肖 璐，鄔旭龍，王 印，江地科，張鵬飛，楊 蓉

（1.四川省畜牧科學(xué)研究院，動(dòng)物遺傳育種四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610066；2.成都農(nóng)業(yè)科技職業(yè)學(xué)院畜牧獸醫(yī)學(xué)院，寵物營養(yǎng)與健康研究中心，四川 成都 611130；3.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，四川 成都 611130；4.四川省夾江縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，四川 夾江 614100）

兔出血癥（RHD）又稱“兔瘟”，是由嵌杯病毒科（Caliciviridae）兔病毒屬（Lagovirus）的兔出血癥病毒（RHDV）感染后，引起家兔的一種急性、高傳染性、高致死性疫病［1］。RHDV 經(jīng)典毒株于1984年在我國江蘇首次報(bào)道［2］，2010年法國首次報(bào)道RHDV 的新型變異毒株［3］，將其命名為RHDV2，此后，多個(gè)國家相繼報(bào)道了RHDV2的傳播與流行。RHDV2與經(jīng)典毒株的不同之處在于：自然條件下RHDV2 能感染不同年齡階段的兔群，包括乳兔、幼兔及成年兔；感染范圍更廣，能感染家兔和野兔；此外，RHDV2 的致死率較經(jīng)典株稍低［4］，但其發(fā)病速度更快。

2020 年4 月，我國首次報(bào)道四川某兔場確診一起RHDV2 病例［5］，為我國養(yǎng)兔業(yè)敲響了警鐘。由于目前尚無有效的RHDV2 疫苗和治療措施，為了阻止疫情在國內(nèi)蔓延及波及鄰國養(yǎng)兔業(yè)安全，需及時(shí)篩查陽性病原，撲殺感染動(dòng)物，阻斷疫情傳播。本文概述了近年來國內(nèi)外RHDV2檢測方法和診斷技術(shù)的研究進(jìn)展，旨在為RHDV2 的早診、監(jiān)測和控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 病原學(xué)檢測技術(shù)

1.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 該技術(shù)通過在普通PCR 技術(shù)的基礎(chǔ)上加入熒光標(biāo)記探針或熒光染料實(shí)現(xiàn)核酸的定量檢測，與傳統(tǒng)PCR 技術(shù)相比，實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)更快速、靈敏，結(jié)果更加直觀且不用進(jìn)行凝膠電泳等繁瑣操作，更加便捷、準(zhǔn)確和安全，因此，該技術(shù)被廣泛地應(yīng)用于RHDV2 的監(jiān)測或者家兔恢復(fù)期RHDV2 的監(jiān)測。王波［6］根據(jù)RHDV2 VP60 基因序列，利用SYBR Green I 技術(shù)，建立了一種RHDV2 的SYBR Green I 熒光定量PCR 檢測方法，該方法特異、靈敏，經(jīng)換算，其最低檢測限度可達(dá)68 拷貝/μL。Duarte 等［7］也基于VP60 基因設(shè)計(jì)特異性引物和探針，建立了一種RHDV2 的Taqman 熒光定量PCR，該方法的重復(fù)性和重現(xiàn)性都較高，其組間變異系數(shù)低于2.4%，最低檢測限度可達(dá)9 拷貝/μL。Fitzner 等［8］利用Taqman 熒光定量PCR 成功在兔子肝臟中檢測到波蘭地區(qū)的首例RHDV2。Camacho等［9］利用該方法對采自西班牙南部96個(gè)地區(qū)的190份病死野兔樣品進(jìn)行了RHDV2檢測，結(jié)果其陽性檢出率達(dá)到了97.4%（185/190），表明RHDV2在西班牙地區(qū)傳播廣泛。

1.2 RT-PCR 普通RT-PCR 檢測方法的普適性更強(qiáng)，適用于多數(shù)實(shí)驗(yàn)室。楊澤曉等［10］根據(jù)RHDV 和RHDV2 VP60 基因中的保守片段設(shè)計(jì)特異性鑒別引物，建立了可區(qū)分RHDV和RHDV2的復(fù)合型RT-PCR，其對RHDV2的最低檢測限度達(dá)到230拷貝/μL。Harcourt 等［11］利用PCR 對195份采自英國地區(qū)的寵物兔肝臟進(jìn)行了RHDV 和RHDV2 檢測，結(jié)合病理學(xué)觀察結(jié)果，共計(jì)檢出188份陽性樣品，陽性率達(dá)96.4%（188/195），所有樣品均為單一感染，未發(fā)現(xiàn)RHDV 和RHDV2 的混合感染，其中RHDV2 的陽性率達(dá)到66.5%（125/188），高于經(jīng)典毒株的陽性率，可見RHDV2已取代經(jīng)典毒株成為英國寵物兔身上的新流行毒株。Hall 等［12］開發(fā)了一種可以鑒別診斷GI.1c（RHDV）、GI.2（RHDV2）、GI.1a-K5、GI.1a-Aus 4種不同基因型RHDV 的多重RT-PCR，該方法對RHDV2的最低檢測靈敏度可達(dá)10拷貝/μL。

