于保青

(上海曉明檢測技術(shù)服務(wù)有限公司理化分析室，上海 201612)

硝磺草酮是由先正達(dá)公司于2001年研發(fā)上市的三酮類除草劑，其通過抑制雜草的羥基苯基丙酮酸酯雙氧化酶(HPPD)的活性而殺滅雜草，應(yīng)用于玉米、水稻、甘蔗等作物防除闊葉和禾本科雜草。硝磺草酮高效、殺草譜廣，是當(dāng)前應(yīng)用非常廣泛的一個除草劑品種[1]。硝基呫噸酮(圖1)是合成硝磺草酮過程中可能產(chǎn)生的1個雜質(zhì)，因該物質(zhì)的Ames試驗結(jié)果為陽性，其對人類的健康有潛在的風(fēng)險，所 以EFSA將其定為相關(guān)雜質(zhì)，規(guī)定在硝磺草酮原藥中限量最大值為2 mg/kg[2]。

圖1 硝基呫噸酮的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

關(guān)于硝磺草酮原藥中的硝基呫噸酮定量分析，王英等開發(fā)了HPLC分析方法，其最低定量限(LOQ)較高為1.5 mg/kg，且該方法對基線要求較高[3]。李東等開發(fā)的LCMS外標(biāo)定量法，根據(jù)其標(biāo)準(zhǔn)曲線計算，定量范圍約為2~50 mg/kg，LOQ等于EFSA規(guī)定的限量值[4]。硝磺草酮原藥的國家標(biāo)準(zhǔn)(編號：GB29382—2012)[5]中描述的硝基呫噸酮用LCMS單點外標(biāo)法進(jìn)行定量分析，方法中描述的標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為10 mg/kg，濃度高于EFSA規(guī)定的限量值，且如果樣品溶液中濃度與標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度相比差別較大時，則不能保證定量的準(zhǔn)確性。為確保產(chǎn)品生產(chǎn)質(zhì)量穩(wěn)定合格，生產(chǎn)企業(yè)在監(jiān)測生產(chǎn)工藝的穩(wěn)定性時，往往需要對遠(yuǎn)低于EFSA規(guī)定的限量值的濃度進(jìn)行定量。

根據(jù)生產(chǎn)企業(yè)的需要，本研究對國家標(biāo)準(zhǔn)GB 29382—2012中的硝基呫噸酮的分析方法進(jìn)行了改進(jìn)，包括離子源類型、掃描模式、掃描離子對、流動相中鹽的濃度、流速和定量方法，以期提高方法的靈敏度、擴大定量范圍、提高分析效率，為生產(chǎn)企業(yè)檢測該雜質(zhì)提供方法參考。

1 試驗部分

1.1 儀器和試劑

Secix QTRAP 4500液質(zhì)聯(lián)用儀(美國AB Secix公司)；MS205DU電子分析天平(0.000 1 g，梅特勒-托利多)；BT25S電子分析天平(0.000 01 g，賽多利斯)和SK3300H超聲波清洗器(上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司)；Milli-Q Direct8純水-超純水一體機(美國密理博公司)。

乙腈(色譜純，美國TEDIA公司)；乙酸銨(色譜純，上海麥克林生化科技有限公司)；超純水(純水-超純水一體機自制)。

硝基呫噸酮標(biāo)樣：含量為99.5%，購于國家農(nóng)藥質(zhì)檢中心(沈陽)；硝磺草酮原藥樣品A：不含硝基呫噸酮，由上海泰禾化工有限公司技術(shù)研發(fā)中心提供；硝磺草酮原藥樣品B：含硝基呫噸酮，由上海泰禾化工有限公司技術(shù)研發(fā)中心提供。

1.2 樣品制備

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

稱取0.005 g (精確至0.000 01 g)硝基呫噸酮標(biāo)樣于25 mL容量瓶中，加入少量乙腈后超聲，使標(biāo)樣充分溶解，冷卻至室溫，用乙腈定容至刻度，搖勻，命名為儲備液A；移取0.25 mL儲備液A至50 mL容量瓶，用乙腈稀釋定容得濃度為1 mg/L溶液，命名為儲備液B。用乙腈逐級稀釋儲備液B，得到濃度為0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.5 mg/L的硝基呫噸酮溶液。

