

1.2.7 蛋白免疫印跡法 收集1.2.3各組細(xì)胞，PBS清洗3次，每孔加入200 μL預(yù)冷的RIPA裂解液，提取各組總蛋白。加入等量蛋白樣品電泳，轉(zhuǎn)膜，PBS清洗，在37 ℃下用5%脫脂牛奶封閉4 h，加入一抗LC3Ⅱ/Ⅰ(1∶500)、p62、Beclin-1、SOCS3、JAK1、p-JAK1、STAT3、p-STAT3(1∶1 000)、GAPDH(1∶2 000)，搖床孵化過夜，洗膜，添加二抗(1∶10 000)，室溫孵化2 h，洗膜，根據(jù)ECL說明書進(jìn)行顯色曝光，凝膠成像儀成像。分析目標(biāo)蛋白與GAPDH內(nèi)參條帶比值。

2 結(jié) 果

2.1 各組H9c2心肌細(xì)胞中miR-19a表達(dá)比較 與Control組比較，H/R組H9c2心肌細(xì)胞miR-19a表達(dá)水平降低(P<0.05)；與H/R組和H/R-miR-19a NC組比較，H/R-miR-19a mimics組H9c2心肌細(xì)胞miR-19a表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。詳見表2。

表2 各組H9c2心肌細(xì)胞中miR-19a表達(dá)比較(±s，n=6)

2.2 miR-19a mimics轉(zhuǎn)染對H/R誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞存活率的影響 與Control組比較，H/R組H9c2心肌細(xì)胞存活率降低(P<0.05)；與H/R組和H/R-miR-19a NC組比較，H/R-miR-19a mimics組H9c2心肌細(xì)胞存活率升高(P<0.05)。詳見表3。

表3 miR-19a mimics轉(zhuǎn)染對H/R誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞存活率的影響(±s，n=6) 單位：%

2.3 miR-19a mimics轉(zhuǎn)染對H/R誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞凋亡的影響 與Control組相比，H/R組H9c2心肌細(xì)胞凋亡率升高(P<0.05)；與H/R組和H/R-miR-19a NC組比較，H/R-miR-19a mimics組H9c2心肌細(xì)胞凋亡率降低(P<0.05)。詳見圖1、表4。

圖1 miR-19a mimics轉(zhuǎn)染對H/R誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞凋亡的影響

表4 miR-19a mimics轉(zhuǎn)染對H/R誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞凋亡的影響(±s，n=6) 單位：%

2.4 miR-19a mimics轉(zhuǎn)染對各組H9c2心肌細(xì)胞自噬標(biāo)記物L(fēng)C3Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1、p62表達(dá)的影響 與Control組比較，H/R組H9c2心肌細(xì)胞Beclin-1蛋白表達(dá)水平及LC3Ⅱ/Ⅰ升高(P<0.05)，p62蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05)；與H/R組和H/R-miR-19a NC組比較，H/R-miR-19a mimics組H9c2心肌細(xì)胞Beclin-1蛋白表達(dá)水平及LC3Ⅱ/Ⅰ降低(P<0.05)，p62蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)。詳見圖2、表5。

圖2 各組LC3Ⅱ、LC3Ⅰ、Beclin-1和p62蛋白表達(dá)條帶圖(A為Control組；B為H/R組；C為H/R-miR-19a NC組；D為H/R-miR-19a mimics組)

2.5 miR-19a mimics轉(zhuǎn)染對H9c2心肌細(xì)胞SOCS3、p-JAK1、p-STAT3表達(dá)的影響 與Control組比較，H/R組H9c2心肌細(xì)胞SOCS3蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)，p-JAK1、p-STAT3水平降低(P<0.05)；與H/R組和H/R-miR-19a NC組比較，H/R-miR-19a mimics組H9c2心肌細(xì)胞SOCS3蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05)，p-JAK1、p-STAT3水平升高(P<0.05)。詳見圖3、表6。

圖3 各組H9c2心肌細(xì)胞SOCS3、p-JAK1、p-STAT3蛋白表達(dá)條帶圖(A為Control組；B為H/R組；C為H/R-miR-19a NC組；D為H/R-miR-19a mimics組)

3 討 論

心肌I/R損傷是一種病理性疾病，特征是血液供給受限，恢復(fù)灌注并伴隨供氧，最終導(dǎo)致急性心肌梗死或心力衰竭[7]。近年來，治療心肌I/R損傷手段取得重要進(jìn)展，但療效需進(jìn)一步提高。有研究顯示，H/R誘導(dǎo)大鼠H9c2心肌細(xì)胞損傷模型可一定程度模擬I/R損傷，因此，本研究選擇大鼠H9c2心肌細(xì)胞作為體外研究對象[8]。心肌I/R損傷機(jī)制尚未明確，尋找治療心肌I/R損傷的有效靶點，是減少I/R損傷的突破口。