1.3 其他病原學(xué)檢測技術(shù) Yang 等［13］基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP），選擇RHDV2 VP60 基因的保守序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，通過反應(yīng)條件優(yōu)化，建立了RHDV2 的RT-LAMP 檢測方法，該方法特異、靈敏、快速、成本低，可通過肉眼判讀檢測結(jié)果，其最低檢測限度可達(dá)到180 拷貝/μL，適用于RHDV2 的快速檢測。Miao 等［14］利用電子顯微鏡（EM），采用“點(diǎn)滴法”對純化的RHDV2 病毒樣顆粒進(jìn)行電鏡觀察，發(fā)現(xiàn)病毒是直徑約為30 nm 的球形顆粒，形態(tài)類似于RHDV，該方法可在其他方法得出可疑結(jié)果時(shí)作為RHDV2診斷的補(bǔ)充方法。最適合進(jìn)行RHDV2鑒定的電鏡方法是免疫電鏡技術(shù)（IEM），該方法可以用兔抗RHDV2 高免血清（兔或其他動(dòng)物）或單克隆抗體（MAb）與相應(yīng)抗原進(jìn)行檢測，能提升正確鑒定病毒粒子和病毒蛋白的準(zhǔn)確度。

2 血清學(xué)檢測技術(shù)

2.1 酶聯(lián)免疫吸附技術(shù) 酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)（ELISA）是一種可以檢測RHDV2 抗原或抗體的技術(shù)，也是實(shí)驗(yàn)室最常用的檢測技術(shù)，是國際貿(mào)易和OIE 所推薦的檢測方法。Baratelli 等［15］為了研究RHDV2滅活疫苗是否能有效地傳遞給免疫種兔的后代，通過競爭ELISA 和固相ELISA 檢測該病毒的抗體水平情況，結(jié)果顯示RHDV2 抗體在育種過程中可持續(xù)長達(dá)一年之久，其母源抗體可以持續(xù)28 d，由此分析獲知RHDV2可能主要是通過胎盤機(jī)制傳播。Dalton 等［16］使用RHDV2 特異性單克隆抗體進(jìn)行抗原捕捉和羊抗RHDV2制備，采用夾心ELISA 技術(shù)對兔肝臟中的抗原進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示該ELISA 靈敏度接近100%，能成功檢測RHDV2 和RHDV2 重組病毒體，與RHDV G1 病毒未產(chǎn)生交叉反應(yīng)，具有較好的重復(fù)性，最低檢測濃度為6 ng/mL。Strive 等［17］使用RHDV2特異性單克隆抗體與澳大利亞病毒（RHDV，RHDV2 和兩株不同的RHDVa）抗原相結(jié)合對競爭ELISA 進(jìn)行調(diào)整，RHDV2 的IgA 和IgM 同型實(shí)驗(yàn)比原來RHDV的滴度提高了4倍。孔德生［18］使用原核表達(dá)技術(shù)進(jìn)行RHDV2表達(dá)和單克隆抗體的制備，最后將純化的蛋白包被于酶標(biāo)板，然后進(jìn)行抗RHDV2 單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞篩選，篩選到4 株能夠識(shí)別RHDV2 的單抗株。ELISA可以在病毒感染早期進(jìn)行病原檢測，或?qū)笃谝呙缑庖吆蟮目贵w水平進(jìn)行監(jiān)測。

2.2 膠體金免疫層析技術(shù) 膠體金免疫層析技術(shù)（GICT）是以膠體金作為示蹤標(biāo)志物應(yīng)用于抗原抗體的一種新型免疫標(biāo)記技術(shù)，近年來已應(yīng)用于各種動(dòng)物疫病抗原和抗體的快速檢測，該方法操作簡單、快速、靈敏，且不需要其他昂貴儀器，可在10 min 內(nèi)完成檢測，非常適用于基層工作者和養(yǎng)殖場的全場普篩，目前該技術(shù)用于檢測RHDV 的較多。周麗軍［19］將RHDV VP60截段蛋白包被于金標(biāo)墊，用兔抗重組多克隆抗體標(biāo)記C線，以HRP羊抗兔IgG標(biāo)記T線，建立了RHDV的膠體金檢測方法，臨床樣品陽性檢出率為97.4%（150/154）。武玉香等［20］將VP60-2F4單克隆抗體包被于金標(biāo)墊，VP60-9D4 和羊抗鼠分別作為檢測線（T 線）和質(zhì)控線（C 線），進(jìn)行臨床樣品（100份）檢測，結(jié)果與紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)（HA）結(jié)果一致，并且與兔巴氏桿菌、大腸桿菌、兔球蟲、新城疫、豬瘟病毒等無交叉反應(yīng)。GICT技術(shù)不僅可以檢測血清，還可檢測抗原，其生產(chǎn)成本較低，檢測時(shí)間較短，在未來開發(fā)RHDV2 檢測技術(shù)時(shí)可將該方法作為備用方法之一。

