于保青

(上海曉明檢測技術服務有限公司理化分析室，上海 201612)

硝磺草酮是由先正達公司于2001年研發(fā)上市的三酮類除草劑，其通過抑制雜草的羥基苯基丙酮酸酯雙氧化酶(HPPD)的活性而殺滅雜草，應用于玉米、水稻、甘蔗等作物防除闊葉和禾本科雜草。硝磺草酮高效、殺草譜廣，是當前應用非常廣泛的一個除草劑品種[1]。硝基呫噸酮(圖1)是合成硝磺草酮過程中可能產生的1個雜質，因該物質的Ames試驗結果為陽性，其對人類的健康有潛在的風險，所 以EFSA將其定為相關雜質，規(guī)定在硝磺草酮原藥中限量最大值為2 mg/kg[2]。

圖1 硝基呫噸酮的化學結構式

關于硝磺草酮原藥中的硝基呫噸酮定量分析，王英等開發(fā)了HPLC分析方法，其最低定量限(LOQ)較高為1.5 mg/kg，且該方法對基線要求較高[3]。李東等開發(fā)的LCMS外標定量法，根據(jù)其標準曲線計算，定量范圍約為2~50 mg/kg，LOQ等于EFSA規(guī)定的限量值[4]。硝磺草酮原藥的國家標準(編號：GB29382—2012)[5]中描述的硝基呫噸酮用LCMS單點外標法進行定量分析，方法中描述的標準溶液濃度為10 mg/kg，濃度高于EFSA規(guī)定的限量值，且如果樣品溶液中濃度與標準溶液濃度相比差別較大時，則不能保證定量的準確性。為確保產品生產質量穩(wěn)定合格，生產企業(yè)在監(jiān)測生產工藝的穩(wěn)定性時，往往需要對遠低于EFSA規(guī)定的限量值的濃度進行定量。

根據(jù)生產企業(yè)的需要，本研究對國家標準GB 29382—2012中的硝基呫噸酮的分析方法進行了改進，包括離子源類型、掃描模式、掃描離子對、流動相中鹽的濃度、流速和定量方法，以期提高方法的靈敏度、擴大定量范圍、提高分析效率，為生產企業(yè)檢測該雜質提供方法參考。

1 試驗部分

1.1 儀器和試劑

Secix QTRAP 4500液質聯(lián)用儀(美國AB Secix公司)；MS205DU電子分析天平(0.000 1 g，梅特勒-托利多)；BT25S電子分析天平(0.000 01 g，賽多利斯)和SK3300H超聲波清洗器(上?？茖С晝x器有限公司)；Milli-Q Direct8純水-超純水一體機(美國密理博公司)。

乙腈(色譜純，美國TEDIA公司)；乙酸銨(色譜純，上海麥克林生化科技有限公司)；超純水(純水-超純水一體機自制)。

硝基呫噸酮標樣：含量為99.5%，購于國家農藥質檢中心(沈陽)；硝磺草酮原藥樣品A：不含硝基呫噸酮，由上海泰禾化工有限公司技術研發(fā)中心提供；硝磺草酮原藥樣品B：含硝基呫噸酮，由上海泰禾化工有限公司技術研發(fā)中心提供。

1.2 樣品制備

1.2.1 標準溶液的制備

稱取0.005 g (精確至0.000 01 g)硝基呫噸酮標樣于25 mL容量瓶中，加入少量乙腈后超聲，使標樣充分溶解，冷卻至室溫，用乙腈定容至刻度，搖勻，命名為儲備液A；移取0.25 mL儲備液A至50 mL容量瓶，用乙腈稀釋定容得濃度為1 mg/L溶液，命名為儲備液B。用乙腈逐級稀釋儲備液B，得到濃度為0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.5 mg/L的硝基呫噸酮溶液。

1.2.2 樣品溶液的制備

稱取硝磺草酮樣品約0.5 g (精確到0.000 01 g)于10 mL刻度試管內，加入適量乙腈溶解并稀釋至5 mL，混勻，過微孔濾膜待用。

1.3 儀器分析條件

1.3.1 液相色譜條件

液相色譜柱：GL Sciences Inert Sustain 150 mm× 4.6 mm，5 μm；柱溫：40 ℃；流速1.0 mL/min；進樣體積：5.0 μL；流動相：乙腈:1 mM/L乙酸銨水溶液=50∶50 (體積比)；運行時間：6 min；硝基呫噸酮保留時間約為4.8 min。典型色譜圖見圖2。

圖2 硝基呫噸酮的MRM (345.0/235.1)提取離子色譜圖

1.3.2 質譜條件

電離源模式：ESI離子源；掃描方式：MRM 正離子；離子源電壓：5 500 V；離子源溫度：500 ℃；Curtain Gas：40 Psi；Gas 1：50 Psi；Gas 2：50 Psi；轉換閥：0~4 min(進入廢液)，4~6 min(進入質譜)。

表1 質譜參數(shù)

1.4 測定

在上述1.3節(jié)操作條件下，待儀器穩(wěn)定后先進一針空白溶劑(乙腈)，再按照濃度從低到高的順序測定標樣溶液，然后進一針或更多空白溶劑(乙腈)以檢查液相及質譜體系內有無殘留干擾，而后進空白樣品(樣品A)，最后測定精密度樣品溶液以及回收率樣品溶液。

1.5 計算

以標準溶液的濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，用最小二乘法進行線性回歸，得到回歸方程和相關系數(shù)。

