姚 猛，鞠興榮，厲 珺，生凱凱

（南京財(cái)經(jīng)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院/江蘇省現(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210023）

糧食富含優(yōu)質(zhì)蛋白，而蛋白質(zhì)是維持人體機(jī)能的營養(yǎng)素之一，對(duì)人體生理功能十分重要。通常來講，人體攝入的蛋白質(zhì)絕大多數(shù)來源于動(dòng)物源蛋白，因其氨基酸成分與人類所需氨基酸類似，但過多地?cái)z入動(dòng)物源蛋白會(huì)增加骨質(zhì)疏松癥、高血壓、心臟病與腎結(jié)石等疾病的患病風(fēng)險(xiǎn)[1-4]。而大量詳實(shí)的研究[5-8]發(fā)現(xiàn)，植物源蛋白可以有效預(yù)防與緩解心臟病、糖尿病、高血壓以及腎臟疾病的癥狀。由此，優(yōu)先食用糧食源蛋白的話題引起了關(guān)注，也對(duì)當(dāng)代健康飲食的理念產(chǎn)生了一定的影響。但是值得注意的是，糧食源蛋白的生物活性成分在被人體吸收與代謝利用之前，必須經(jīng)過胃腸消化。然而，由于體內(nèi)消化的研究成本過高，而不適用于蛋白生物活性前期的探索，基于此，體外胃腸消化方式應(yīng)運(yùn)而生。

對(duì)此，國內(nèi)外糧油工作者樂此不疲地進(jìn)行體外模擬消化的研究，采用理化方式對(duì)其進(jìn)行預(yù)處理之后，再模擬體外消化對(duì)其進(jìn)行最終分解來獲得研究生物活性的成分。其中體外模擬消化方式是通過模擬人與動(dòng)物消化生理特點(diǎn)，采用與其體內(nèi)相近的消化環(huán)境和消化酶系，在體外評(píng)定蛋白消化吸收的一種方法。其優(yōu)點(diǎn)是試驗(yàn)條件可控制，干擾因素較少，結(jié)果的重現(xiàn)性較好，成本低且試驗(yàn)時(shí)間較短。目前常用的體外消化模型主要可以分為單室、多室模型，靜態(tài)、動(dòng)態(tài)模型，單酶作用、多酶體系等6種模型[9]，其方法主要分為單酶一步消化法、胃蛋白酶-腸液一步消化法、胃腸兩步消化法、單酶作用和多酶體系等5種[10]，見圖1，模型與方法相互交叉聯(lián)系，每種模型對(duì)應(yīng)多種方法，而每個(gè)方法又對(duì)應(yīng)著多個(gè)模型。另外它們優(yōu)缺點(diǎn)各異，針對(duì)應(yīng)用場景選用合適的模型方法是值得思考的問題。另外，單酶作用和多酶體系是模型與方法中最醒目的重復(fù)內(nèi)容，因其簡單操作且接近實(shí)際情況而廣泛被糧食科研者應(yīng)用在蛋白體外消化中。但是，除了在消化液的成分上有改善之外，目前所用裝置的內(nèi)部環(huán)境與人或動(dòng)物胃腸腔環(huán)境的差距仍然存在。并且由于模擬消化環(huán)境程度不一，其結(jié)果的準(zhǔn)確性與體內(nèi)試驗(yàn)仍存在一定的異同。國際上針對(duì)這些模型與方法，已研制了人體腸道微生物生態(tài)模擬系統(tǒng)（SHIME）、TNO腸道模型（TIM）及動(dòng)態(tài)胃腸道模擬器（SIMGI）等較為成熟、貼近人/動(dòng)物胃腸內(nèi)部環(huán)境的裝置[11-13]，但是成本高、操作復(fù)雜等缺點(diǎn)阻礙了其廣泛應(yīng)用。綜上所述，目前的任何一種模型或方法都不能夠適應(yīng)所有應(yīng)用場景，而針對(duì)不同蛋白，選取合適的模型方法，且再加以改進(jìn)內(nèi)部環(huán)境，成了研究者們的研究重點(diǎn)與難點(diǎn)。

