林燕玲，蔡雨晨，李利君,2*，倪輝,2

（1.集美大學海洋食品與生物工程學院，福建廈門 361021）

（2.福建省食品微生物與酶工程重點實驗室，廈門市食品生物工程技術(shù)研究中心，福建廈門 361021）

木聚糖1,4-β-木糖苷酶（xylan 1,4-β-xylosidae，EC 3.2.1.37）屬于木聚糖酶系[1]，是一種糖苷水解酶[2]，具有外切性質(zhì)[3]。大多數(shù)的木聚糖1,4-β-木糖苷酶存在于真菌中，也有部分存在于細菌中[4]，極少存在于酵母菌中[5]。因其可以作用于低聚木糖的非還原端釋放木糖[6]，不僅在造紙工業(yè)、醫(yī)藥領域應用廣泛[7]，在食品技術(shù)中有很大的應用潛能，如利用木聚糖1,4-β-木糖苷酶水解低聚木糖的性質(zhì)制備天然食品甜味劑木寡糖；在啤酒釀造中代替乳化劑、氧化劑，降低啤酒的黏度與濁度；水解小麥、玉米等谷物中的半纖維素，促進營養(yǎng)的消化吸收等[4]。

目前木聚糖1,4-β-木糖苷酶的研究集中在篩選、純化、表征和克隆表達上，缺乏對結(jié)構(gòu)的系統(tǒng)研究。對木聚糖1,4-β-木糖苷酶的結(jié)構(gòu)進行系統(tǒng)的分類研究，有助于今后研究其結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系，進一步拓展其在食品等領域的應用。多序列比對（Multiple sequence alignment）[8]是將三個及三個以上的生物學序列進行比對，比對結(jié)果作為探究序列同源性的依據(jù)，揭示序列保守性，與此同時多重序列比對在構(gòu)建系統(tǒng)進化樹、預測蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)以及三級結(jié)構(gòu)、確定未知序列家族等方面也有廣泛應用。系統(tǒng)進化樹[9]是研究生物進化過程的基本框架，三維結(jié)構(gòu)疊合可以反映蛋白質(zhì)立體結(jié)構(gòu)差異。分子對接可以預測兩個或兩個以上已知結(jié)構(gòu)結(jié)合方式的計算機算法，廣泛應用與分子識別研究[10]。本研究利用生物信息學方法，分析木聚糖1,4-β-木糖苷酶的基因序列，對基因序列進行多重序列比對，構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，同時預測其理化性質(zhì)，并對該酶的三維結(jié)構(gòu)進行建模、結(jié)構(gòu)疊合與分子對接，進而分析木聚糖1,4-β-木糖苷酶分子進化規(guī)律以及結(jié)構(gòu)差異，為木聚糖1,4-β-木糖苷酶功能的進一步研究提供生物信息學參考。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)獲取

國際生物技術(shù)信息中心NCBI（http://www.ncbi. nlm. nih.gov/）。

1.2 實驗方法

登錄NCBI網(wǎng)站，在搜索欄中輸入關(guān)鍵詞“xylan 1,4-β-xylosidase”，收集所有木聚糖1,4-β-木糖苷酶的基因序列、氨基酸序列以及相關(guān)信息，以fasta格式保存。利用MEGA X 10.1.8[11]軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹進入ClustalW 2.0[12]軟件，設置Gap opening penalty為10.00，Gap extension penalty為0.20，Delay divergent sequence為30%，其他參數(shù)默認，對蛋白質(zhì)序列進行多重序列比對，序列比對結(jié)果用 Espript 3[13]（http://espript. ibcp.fr/ESPript/ESPript/）與WebLogo[14]（http://weblogo.berkeley.edu/logo.cgi）在線工具進行顯示。通過ExPASy-ProtParam（https://web.expasy.org/ protparam）、ExPASy-ProtScale[15]（https://web.expasy. org/protscale/）在線分析工具分析氨基酸序列的理化性質(zhì)、疏水性，采用TMHMM 2.0（http://www.cbs.dtu.dk/ services/TMHMM/）、PSIPRED[16]（http://bioinf.cs.ucl.ac. uk/psipred/）、Signal P 5.0[17]（http://www.cbs.dtu.dk/ services/SignalP-5.0/）在線分析工具尋找蛋白質(zhì)跨膜區(qū)域以及跨膜區(qū)域位置、分析信號肽。蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)建模采用了兩種方法，第一種為同源建模法，Modeller 9.24[18]軟件，穿針引線法選用了Phyre2.0[19]（http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/～phyre2/html/page.cgi?id=index）在線服務器進行建模。建模結(jié)構(gòu)用SAVES 5.0（https://servicesn.mbi.ucla.edu/SAVES/）進行模型質(zhì)量評估。使用UCSF Chimera[20]1.14軟件進行結(jié)構(gòu)疊合，分析結(jié)構(gòu)差異。利用Autodock Vina[21]工具進行分子對接，結(jié)合Proteins Plus（https://proteins.plus/）計算結(jié)合口袋大小，探討結(jié)構(gòu)進化規(guī)律。