I/R損傷可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡，是導(dǎo)致I/R損傷病人生存率低的重要因素。微小RNA(microRNA，miRNA)是一類單鏈非編碼RNA，研究證實，其與心肌細(xì)胞增殖、凋亡等密切相關(guān)[9]。Mao等[10]研究顯示，上調(diào)miR-19a-3p表達(dá)水平可減輕心肌肥大。Liu等[11]研究顯示，miR-19a-3p具有抑制心臟肥大和心力衰竭的能力。本研究首先構(gòu)建了miR-19a過表達(dá)體系，之后建立H/R損傷模型，與Control組比較，H/R組H9c2心肌細(xì)胞miR-19a表達(dá)水平、存活率降低，凋亡率升高，提示H/R可誘導(dǎo)損傷H9c2心肌細(xì)胞，I/R損傷模型構(gòu)建成功，推測miR-19a與H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞的增殖、凋亡相關(guān)。Gao等[12]研究顯示，miR-19a模擬物可增強心肌細(xì)胞增殖，減輕心肌梗死引起的心臟損害。本研究結(jié)果顯示，與H/R組和H/R-miR-19a NC組比較，H/R-miR-19a mimics組H9c2心肌細(xì)胞miR-19a表達(dá)水平、細(xì)胞存活率升高，凋亡率降低，提示過表達(dá)miR-19a可抑制H/R誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞死亡及凋亡，推測miR-19a可能成為治療I/R損傷的潛在靶標(biāo)。

自噬是細(xì)胞受外界刺激以維持穩(wěn)態(tài)的動態(tài)過程。I/R過程中，心肌細(xì)胞自噬發(fā)揮著損傷作用。Beclin-1是細(xì)胞自噬過程的必需蛋白質(zhì)，可促進(jìn)自噬體形成[13]。LC3Ⅱ與溶酶體膜結(jié)合誘導(dǎo)細(xì)胞自噬，可作為自噬小體標(biāo)記物之一，p62可用于測定自噬通量，其表達(dá)水平與自噬活性成反比[14]。本研究結(jié)果顯示，與Control組比較，H/R組H9c2心肌細(xì)胞Beclin-1蛋白表達(dá)水平及LC3Ⅱ/Ⅰ升高，p62蛋白表達(dá)水平降低，提示H/R誘導(dǎo)增強了心肌細(xì)胞自噬；與H/R組和H/R-miR-19a NC組比較，H/R-miR-19a mimics組H9c2心肌細(xì)胞Beclin-1蛋白表達(dá)水平及LC3Ⅱ/Ⅰ降低，p62蛋白表達(dá)水平升高，提示miR-19a過表達(dá)可減輕H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞自噬，推測miR-19a可能通過抑制H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞自噬，發(fā)揮心肌保護(hù)作用。

Li等[15]研究顯示，miR-19a在系統(tǒng)性幼年關(guān)節(jié)炎病人中低表達(dá)，且能激活SOCS3/JAK/STAT信號通路。本研究結(jié)果顯示，與H/R組和H/R-miR-19a NC組比較，H/R-miR-19a mimics組H9c2心肌細(xì)胞SOCS3蛋白表達(dá)水平降低，p-JAK1及p-STAT3水平升高，提示過表達(dá)miR-19a可抑制SOCS3表達(dá)，促進(jìn)p-JAK1及p-STAT3表達(dá)。Liu等[4]研究顯示，抑制/促進(jìn)SOCS3表達(dá)，可抑制肝癌細(xì)胞/促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞自噬的形成。因此推測，過表達(dá)miR-19a可能通過抑制SOCS3表達(dá)，促進(jìn)p-JAK1/p-STAT3水平，抑制H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞自噬。

綜上所述，過表達(dá)miR-19a可能通過抑制SOCS3表達(dá)，激活JAK1/STAT3信號通路，抑制H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞自噬，從而減輕H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷，為臨床制定治療I/R心肌損傷的新策略提供了參考。臨床導(dǎo)致I/R心肌損傷的因素復(fù)雜且具有不可控性，僅憑體外模擬實驗證據(jù)尚不充分，今后將聯(lián)合體內(nèi)小鼠模型和臨床試驗，深入探討miR-19a對I/R心肌損傷的影響及作用機(jī)制。