圖1 體外模擬消化模型與方法

因此，為了解決此難點(diǎn)，文章聚焦于稻谷、小麥與大豆等具有代表性的糧食，從它們蛋白的理化性質(zhì)入手，重點(diǎn)分析與評(píng)價(jià)其蛋白體外模擬消化方式的優(yōu)缺點(diǎn)，指明其研究重心與改進(jìn)之處，并希望為該方向科研工作者提供借鑒性的幫助，同時(shí)為實(shí)現(xiàn)蛋白高值化利用作出貢獻(xiàn)。

1 稻米蛋白體外模擬消化的研究現(xiàn)狀

1.1 稻米蛋白理化性質(zhì)

稻米蛋白一種優(yōu)質(zhì)的糧食源蛋白，其氨基酸組成模式與WHO/FAO推薦模式相接近，易于被人體消化吸收。稻米蛋白主要是由清蛋白、球蛋白、醇溶性蛋白和谷蛋白4種蛋白組成。而其中75%～90%的成分為堿溶性谷蛋白，它是由許多大分子片段通過二硫鍵形成，彼此交聯(lián)聚集。Agboola[14]發(fā)現(xiàn)，在pH 4～7時(shí)，大米蛋白谷蛋白溶解性增長緩慢，而接近pH 9時(shí)，蛋白溶解性迅速增加。又因其第一限制性氨基酸賴氨酸含量高、蛋白生物價(jià)（BV）與蛋白質(zhì)利用率（PER）皆高于其他谷類蛋白，被公認(rèn)為谷類蛋白中的佼佼者。值得注意的是，針對(duì)其主要成分的堿溶性谷蛋白，為研究者在選擇哪種體外模擬胃腸消化方式時(shí)提供了一定的幫助。

1.2 稻米蛋白體外模擬消化方式

Lang等[15]通過模擬胃液（SGF）和模擬腸液（SIF）對(duì)稻米蛋白進(jìn)行體外消化，發(fā)現(xiàn)了在合適pH、溫度以及充分時(shí)間條件下，消化效果更好。因此稻米蛋白消化方式普遍采用的是將1 g蛋白質(zhì)樣品放入含有10 mg胃蛋白酶、pH 2的50 mL模擬胃液中，將混合物在37 ℃下攪拌（120 r/min）孵育2 h，然后使用6 mol/L NaOH中和。再用50 mL人工腸液（100 mg 胰酶，50 mmol/L、pH 8.0 的Tris-HCl緩沖液調(diào)至pH為7.0）將混合物孵育3 h。最后將消化物在沸水中加熱 5 min，使酶滅活然后凍干[16]。Li 等[17]在此消化方式上做出了一些修改，在模擬胃消化之后，用NaHCO3將胃消化液的pH值調(diào)至8.5，孵育時(shí)間增加到4 h，然后把消化液置于30%的三氯乙酸（TCA）中，最后以 12 000×g離心 5 min，取上清液。Uraipong等[18]研究發(fā)現(xiàn)，在37 ℃下用此體外模擬胃腸消化方法處理稻米蛋白，再經(jīng)分離純化獲得的消化物并與阿卡波糖藥效對(duì)照，其具有顯著的α-葡萄糖苷酶和ACE 抑制活性。另外，Cho[19]通過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，體外模擬胃腸消化是一種適用于稻米蛋白生產(chǎn)出具有更高抗氧化潛力的生物活性成分的方法。

盡管這些針對(duì)稻米蛋白的體外消化方式操作簡單、成本低且具有很好的結(jié)果重現(xiàn)性，但是與實(shí)際環(huán)境相差甚遠(yuǎn)。目前研究稻米蛋白的體外消化方式為單室、靜態(tài)與單酶作用模型，忽略了胃、腸室分開的結(jié)構(gòu)、胃腸蠕動(dòng)與多酶復(fù)合作用的人體內(nèi)部環(huán)境。因此，除了消化液與時(shí)間改進(jìn)外，科研者針對(duì)稻米蛋白的體外模擬消化方式的研究仍在繼續(xù)。尤其是更加貼近人與動(dòng)物胃腸環(huán)境的消化裝置的設(shè)計(jì)也應(yīng)當(dāng)提上日程。

