李青松

（四川省綿陽市經(jīng)濟技術(shù)開發(fā)區(qū)動物疫病預防控制中心，四川 綿陽 621000）

弓形蟲?。═oxoplasmosis）又稱弓漿蟲病或弓形體病，是一種全球性分布的寄生性人獸共患原蟲?。?］。引起該病的剛地弓形蟲（Toxoplasma gondii）屬于球蟲目弓形蟲科弓形蟲屬。動物感染弓形蟲后多表現(xiàn)為高熱、呼吸及神經(jīng)系統(tǒng)癥狀、流產(chǎn)、死胎等。奶牛感染弓形蟲后病程多呈急性經(jīng)過，表現(xiàn)出發(fā)熱，乳房炎，體表淋巴結(jié)腫大，共濟失調(diào)和感覺過敏等精神癥狀，嚴重者可導致死亡。部分奶牛呈隱性感染，沒有明顯癥狀。對死于弓形蟲病的奶牛進行剖檢，發(fā)現(xiàn)血液凝固不全，稀薄如水，頭頸部皮膚發(fā)生水腫；心臟出現(xiàn)心肌炎病變；各處淋巴結(jié)出現(xiàn)不同程度的腫大，尤以肺門淋巴結(jié)和腸系膜淋巴結(jié)最明顯；氣管黏膜有出血點；肺臟出現(xiàn)淤血呈絳紫色，切面流出泡沫樣液體；腎臟和肝臟表面出現(xiàn)壞死；皺胃黏膜出血、壞死，呈灰黑色，容易剝落；腸道重度充血，腸黏膜上有壞死灶，腸腔內(nèi)出現(xiàn)大量滲出物。

目前，檢測弓形蟲病的血清學方法主要是酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）。該方法主要利用弓形蟲特異性抗原來測定宿主體內(nèi)相應(yīng)的抗體（IgA、IgM、IgG 和IgE）［2］。而間接酶聯(lián)免疫吸附法因檢測IgG抗體方便快捷、血樣用量少、結(jié)果較準確等優(yōu)點而成為目前臨床上檢測弓形蟲病應(yīng)用最廣泛的方法［3］。本試驗采集了綿陽和資陽兩個規(guī)模化奶牛場奶牛的血液樣本，通過間接ELISA 方法檢測血清中弓形蟲的IgG 抗體，以此了解兩場奶牛弓形蟲的感染情況，為弓形蟲病防控提供可靠的科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 IDEXX 弓形蟲抗體檢測試劑盒（Toxoplasma gondii Antibody Test Kit）購自愛德士元亨生物科技（北京）有限公司。

1.2 樣品采集 2019 年8 月從四川省資陽市某規(guī)?；膛霾杉膛Ｑ簶颖?71 份，2020 年5月從綿陽市某規(guī)?；膛霾杉膛Ｑ簶颖?07 份。每頭奶牛無菌頸靜脈采血5 mL，血液樣本在室溫靜置30 min 后以3 000 r/min 離心5 min獲得血清，將上層血清用移液槍分裝至潔凈的離心管內(nèi)，經(jīng)過統(tǒng)一標記后置于－20 ℃冰箱中保存待檢。

1.3 ELISA 檢測 根據(jù)IDEXX 弓形蟲抗體檢測試劑盒說明書操作，觀察并記錄產(chǎn)生顏色變化的反應(yīng)孔，在450 nm處檢測反應(yīng)孔中樣品的吸光度值并記錄。用愛德士元亨生物科技（北京）有限公司提供的數(shù)據(jù)分析軟件（xChek）處理數(shù)據(jù)，根據(jù)試劑盒說明書的計算方法計算結(jié)果，并以結(jié)果判定標準為依據(jù)進行結(jié)果判定。

1.4 復檢 經(jīng)判定后，將結(jié)果為可疑的血清樣品重復上述ELISA步驟再次檢測。

1.5 數(shù)據(jù)分析 應(yīng)用SPSS 22.0 軟件，采用卡方檢驗對試驗數(shù)據(jù)進行生物學統(tǒng)計分析，P＜0.05表示差異顯著，P＞0.05表示差異不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 血液樣本數(shù)量 本試驗共采集資陽市某規(guī)?；膛?71 份血液樣本，其中7 份血液樣本在運輸過程中發(fā)生明顯溶血，3 份血液樣本體積過少，故待檢測血清樣本僅161份；共采集綿陽市某規(guī)?；膛?07 份血液樣本，其中3 份血液樣本在運輸過程中發(fā)生明顯溶血，2 份血液樣本體積過少，故待檢測血清樣本只有202 份。兩個規(guī)模化奶牛場的血液樣本共計363份。