1.2.2 樣品溶液的制備

稱取硝磺草酮樣品約0.5 g (精確到0.000 01 g)于10 mL刻度試管內(nèi)，加入適量乙腈溶解并稀釋至5 mL，混勻，過微孔濾膜待用。

1.3 儀器分析條件

1.3.1 液相色譜條件

液相色譜柱：GL Sciences Inert Sustain 150 mm× 4.6 mm，5 μm；柱溫：40 ℃；流速1.0 mL/min；進(jìn)樣體積：5.0 μL；流動相：乙腈:1 mM/L乙酸銨水溶液=50∶50 (體積比)；運行時間：6 min；硝基呫噸酮保留時間約為4.8 min。典型色譜圖見圖2。

圖2 硝基呫噸酮的MRM (345.0/235.1)提取離子色譜圖

1.3.2 質(zhì)譜條件

電離源模式：ESI離子源；掃描方式：MRM 正離子；離子源電壓：5 500 V；離子源溫度：500 ℃；Curtain Gas：40 Psi；Gas 1：50 Psi；Gas 2：50 Psi；轉(zhuǎn)換閥：0~4 min(進(jìn)入廢液)，4~6 min(進(jìn)入質(zhì)譜)。

表1 質(zhì)譜參數(shù)

1.4 測定

在上述1.3節(jié)操作條件下，待儀器穩(wěn)定后先進(jìn)一針空白溶劑(乙腈)，再按照濃度從低到高的順序測定標(biāo)樣溶液，然后進(jìn)一針或更多空白溶劑(乙腈)以檢查液相及質(zhì)譜體系內(nèi)有無殘留干擾，而后進(jìn)空白樣品(樣品A)，最后測定精密度樣品溶液以及回收率樣品溶液。

1.5 計算

以標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，用最小二乘法進(jìn)行線性回歸，得到回歸方程和相關(guān)系數(shù)。

將精密度樣品溶液以及回收率樣品溶液的峰面積代入回歸方程，計算得到樣品的硝基呫噸酮濃度。試樣中硝基呫噸酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)按下式計算： 式中：X為硝基呫噸酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，mg/kg；C為回收率/精密度樣品溶液中硝基呫噸酮的濃度，mg/L；V為回收率/精密度樣品溶液的體積，mL；m為回收率/精密度樣品的稱樣量，g；10-6為單位轉(zhuǎn)換系數(shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 儀器操作條件的改進(jìn)

在國標(biāo)GB29382—2012方法基礎(chǔ)上，本研究進(jìn)行了以下條件改進(jìn)：⑴ ESI源代替了APCI源，因為對于液質(zhì)聯(lián)用儀來說，ESI源比APCI源使用頻度更高，更通用，可減少離子源的更換操作。⑵ 用正離子掃描模式代替國標(biāo)中的負(fù)離子掃描模式，因為硝基呫噸酮在正離子模式下信號響應(yīng)明顯高于負(fù)離子模式。試驗結(jié)果顯示，本方法的LOQ為0.1 mg/kg，與文獻(xiàn)的1.5 mg/kg相比，靈敏度提高了15倍比。⑶ 選擇了2個掃描離子對，1個用于定量，2個用于定性。與國標(biāo)方法只有1個離子對進(jìn)行定性定量相比，2個離子定性可更多地排除干擾物質(zhì)，使方法的特異性更好。⑷ 將國標(biāo)規(guī)定的流動相中乙酸銨水溶液濃度由5 mM/L下調(diào)到1 mM/L，原因是流動相中的乙酸銨有助于硝基呫噸酮與硝磺草酮在色譜柱上進(jìn)行很好的分離，從而將樣品中大量的硝磺草酮切到廢液中而避免其進(jìn)入質(zhì)譜產(chǎn)生系統(tǒng)污染的風(fēng)險。但是流動相溶液中較高濃度的乙酸銨在正離子模式下對信號會有顯著的抑制作用。在綜合考慮下，本方法采用乙酸銨水溶液的濃度為1 mM/L。⑸ 將國標(biāo)中的0.5 mL/min流速調(diào)到1.0 mL/min。流速提高有助于縮短分析時間。國標(biāo)中的分析時間為10 min，目標(biāo)物出峰時間為7.2 min；本研究的分析時間為6 min，目標(biāo)物出峰時間為4.8 min。分析時間節(jié)省了4 min。⑹ 采用標(biāo)準(zhǔn)曲線外標(biāo)定量法代替國標(biāo)中的單點外標(biāo)定量?？紤]到標(biāo)準(zhǔn)曲線的截距通常不為零，一般樣品溶液與標(biāo)樣溶液的濃度相比偏差超出±20%時，單點外標(biāo)定量法不再適應(yīng)。本研究標(biāo)準(zhǔn)曲線的高低濃度范圍是200倍，比單點的范圍更寬。當(dāng)樣品中目標(biāo)物的濃度未知時，采用標(biāo)準(zhǔn)曲線定量更適合。