2 小麥蛋白體外模擬消化的研究現(xiàn)狀

2.1 小麥蛋白理化性質(zhì)

小麥中蛋白含量略高于稻米，大概是8%～10%。小麥蛋白主要是由清蛋白（3%～5%）、球蛋白（6%～10%）、醇溶蛋白（40%～50%）和麥谷蛋白（30%～40%）組成。其中非水溶性的麥醇溶蛋白和麥谷蛋白是面筋蛋白的主要成分，也是評(píng)價(jià)小麥粉優(yōu)劣的主要指標(biāo)。麥谷蛋白分子為纖維狀，相對(duì)分子質(zhì)量為100 kDa以上，具有彈性，但延伸性小。眾所周知，谷物蛋白質(zhì)含量大于12%，是確保良好面食質(zhì)量的重要因素。小麥醇溶蛋白分子呈球狀，其相對(duì)分子質(zhì)量為27～28 kDa，是一種多聚物，等電點(diǎn)為6.41～7.10，具有延伸性，但彈性小。其中ω5-醇溶蛋白是小麥依賴運(yùn)動(dòng)誘發(fā)的嚴(yán)重過敏反應(yīng)的主要致敏蛋白，也是小麥蛋白不能廣為應(yīng)用的原因[20]。而通過消化分解的小麥蛋白，可以生產(chǎn)出具有致敏性低的生物活性小分子蛋白肽，從而實(shí)現(xiàn)小麥蛋白的高值化利用[21]。

2.2 小麥蛋白體外模擬消化方式

除了小麥蛋白致敏性而導(dǎo)致其消化代謝數(shù)據(jù)的缺乏外，有研究[22]發(fā)現(xiàn)，小麥蛋白體外消化率隨著單寧添加量的增加而降低。因此，在小麥蛋白提取純化過程中，去除與規(guī)避單寧是必不可少的一步?；诖耍珻hen等[23]設(shè)計(jì)了體外胃腸消化（SGID）方案來評(píng)價(jià)小麥胚蛋白在消化過程中的蛋白質(zhì)水解度和生物活性。具體消化方式：pH 1.20的模擬胃液（SGF）是由1 g/100 mL胃蛋白酶和0.02 g/100 mL NaCl組成，加入小麥胚蛋白之前，在37 ℃水浴中保持5 min，然后將小麥胚蛋白最終濃度保持在2 g/100 mL，在37 ℃恒溫下迅速攪拌2 h。隨后，將小麥蛋白的胃消化物添加到pH 7.50的模擬腸液1 g/100 mL胰蛋白酶和0.7 g/100 mL KH2PO4中，孵育2 h。據(jù)報(bào)道[24-25]，將小麥蛋白通過體外模擬消化方式消化后，獲得了能有效抑制血管緊張素 I 轉(zhuǎn)換酶（ACE）活性與提高免疫力的生物活性成分。

目前研究針對(duì)小麥蛋白的體外消化方式是采用單室、單酶與動(dòng)態(tài)結(jié)合模型，而忽略了胃腸室分開的結(jié)構(gòu)與胃腸環(huán)境多酶體系的內(nèi)部環(huán)境。當(dāng)然，這也為相關(guān)科研者接下來的研究提供了方向。

3 大豆蛋白體外模擬消化的研究現(xiàn)狀

3.1 大豆蛋白理化性質(zhì)

大豆是中國主要的糧食物之一，其蛋白含量約為38%，是谷類食物的4～5倍。大豆蛋白的氨基酸組成與人體必需氨基酸組成相似，屬于“優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)”。它是由一系列氨基酸通過肽鍵結(jié)合而成的高分子有機(jī)聚合物，主要由清蛋白和球蛋白組成，其中清蛋白約占5%，球蛋白約占90%。從沉降系數(shù)上分，大豆蛋白是由2S、7S、11S與15S 4種組分構(gòu)成。其組分80%是100 kDa蛋白，另外7S與11S蛋白占到總體的70%以上。7S蛋白質(zhì)是一個(gè)具有9個(gè)亞基的四級(jí)結(jié)構(gòu)，且其多肽是通過硫鍵緊密地折疊起來的。因此，在體外消化與分解前，常常需要理化方式輔助來更有效地消化大豆蛋白。