2 結(jié)果與分析

2.1 木聚糖1,4-β-木糖苷酶基因序列系統(tǒng)進化樹構(gòu)建以及代表序列篩選

利用NCBI網(wǎng)站收集木聚糖1,4-β-木糖苷酶的基因序列，除去不完整序列，共獲得來自GH3、GH39、GH43家族的72條完整序列。72條序列來源廣泛，包括原核生物鏈霉菌、單胞菌，真核生物曲霉、酵母菌、鐮刀菌，以及真核動、植物。將獲得的72條序列進行多序列比對構(gòu)建系統(tǒng)進化樹（圖1）。從進化樹的結(jié)果來看，木聚糖1,4-β-木糖苷酶可分成兩大類。第一類含有38條序列，進一步分為三小類，編號為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，第一小類包括8條真菌來源序列，第二小類包括10條細菌與真菌來源序列，第三小類包括20條真菌來源與真核動物來源序列。剩余序列構(gòu)成第二類，同樣分為三小類，編號為Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ。第四小類的12條序列都源于細菌，第五小類僅有1條細菌來源與3條真核動物來源的序列，第六類則全為細菌來源。

圖1的進化分類結(jié)果表明木聚糖1,4-β-木糖苷酶的進化進程不僅存在細菌與細菌、真菌與真菌之間的基因轉(zhuǎn)移，同時也存在細菌與真菌之間、細菌與真核動物、真菌與真核動物之間的基因轉(zhuǎn)移。分支代表進化譜系隨時間的變化，分支長度越長，代表序列的變化越大，進化樹中細菌來源的序列分支長度較短，而真菌以及真核生物來源的序列分支長度相對長，說明在木聚糖1,4-β-木糖苷酶進化過程中，真菌來源與真核動物來源更易發(fā)生變化，這可能與原核生物與真核生物細胞以及基因組之間的差異有關(guān)。以進化樹的聚類為樣本單位，按照分層抽樣的原則，從進化樹中挑選12條木聚糖1,4-β-木糖苷酶代表性序列（表1），進行進一步的結(jié)構(gòu)分類研究。

表1 12條代表性序列對應的蛋白登錄號 Table 1 Protein accession numbers of the 12 representative sequences

2.2 木聚糖1,4-β-木糖苷酶氨基酸序列分析

2.2.1 序列保守位點分析

利用ClustalW 2.0軟件對12條代表性氨基酸序列進行多重序列比對，構(gòu)建保守序列譜[22]，用Espript 3在線工具顯示12條序列的保守位點（圖2）。木聚糖1,4-β-木糖苷酶存在15個較保守位點，位于以BV401_RS11760為基準的25、66、81、87、102、125、174、294、310、311、355、387、400、433、452號位點。雖然保守位點分布分散，但在進化過程中的保守性相對較好，推測可能是與酶的結(jié)構(gòu)或功能密切相關(guān)的氨基酸位點。沒有發(fā)現(xiàn)超保守位點，說明已選擇的木聚糖1,4-β-木糖苷酶代表性序列進化過程相對獨立，可以從中總結(jié)其進化及結(jié)構(gòu)規(guī)律。

圖2 12條木聚糖1,4-β-木糖苷酶代表性序列保守位點 Fig.2 12 Representative sequence conserved sites of xylan 1,4-β-xylosidase