將精密度樣品溶液以及回收率樣品溶液的峰面積代入回歸方程，計算得到樣品的硝基呫噸酮濃度。試樣中硝基呫噸酮的質量分數(shù)按下式計算： 式中：X為硝基呫噸酮的質量分數(shù)，mg/kg；C為回收率/精密度樣品溶液中硝基呫噸酮的濃度，mg/L；V為回收率/精密度樣品溶液的體積，mL；m為回收率/精密度樣品的稱樣量，g；10-6為單位轉換系數(shù)。

2 結果與討論

2.1 儀器操作條件的改進

在國標GB29382—2012方法基礎上，本研究進行了以下條件改進：⑴ ESI源代替了APCI源，因為對于液質聯(lián)用儀來說，ESI源比APCI源使用頻度更高，更通用，可減少離子源的更換操作。⑵ 用正離子掃描模式代替國標中的負離子掃描模式，因為硝基呫噸酮在正離子模式下信號響應明顯高于負離子模式。試驗結果顯示，本方法的LOQ為0.1 mg/kg，與文獻的1.5 mg/kg相比，靈敏度提高了15倍比。⑶ 選擇了2個掃描離子對，1個用于定量，2個用于定性。與國標方法只有1個離子對進行定性定量相比，2個離子定性可更多地排除干擾物質，使方法的特異性更好。⑷ 將國標規(guī)定的流動相中乙酸銨水溶液濃度由5 mM/L下調到1 mM/L，原因是流動相中的乙酸銨有助于硝基呫噸酮與硝磺草酮在色譜柱上進行很好的分離，從而將樣品中大量的硝磺草酮切到廢液中而避免其進入質譜產生系統(tǒng)污染的風險。但是流動相溶液中較高濃度的乙酸銨在正離子模式下對信號會有顯著的抑制作用。在綜合考慮下，本方法采用乙酸銨水溶液的濃度為1 mM/L。⑸ 將國標中的0.5 mL/min流速調到1.0 mL/min。流速提高有助于縮短分析時間。國標中的分析時間為10 min，目標物出峰時間為7.2 min；本研究的分析時間為6 min，目標物出峰時間為4.8 min。分析時間節(jié)省了4 min。⑹ 采用標準曲線外標定量法代替國標中的單點外標定量。考慮到標準曲線的截距通常不為零，一般樣品溶液與標樣溶液的濃度相比偏差超出±20%時，單點外標定量法不再適應。本研究標準曲線的高低濃度范圍是200倍，比單點的范圍更寬。當樣品中目標物的濃度未知時，采用標準曲線定量更適合。

2.2 專屬性試驗

在1.3節(jié)分析條件下，分別進樣溶劑(乙腈)、空白樣品(樣品A)、硝基呫噸酮標樣和樣品B，以檢查在目標峰保留時間及其附近是否有干擾峰出現(xiàn)。結果以上樣品在目標峰的保留時間及其附近均無干擾峰出現(xiàn)。

2.3 線性試驗

以溶液質量濃度為橫坐標，以色譜峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。結果表明：硝基呫噸酮質量濃度為0.005~1 mg/L時，線性回歸方程為y=322 219x+ 1 454.3，相關系數(shù)R2=0.999 6。符合r>0.99的要求[6]。標準曲線見圖3。

圖3 硝基呫噸酮標準曲線

2.4 準確度試驗

稱取約0.5 g不含硝基呫噸酮的硝磺草酮原藥(樣品A)，加入適量乙腈溶解，加入一定量的硝基呫噸酮標準品，使其添加濃度分別為0.1、2、5 mg/kg，稀釋至5 mL，每個濃度配置2個平行樣品。在上述1.3色譜條件下測定其含量，計算硝基呫噸酮的回收率平均值為86%~100%。根據(jù)準則要求，當雜質含量<0.1%時，回收率應為75%~125%[6]。根據(jù)測試結果，添加回收率滿足準則要求?；厥章蕯?shù)據(jù)見表2。

表2 硝基呫噸酮回收率測定結果

2.5 精密度試驗

對硝磺草酮樣品B中的硝基呫噸酮進行6次平行測定，測得硝基呫噸酮含量的標準偏差為0.022，相對標準偏差為3.30%。根據(jù)霍維茨方程相對偏差應小于11.36% (%RSDr=2(1-0.5log0.00000068)×0.67=11.36)[6]。由測定結果可知，精密度滿足準則要求。精密度數(shù)據(jù)見表3。

表3 硝基呫噸酮精密度測定結果

2.6 最低定量限(LOQ)

10 μg/L的硝基呫噸酮的標樣的信噪比為11，大于10倍信噪比[6]。其濃度折合到硝磺草中的質量分數(shù)為0.1 mg/kg，且該濃度的回收率符合要求。因此0.1 mg/kg濃度適合作為該方法的LOQ。

3 結 論

本方法在綜合文獻的基礎上對國標GB 29382—2012中的硝基呫噸酮的分析方法進行了改進，包括采用的離子源類型、掃描的極性、掃描的離子對、流動相中乙酸銨的濃度、流速以及將單點外標定量改為標準曲線外標定量。

改進后的方法擴大了定量范圍，縮短了分析時間，提高了分析效率。試驗數(shù)據(jù)顯示，該方法專屬性良好，靈敏度、準確度和精密度高，線性范圍廣，適合用于硝磺草酮中硝基呫噸酮的定量分析。該方法可為生產企業(yè)檢測該雜質提供方法參考。