2.2 資陽市奶牛場弓形蟲病血清學檢測結(jié)果 經(jīng)過初次檢測，呈弱陽性的血清樣本有10 份，呈陰性的血清樣本有142 份，另有9 份血清的檢測結(jié)果可疑?？梢蓸悠方?jīng)重復檢測后，其中2份檢測結(jié)果轉(zhuǎn)為弱陽性，4 份為陰性，剩余3 份仍為可疑。故該養(yǎng)殖場檢測結(jié)果顯示呈弱陽性的血清樣品有12份，陽性率為7.45%（12/161），呈陰性的血清樣本有146 份，陰性率為90.68%（146/161）。結(jié)果詳見表1。

表1 資陽市奶牛場弓形蟲病血清學檢測結(jié)果

2.3 綿陽市奶牛場弓形蟲病血清學檢測結(jié)果 經(jīng)過初次檢測，血清樣本中呈弱陽性的有2 份，呈陰性的有192 份，另有8 份檢測結(jié)果可疑。將可疑樣品進行重復檢測，結(jié)果其中4 份轉(zhuǎn)為陰性，剩余4份仍為可疑。故該養(yǎng)殖場的檢測結(jié)果顯示呈弱陽性的血清樣品有2 份，陽性率為0.99%（2/202），呈陰性的血清樣品有196 份，陰性率為97.03%（196/202）。結(jié)果詳見表2。

表2 綿陽市奶牛場弓形蟲病血清學檢測結(jié)果

2.4 兩個奶牛場弓形蟲病血清學檢測結(jié)果統(tǒng)計分析 本試驗通過間接ELISA 檢測了四川省資陽市某規(guī)?；膛龅?61 份血清樣本和綿陽市某規(guī)?；膛龅?02 份血清樣本中的弓形蟲IgG 抗體，并利用卡方檢驗比較兩者陽性率是否存在顯著差異（表3）。從表3 可知，資陽養(yǎng)殖場的陽性率為7.45%（12/161），綿陽養(yǎng)殖場的陽性率為0.99%（2/202），兩場陽性率差異顯著（P＜0.05）。

表3 兩個奶牛場弓形蟲病血清學檢測結(jié)果比較

3 討論

3.1 兩個規(guī)?；B(yǎng)殖場奶牛弓形蟲病血清學結(jié)果分析 本次試驗共檢測奶牛血清樣本363 份，檢出14 份陽性血清，總陽性率為3.86%。其中，陽性率較高的是資陽奶牛場，為7.45%（10/161）。該結(jié)果高于2020 年葉勇剛等［4］對四川部分地區(qū)奶牛弓形蟲陽性率的調(diào)查結(jié)果（4.59%），同時也高于鄭州市（5.38%）［5］和遼寧省（6.0%）［6］的研究結(jié)果。分析造成這個結(jié)果的原因可能有以下幾方面：首先，該養(yǎng)殖場周圍可能存在患有弓形蟲病的流浪貓，作為弓形蟲終末宿主的流浪貓一旦進入養(yǎng)殖場，貓糞中排出的卵囊就會污染奶牛的飼料、飲水或食具等，而這些均可成為奶牛感染的重要來源［7］；其次，資陽地區(qū)氣候和地理條件更利于弓形蟲卵囊在外界長時間的存活，這與Sarvi［8］等報道的“溫暖多雨的埃及和阿富汗等國家牛弓形蟲的感染率遠遠高于伊朗”相似；最后，該場對弓形蟲病的防控措施不當，員工對奶牛弓形蟲感染的重視不足。雖然該場的弓形蟲陽性率較高，但是采樣時未發(fā)現(xiàn)有典型癥狀的奶牛，分析原因可能是感染奶牛為隱性感染，沒有明顯癥狀；其次血液樣品在冰箱中儲藏時間過久而導致假陽性結(jié)果等。