2.2.2 氨基酸序列系統(tǒng)進化樹分析

利用MEGA X軟件，對12條代表性序列的氨基酸序列進行系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建。氨基酸序列系統(tǒng)進化樹的分析結(jié)果（圖3）將12條代表性序列分成三個大類，GTNG_RS09260、BXA11_RS32660、BV401_RS11760、LK06_RS05470為第一類，屬于GH39家族，GH3家族的LOC112950837、MgXBX3、LY89DRAFT_679094為第二類，F(xiàn)OXG_09848、FOXG_02672、SPSK_01007、MgXBX4、A1O5_02121為第三類，屬于GH43家族。系統(tǒng)進化樹的分類與其家族相對應，且與基因序列進化的分類具有一致性，表示木聚糖1,4-β-木糖苷酶的序列的家族劃分是以序列相似性為基礎。利用Signal P 5.0預測氨基酸序列的信號肽（表2），發(fā)現(xiàn)只有LY89DRAFT_679094、MgXBX3、FOXG_09848、FOXG_02672四條序列存在信號肽，均勻的分布在GH3家族與GH43家族的聚類上，說明木聚糖1,4-β-木糖苷酶在進化過程中分出了胞外酶與胞內(nèi)酶，但信號肽的有無并不能體現(xiàn)其結(jié)構(gòu)進化規(guī)律。

圖3 12條氨基酸序列系統(tǒng)進化樹 Fig.3 Phylogenetic tree of 12 amino acid sequences

表2 信號肽預測結(jié)果 Table 2 Signal peptide prediction results

2.2.3 氨基酸序列理化性質(zhì)分析

用ExPASy-ProtParam在線工具對12條代表性氨基酸序列進行理化性質(zhì)的預測[23]，結(jié)果如表3所示。代表序列的氨基酸數(shù)在324～829之間，分子質(zhì)量（Mr）最大為89769.18，最小為36301.39，相差較大。除了LOC112950837、BV401_RS11760的預測等電點分別為7.95、8.81，大于7.40為偏堿性蛋白質(zhì)外，其余的都為酸性蛋白質(zhì)。LOC112950837源于無尾線蟲，而BV401_RS11760源于自溶鏈霉菌，對應物種都能較好的適應偏堿性的環(huán)境，符合酶的特征與環(huán)境相互適應的關(guān)系。比較負電荷殘基總數(shù)（Asp+Glu）與正電荷殘基總數(shù)（Arg+Lys）的數(shù)量，從整體上來看，幾乎所有的序列都帶負電荷較多，說明其大多為酸性蛋白，這一預測結(jié)果與等電點預測結(jié)果相符。序列的總原子數(shù)相差較大，極差為7514，脂肪系數(shù)的范圍為65.68～84.59，序列的總平均親水性為-0.04～-0.64，皆為負數(shù)，表現(xiàn)為親水性蛋白，易溶于水，這為木聚糖1,4-β-木糖苷酶表現(xiàn)出水解性質(zhì)提供基礎條件。

表3 12條代表性木聚糖1,4-β-木糖苷酶理化性質(zhì) Table 3 Physicochemical properties of 12 representative xylan 1,4-β-xylosidase

2.2.4 氨基酸序列疏水性分析

使用ExPASy-ProtScale在線工具對12條代表性氨基酸序列進行疏水性分析（圖4）。分析結(jié)果以0位基準，在0以下的峰為親水峰，以上的峰則為疏水峰，根據(jù)親水峰和疏水峰的數(shù)量比較來判斷蛋白質(zhì)的疏水性。木聚糖1,4-β-木糖苷酶12氨基酸序列疏水性表明，所有的氨基酸序列親水峰的數(shù)量都明顯多于疏水峰的數(shù)量，表現(xiàn)為親水性，與ExPASy-ProtParam對氨基酸序列疏水性的一致，進一步證明木聚糖1,4-β-木糖苷酶為親水性蛋白，說明在蛋白肽鏈折疊的過程中，親水性氨基酸更傾向于在蛋白外部，使蛋白具有可溶性。

圖4 BV401_RS11760疏水性預測圖 Fig.4 Prediction chart of BV_401RS 11760 hydrophobicity

表5 結(jié)構(gòu)分類表 Table 5 Structural classification

2.3 木聚糖1,4-β-木糖苷酶結(jié)構(gòu)分析

利用Modeller 9.24軟件以及Phyre2在線服務器對12條代表性氨基酸序列進行三維結(jié)構(gòu)建模，利用SAVES 5.0對建模結(jié)果進行Verify 3D得分計算，評估模型質(zhì)量。根據(jù)SAVES 5.0提供的Verify 3D得分，木聚糖1,4-β-木糖苷酶皆在80%以上（表4），說明模型質(zhì)量良好，可進行進一步的結(jié)構(gòu)分析。