2.2 專屬性試驗

在1.3節(jié)分析條件下，分別進(jìn)樣溶劑(乙腈)、空白樣品(樣品A)、硝基呫噸酮標(biāo)樣和樣品B，以檢查在目標(biāo)峰保留時間及其附近是否有干擾峰出現(xiàn)。結(jié)果以上樣品在目標(biāo)峰的保留時間及其附近均無干擾峰出現(xiàn)。

2.3 線性試驗

以溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以色譜峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明：硝基呫噸酮質(zhì)量濃度為0.005~1 mg/L時，線性回歸方程為y=322 219x+ 1 454.3，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 6。符合r>0.99的要求[6]。標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖3。

圖3 硝基呫噸酮標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4 準(zhǔn)確度試驗

稱取約0.5 g不含硝基呫噸酮的硝磺草酮原藥(樣品A)，加入適量乙腈溶解，加入一定量的硝基呫噸酮標(biāo)準(zhǔn)品，使其添加濃度分別為0.1、2、5 mg/kg，稀釋至5 mL，每個濃度配置2個平行樣品。在上述1.3色譜條件下測定其含量，計算硝基呫噸酮的回收率平均值為86%~100%。根據(jù)準(zhǔn)則要求，當(dāng)雜質(zhì)含量<0.1%時，回收率應(yīng)為75%~125%[6]。根據(jù)測試結(jié)果，添加回收率滿足準(zhǔn)則要求?；厥章蕯?shù)據(jù)見表2。

表2 硝基呫噸酮回收率測定結(jié)果

2.5 精密度試驗

對硝磺草酮樣品B中的硝基呫噸酮進(jìn)行6次平行測定，測得硝基呫噸酮含量的標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.022，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.30%。根據(jù)霍維茨方程相對偏差應(yīng)小于11.36% (%RSDr=2(1-0.5log0.00000068)×0.67=11.36)[6]。由測定結(jié)果可知，精密度滿足準(zhǔn)則要求。精密度數(shù)據(jù)見表3。

表3 硝基呫噸酮精密度測定結(jié)果

2.6 最低定量限(LOQ)

10 μg/L的硝基呫噸酮的標(biāo)樣的信噪比為11，大于10倍信噪比[6]。其濃度折合到硝磺草中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1 mg/kg，且該濃度的回收率符合要求。因此0.1 mg/kg濃度適合作為該方法的LOQ。

3 結(jié) 論

本方法在綜合文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上對國標(biāo)GB 29382—2012中的硝基呫噸酮的分析方法進(jìn)行了改進(jìn)，包括采用的離子源類型、掃描的極性、掃描的離子對、流動相中乙酸銨的濃度、流速以及將單點外標(biāo)定量改為標(biāo)準(zhǔn)曲線外標(biāo)定量。

改進(jìn)后的方法擴大了定量范圍，縮短了分析時間，提高了分析效率。試驗數(shù)據(jù)顯示，該方法專屬性良好，靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度高，線性范圍廣，適合用于硝磺草酮中硝基呫噸酮的定量分析。該方法可為生產(chǎn)企業(yè)檢測該雜質(zhì)提供方法參考。