綿陽奶牛場陽性率為0.99%（2/202），不僅低于2020 年葉勇剛等［4］的研究結(jié)果，也低于廣西?。?.2%）和黑龍江?。?1.7%）［6］的研究結(jié)果。這可能得益于該奶牛場對弓形蟲的防治較為重視，實行了較為嚴格的弓形蟲病防治措施，如對疑似患病牛及時隔離，并嚴格消毒等。

本試驗中兩個奶牛場的陽性率差異顯著（P＜0.05），分析原因可能與奶牛場地理位置和飼養(yǎng)管理模式不同有關(guān)，而具體因素（如弓形蟲防治措施，養(yǎng)殖場是否有流浪貓出入，奶牛飼料和飲水來源，養(yǎng)殖密度，引種歷史等）仍待進一步研究。

3.2 ELISA 試驗可疑結(jié)果分析 本試驗共檢測奶牛血清樣本363份，初檢時有17份檢測結(jié)果可疑，經(jīng)復檢后，其中2 份轉(zhuǎn)為弱陽性，8 份轉(zhuǎn)為陰性，剩余7 份仍為可疑。造成復檢后可疑樣品結(jié)果改變的原因可能有以下幾方面：第一是樣品溶血，該ELISA法運用HRP標記IgG抗體，由于溶血時會釋放Hb，其具有的高過氧化物酶活性會產(chǎn)生非特異性顯色，同時發(fā)生溶血的血清顏色加深，也會致使測得的吸光度值增高，干擾結(jié)果的準確性；第二是細菌污染樣品，本試驗運用的酶標是HRP，該酶可能存在于污染樣品的細菌的菌體內(nèi)，從而導致非特異性顯色，干擾結(jié)果的準確性；第三是樣本保存不當，樣品若置于外界超過1 d，會導致血清中的抗體免疫活性減弱而呈現(xiàn)假陰性結(jié)果，樣品置于冰箱的時間過久，在采用間接ELISA 檢測時由于血清中IgG抗體聚合形成多聚體，容易導致假陽性；第四是初檢過程中部分操作不規(guī)范，如洗滌時洗滌液過少或過多，洗滌液未與反應(yīng)孔充分接觸而使孔壁洗滌不干凈，加樣時加樣速度過快而產(chǎn)生氣泡等［9-12］。復檢后仍有7 份樣品的結(jié)果為可疑，對此應(yīng)該前往該奶牛場再次采樣并檢測。檢測時需嚴格按照弓形蟲抗體檢測試劑盒的說明書操作，也可以采用其他血清學方法進行輔助檢測，以增加檢測的特異性和敏感性，使檢測結(jié)果更加可靠。

3.3 奶牛弓形蟲病防治建議

3.3.1 請專業(yè)人員對奶牛場工作人員進行弓形蟲病防治培訓，根據(jù)實際情況制定規(guī)范合理的弓形蟲防治方案并嚴格執(zhí)行。

3.3.2 定期隨機挑選不同圈舍的奶牛進行弓形蟲病檢測，一旦發(fā)現(xiàn)陽性奶牛，第一時間隔離治療，將陽性奶牛產(chǎn)生的排泄物及時處理，接觸物及時消毒，人員要做好個人防護，防止感染。同時，根據(jù)實際情況淘汰病牛，并對其他健康奶牛群進行藥物預防［13］。

3.3.3 定期打掃和消毒奶牛場，奶牛場內(nèi)的排泄物應(yīng)及時清理并進行無害化處理。可用55 ℃以上的熱水對已經(jīng)污染的地方消毒［14］；消毒劑種類也需要定期更換。

3.3.4 死于或疑似死于弓形蟲病的奶牛尸體，應(yīng)該燒毀或深埋。

3.3.5 堅持自繁自養(yǎng)，若要引種應(yīng)提前對引進的奶牛進行血清學或病原學檢測，嚴禁引進弓形蟲病陽性奶牛，防止感染場內(nèi)其他健康奶牛。

3.3.6 在養(yǎng)殖場及其周圍嚴禁養(yǎng)貓，并防止貓進入養(yǎng)殖場，嚴防奶牛的飼料和飲水接觸貓糞。

3.3.7 磺胺類藥物是治療奶牛弓形蟲病的首選藥，在發(fā)病初期及時用藥療效較好［15］。