表4 12條代表性氨基酸序列建模結(jié)果 Table 4 Results of modeling 12 representative amino acid sequences

借助Chimera 1.14軟件進行可視化以及結(jié)構(gòu)疊合，疊合結(jié)果顯示，依據(jù)木聚糖1,4-β-木糖苷酶的特征結(jié)構(gòu)，可分成三個大類。糖苷水解酶GH39家族的GTNG_RS09260、BXA11_RS32660、BV401_RS11760、LK06_RS05470四條序列組成第一類（圖5），此類結(jié)構(gòu)都擁有一個(α/β)8TIM折疊桶結(jié)構(gòu)；第二類（圖6）包含LOC112950837、MgXBX3、LY89DRAFT_679094三條序列，屬于GH3家族，由(α/β)8TIM折疊桶、(α/β)6三明治結(jié)構(gòu)、FnⅢ型β折疊片層三個結(jié)構(gòu)域共同組成，(α/β)8TIM折疊桶、(α/β)6三明治結(jié)構(gòu)形成了一個上方開口大，下方開口小的碗狀結(jié)構(gòu)；A1O5_02121、MgXBX4、FOXG_09848、FOXG_02672 和SPSK_01007五條GH43家族序列共同組成了第三類（圖7），這一類的木聚糖1,4-β-木糖苷酶都存在一個五葉的β折疊桶。此外，通過結(jié)構(gòu)疊合，發(fā)現(xiàn)C末端延伸的β折疊片層結(jié)構(gòu)可將第三類更為細致的劃分成兩個小類，A1O5_02121、MgXBX4為第一小類（圖8a），只包含五葉β折疊桶這一基本結(jié)構(gòu)，第二小類（圖8b）的FOXG_09848、FOXG_02672和SPSK_01007則在C末端連接一個β折疊片層，與Rohman等[24]對木糖苷酶的結(jié)構(gòu)分類結(jié)果一致，有文獻報道這種C端的β折疊片層對木聚糖1,4-β-木糖苷酶的催化活性至關(guān)重要[25]。這一分類與GH43家族氨基酸序列進化樹聚類相符，暗示C端延伸的β-折疊片層可以反映GH43家族木聚糖1,4-β-木糖苷酶的結(jié)構(gòu)規(guī)律。

圖5 木聚糖1,4-β-木糖苷酶第一大類疊合圖 Fig.5 Overlay of the first major class of xylan 1,4-β-xylosidase

圖6 木聚糖1,4-β-木糖苷酶第二大類疊合圖 Fig.6 Overlay of the second major class of xylan 1,4-β-xylosidase

圖7 木聚糖1,4-β-木糖苷酶第三大類疊合圖 Fig.7 Overlay of the third major class of xylan 1,4-β-xylosidase

圖8 木聚糖1,4-β-木糖苷酶第三大類的兩個小類疊合圖 Fig.8 Overlay of two subclasses of the third major class of xylan 1,4-β-xylosidases

目前已有的研究報道中，木聚糖1,4-β-木糖苷酶的底物譜較廣，不同家族的酶對應水解不同的底物。表6列舉了不同家族木聚糖1,4-β-木糖苷酶的酶學性質(zhì)，GH3家族的木聚糖1,4-β-木糖苷酶無法水解低聚木糖，但可以作用于天然糖苷類底物以及多種人工底物，如pNPX（對硝基苯基-β-D-吡喃木糖苷）、pNPA（對硝基苯基-α-L-阿拉伯呋喃苷）、pNPG（對硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷）；GH39家族木聚糖1,4-β-木糖苷酶表現(xiàn)出廣泛的底物特異性，不僅能水解天然糖苷類底物，對低聚木糖和多聚木糖同樣也有水解作用；GH43家族木聚糖1,4-β-木糖苷酶僅能水解人工底物pNPX、pNPG以及低聚木糖，需要內(nèi)切木糖苷酶的協(xié)同作用下才能水解多聚木糖。

表6 部分來源木聚糖1,4-β-木糖苷酶學性質(zhì)表 Table 6 List of enzymatic properties of xylan 1,4-β-xylosidase from some sources