2.3 免疫印跡技術(shù) 免疫印跡技術(shù)（WB）是在SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳和免疫測定技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新型免疫生化技術(shù)，在HA、ELISA 等試驗(yàn)出現(xiàn)可疑結(jié)果或懷疑樣品中有RHDV2 存在時(shí)，可利用該技術(shù)進(jìn)行最終診斷。Kong 等［21］利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行RHDV2 VP60 的表達(dá)與純化，以單克隆抗體作為一抗，HRP 羊抗鼠作為二抗進(jìn)行WB 驗(yàn)證，結(jié)果顯示有兩種單克隆抗體可以與RHDV2 VP60 反應(yīng)，但這兩種單抗是否能夠用于臨床樣品檢測還需驗(yàn)證。Qi等［22］利用pFastBac 雙重表達(dá)載體，分別表達(dá)了經(jīng)典RHDV 和RHDV2 的VP60 基因。通過IFA 和蛋白免疫印跡分析，發(fā)現(xiàn)重組VP60 蛋白在感染SF9 細(xì)胞中能夠有效表達(dá)，且在72 h 時(shí)重組蛋白的表達(dá)水平最高，96 h 之后開始下降。WB 技術(shù)一般用于驗(yàn)證目的蛋白產(chǎn)生抗體是否具有反應(yīng)原性，在蛋白表達(dá)及純化中我們都加入相應(yīng)蛋白標(biāo)簽，最后通過檢測標(biāo)簽判定是否是目的蛋白。該技術(shù)常與IFA 技術(shù)結(jié)合，通過熒光增強(qiáng)效應(yīng)和底物顯色來確定目的蛋白所產(chǎn)生的抗體。

3 討論與結(jié)論

養(yǎng)兔業(yè)是我國畜牧業(yè)的重要組成部分，四川是全國最大的養(yǎng)兔大省，2019年兔出欄量占到了全國的39.66%，養(yǎng)兔業(yè)是全省畜牧業(yè)發(fā)展的重要支柱產(chǎn)業(yè)之一，在養(yǎng)殖業(yè)中具有不可替代的地位。RHDV2 作為一種新型兔瘟病毒，在國內(nèi)于2020 年4 月首發(fā)于四川省金堂縣，導(dǎo)致感染場死亡率達(dá)60%以上，與RHDV 相比，RHDV2 的傳播速度更快、傳染性更強(qiáng)、感染宿主范圍更廣，且RHDV 經(jīng)典株的疫苗對RHDV2 幾乎沒有防控作用，給養(yǎng)兔業(yè)帶來了極大的威脅。當(dāng)前，四川已有多起該病毒存在的報(bào)道，似有擴(kuò)散的趨勢和風(fēng)險(xiǎn)，且當(dāng)前仍無針對性疫苗進(jìn)行有效防控。為避免RHDV2 的傳播，迫切需要快速、準(zhǔn)確、高效的檢測手段。病毒分離是檢測RHDV2 的金標(biāo)準(zhǔn)，但分離病毒耗時(shí)較長，難度較大，且該病毒在體外尚無穩(wěn)定的細(xì)胞材料，導(dǎo)致該方法不適用于疾病快速檢測，在此基礎(chǔ)上核酸檢測技術(shù)迅速崛起，類似于RT-PCR、RT-qPCR 等技術(shù)，可以對多種混合感染的病原進(jìn)行檢測，樣品可以是唾液、組織或血液等。

目前暫無RHDV2 疫苗進(jìn)行有效防控，無需進(jìn)行疫苗毒和野毒區(qū)分，只需進(jìn)行抗體檢測就能判定兔群是否感染RHDV2，其中類似膠體金技術(shù)可供基層工作者使用，能快速確定病原，及時(shí)清除病原，切斷傳播途徑，防止疫情擴(kuò)散。ELISA技術(shù)在前期可對大量樣品進(jìn)行檢測，后續(xù)疫苗上市后可對兔群的抗體水平進(jìn)行監(jiān)測。RT-PCR技術(shù)可以先進(jìn)行RHDV2 的檢測，確定樣品為陽性后再通過全基因組測序、基因比對、進(jìn)化樹分析等技術(shù)確定毒株的基因型和溯源，為接下來的防控做準(zhǔn)備。