3.2 大豆蛋白體外模擬消化方式

Li等[26]通過在37 ℃與pH 1.2環(huán)境下模擬胃消化大豆蛋白時(shí)發(fā)現(xiàn)，2 h內(nèi)，大豆蛋白的水解度隨著時(shí)間延長而增大，而2 h后，增幅很小。 另外，江連洲等[27]研究發(fā)現(xiàn)：大豆分離蛋白在連續(xù)5 h的體外模擬消化試驗(yàn)中，水解度（DH）隨著消化時(shí)間的延長而增加，5 h后，增加幅度很小。董毓玭等[28]運(yùn)用體外模擬消化方式處理大豆蛋白，獲取了具有降血脂功能的生物活性肽。而Lin 等[29]通過對(duì)大豆蛋白體外消化獲取了具有抑制ACE活性與抗炎作用的生物活性成分。這不僅增加了大豆蛋白生物活性的多樣性，而且為其高值利用提供了有效的途徑。

相比于稻米蛋白與小麥蛋白，大豆蛋白的體外消化方式具有很好的結(jié)果重現(xiàn)性，但是與人和動(dòng)物實(shí)際環(huán)境還有些許的距離。現(xiàn)有研究在胃腸室內(nèi)壁的黏膜環(huán)境以及胃—幽門—腸一體式的結(jié)構(gòu)上還需進(jìn)行改進(jìn)。

4 蛋白體外模擬消化技術(shù)的發(fā)展趨勢

隨著信息技術(shù)的發(fā)展，如何利用信息技術(shù)去自主研發(fā)一套實(shí)用新型的體外消化裝備與方法，實(shí)現(xiàn)糧食源蛋白的高值化利用提上了日程。“十四五”規(guī)劃中，2025年糧食加工轉(zhuǎn)化率的目標(biāo)為75%，與發(fā)達(dá)國家的差距進(jìn)一步縮小。為了達(dá)到這個(gè)目標(biāo)，除了糧食加工產(chǎn)品的多元化創(chuàng)意外，糧食科研工作者的主要工作突破點(diǎn)仍是加工方法上的創(chuàng)新以及技術(shù)設(shè)備的升級(jí)。這樣既可以一定程度上拓展糧食加工產(chǎn)品品類，也可以避免了糧食副產(chǎn)物資源的浪費(fèi)，從而促使糧食高值利用的深入。因此，基于目前體外消化方式在糧油上的應(yīng)用，展望其發(fā)展趨勢，必定也是立足于科技創(chuàng)新。

近些年SCI、EI與CSSCI等高水平雜志報(bào)道，創(chuàng)新性地結(jié)合模型方法去體外消化糧食蛋白（見圖2）。其中，多室動(dòng)態(tài)消化、多室多酶消化、多酶動(dòng)態(tài)消化和多室多酶動(dòng)態(tài)消化等4種整合模型深受科研者青睞?；诜律Ч?，這4種整合模型中多室多酶動(dòng)態(tài)消化最佳。更有甚者，基于此模型，通過對(duì)模擬胃腸內(nèi)壁環(huán)境與對(duì)蛋白消化過程的實(shí)時(shí)監(jiān)控等方面一定程度的改進(jìn)，實(shí)現(xiàn)了體外消化的集成模型的建立。然而，最佳模擬人/動(dòng)物胃腸環(huán)境的集成模型成本往往也是最高的，不適于所有蛋白體外消化的場景。而多室動(dòng)態(tài)消化、多室多酶消化、多酶動(dòng)態(tài)消化和多室多酶動(dòng)態(tài)消化的模型因其成本低、結(jié)果重現(xiàn)好、操作簡單而廣泛被應(yīng)用在蛋白生活性肽的提取上。這些模型方法的應(yīng)用大大提高了蛋白生物活性利用及開發(fā)的水平。

圖2 消化模型交叉