以所有木聚糖1,4-β-木糖苷酶的共有底物pNPX為配體，與屬于不同分類的木聚糖1,4-β-木糖苷酶LOC112950837、BXA11_RS32660、A1O5_02121進行分子對接確定結(jié)合口袋位置，計算結(jié)合口袋大?。▓D9，表7）。計算結(jié)果顯示GH3家族的結(jié)合口袋寬且淺（圖9a），適合分子量大的天然糖苷類底物如人參皂苷等與之結(jié)合；此外GH3家族木聚糖1,4-β-木糖苷酶蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)與α-阿拉伯呋喃糖苷酶以及β-葡萄糖苷酶結(jié)構(gòu)相似度極高，可以水解pNPX、pNPA、pNPG，表現(xiàn)出三酶性質(zhì)[26]。GH39家族木聚糖1,4-β-木糖苷酶結(jié)合口袋大、開口開放（圖9b），這種大且開的口袋賦予了酶容納大分子量底物與木糖分支鏈的能力，水解底物囊括人工底物pNPX、天然糖苷、低聚木糖與多聚木糖，擁有寬廣的底物譜[27]。GH43家族木聚糖1,4-β-木糖苷酶的結(jié)合口袋相較于GH39家族木聚糖1,4-β-木糖苷酶顯得窄、深，僅能支持與只有2～7個木糖分子的低聚木糖結(jié)合（圖9c）。

圖9 不同分類木聚糖1,4-β-木糖苷酶結(jié)合口袋 Fig.9 Binding pockets of xylan 1,4-β-xylosidases from different classifications

表7 不同分類木聚糖1,4-β-木糖苷酶結(jié)合口袋 Table 7 Binding pockets of xylan 1,4-β-xylosidases from different classifications

綜上所述，木聚糖1,4-β-木糖苷酶的底物特異性與結(jié)構(gòu)中結(jié)合口袋的大小與位置呈現(xiàn)了一定的相關(guān)性，說明酶在進化過程中為了適應底物，可能會對結(jié)構(gòu)進行調(diào)整以獲得不同的底物結(jié)合口袋。木聚糖1,4-β-木糖苷酶的進化規(guī)律不僅體現(xiàn)在三級結(jié)構(gòu)上，水解底物的大小對其結(jié)構(gòu)進化也產(chǎn)生了一定程度的影響。

3 結(jié)語

本文利用NCBI數(shù)據(jù)庫，收集了木聚糖1,4-β-木糖苷酶的基因序列，成功構(gòu)建系統(tǒng)進化樹后，從中篩選了12條代表性序列，對其進行多重序列比對以及一級結(jié)構(gòu)、二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)建模等分析。多序列比對結(jié)果顯示木聚糖1,4-β-木糖苷酶的保守位點較少，進化過程并不保守，在長期進化的過程中這些位點能始終存在，說明其可能對于結(jié)構(gòu)或功能的意義很大。蛋白質(zhì)理化性質(zhì)以及疏水性預測性都表明了這12條代表性序列都是親水蛋白質(zhì)，信號肽預測結(jié)果提示木聚糖1,4-β-木糖苷酶分泌方式可分為胞內(nèi)分泌與胞外分泌；根據(jù)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)疊合的結(jié)果，可以將木聚糖1,4-β-木糖苷酶分成三個大類，第一大類共有一個(α/β)8折疊桶；第二大類的結(jié)構(gòu)較為復雜，由三個結(jié)構(gòu)域共同組成，從N端到C端依次是(α/β)8TIM折疊桶、(α/β)6三明治結(jié)構(gòu)、FnⅢ型β折疊片層；第三大類是一個五葉β折疊桶狀結(jié)構(gòu)，C端β折疊片層的有無將第三大類劃分成兩個小類，這三種結(jié)構(gòu)共同構(gòu)成了木聚糖1,4-β-木糖苷酶的代表性結(jié)構(gòu)。結(jié)構(gòu)分類結(jié)果與氨基酸序列進化樹分類結(jié)果一致，說明木聚糖1,4-β-木糖苷酶的進化規(guī)律可以體現(xiàn)在三級結(jié)構(gòu)上，每種類型的酶對應底物不同，說明底物大小能在一定程度上影響木聚糖1,4-β-木糖苷酶的進化。本文通過分析木聚糖1,4-β-木糖苷酶的12條代表性氨基酸序列，說明了木聚糖1,4-β-木糖苷酶的進化規(guī)律，并總結(jié)歸納其結(jié)構(gòu)特征，為木聚糖1,4-β-木糖苷酶的定向改造、酶結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系研究奠定生物信息學基礎。