王翠麗

(1.南寧師范大學地理與海洋研究院，廣西南寧 530000；2.北部灣環(huán)境演變與資源利用教育部重點實驗室，廣西南寧 530000)

近江牡蠣()屬無脊椎()雙殼綱()貝類，自身缺乏獲得性免疫，單純依靠固有免疫系統(tǒng)防御疫害。C型凝集素(C-type lectin，CTL)是固有的免疫重要因子，可通過糖識別域(carbohydrate recognition domain，CRD)中Ca結(jié)合位點2氨基酸殘基的側(cè)鏈羰基與微生物表面N-氨基半乳糖或甘露糖等結(jié)合形成復合體，激活下游信號傳遞，促進機體對外來入侵病原微生物清除，因此Ca結(jié)合位點2氨基酸基序可決定CTL的糖結(jié)合活性和特異性。

已有研究顯示，脊椎動物CTL中Ca結(jié)合位點2第1位氨基酸基序為EPN(谷氨酸-脯氨酸-天冬酰胺)或QPD(谷氨酰胺-脯氨酸-天冬氨酸)，而無脊椎動物除了以上2種，還可以是EPD(谷氨酸-脯氨酸-天冬氨酸)、QPG(谷氨酰胺-脯氨酸-甘氨酸)、QPS(谷氨酰胺-脯氨酸-絲氨酸)和YPD(酪氨酸-脯氨酸-天冬氨酸)等；其第2位關(guān)鍵氨基酸基序也不局限于脊椎動物的WND(色氨酸-天冬酰胺-天冬氨酸)，而可以是WHD(色氨酸-組氨酸-天冬氨酸)、WSD(色氨酸-絲氨酸-天冬氨酸)、WID(色氨酸-異亮氨-天冬氨酸)和WRD(色氨酸-精氨酸-天冬氨酸)等。推測無脊椎動物Ca結(jié)合位點 2 氨基酸基序的多樣性將賦予其更廣泛和更多樣化的糖結(jié)合活性。因此，筆者以近江牡蠣為研究對象，開展了CTL的CRD病原相關(guān)分子模式(pathogen associated molecular patterns，PAMPs)結(jié)合譜及抑菌活性研究，試驗首先克隆其CTL基因，明確CRD結(jié)構(gòu)域及Ca結(jié)合位點2氨基酸基序；其次通過體外重組CTL的CRD結(jié)構(gòu)域蛋白，揭示其PAMPs結(jié)合譜及抑菌活性；研究結(jié)果將為深入了解CTL在無脊椎動物近江牡蠣固有免疫防御機制中的重要作用提供參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

實驗動物。近江牡蠣成貝(約2年齡)采自廣西欽州灣茅尾海的2個養(yǎng)殖區(qū)(108°35′08″E，21°43′00″N和108°51′ 58″E，21°39′ 21″N)，養(yǎng)殖海水條件：溫度分別為31.5 ℃和31.7 ℃，鹽度分別為17.7‰和17.9‰，pH分別為7.72和7.81，電導率分別為28.86和29.17 μs/cm。樣品采集完畢立即送回實驗室處理。

主要試劑。Trizol試劑，購自MRC公司；氯仿、異丙醇、乙醇，購自中國醫(yī)藥集團有限公司；DEPC水，購自北京索萊寶科技有限公司；QIA quick Gel Extraction 試劑盒，購自QIAGEN公司；rE、10×PCR Buffer、2.5 mmol/L dNTP、DNA Marker 2000、PMD19-T Vectors，購自TaKaRa公司；DH5α感受態(tài)細胞、X-gal、IPTG、氨芐青霉素，購自北京全式金公司；TIAN Script RT cDNA第一鏈合成試劑盒，購自康為試劑公司；SYBR?Select Master Mix試劑盒，購自ABI公司；Anti-6x His tag antibody一抗、Goat Anti-Rabbit lgG(HRP)二抗，購自Abcam公司；畢赤酵母、耶羅維亞酵母、金黃色葡萄球菌、鰻弧菌、大腸桿菌及所用擴增引物，購自Invitrogen公司。

主要儀器。渦旋振蕩儀(型號為QL-902)，購自海門市其林貝爾儀器制造有限公司；酶標儀(型號為Bio-Rad iMark)、電泳儀(型號為Powerpac HV 164-5056)、梯度熱循環(huán)儀(型號為T100TM)，購自Bio-Rad公司；高速離心機(型號為5415D)、離心機(型號為mini spin plus)、紫外分光光度計(型號為Bio Photometer)，購自Eppendorf公司；超微量紫外分光光度計(型號為NanoDrop-1 000)，購自NanoDrop公司；全自動凝膠成像系統(tǒng)(型號為Syngene Genius)，購自Syngene公司；低溫恒溫槽(型號為DC-1006)，購自無錫沃信儀器有限公司；熒光定量PCR儀(型號為7500 FAST)，購自IBM公司；生物安全柜(型號為HF Safe 760S)，購自Heal Force公司；電熱恒溫鼓風干燥箱(型號為DHG-9070A)，購自上海精宏設(shè)備有限公司。

基因克隆。依據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中已登錄的長牡蠣基因組(登錄號：CGI_10009560)中查詢獲得其CTL基因序列，利用在線生物信息學軟件設(shè)計近江牡蠣CTL基因RT-PCR引物(表1)。Trizol提取近江牡蠣組織樣本中總RNA，超微量紫外分光光度計測定總RNA質(zhì)量和濃度，瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA完整性；TIAN Script RT cDNA第一鏈合成試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄，操作按產(chǎn)品說明書進行；PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物。

表達譜分析。運用Trizol法分別提取近江牡蠣成貝肝胰腺、外套膜、血細胞、鰓、肌肉柱、卵巢和唇瓣組織樣品總RNA，分別取1.0 μg總RNA分別進行反轉(zhuǎn)錄制備cDNA模板，各組織樣品設(shè)置6個平行樣品。根據(jù)筆者克隆所得近江牡蠣CTL的CDS區(qū)序列(登錄號：MZ411536)和GenBank數(shù)據(jù)庫已登錄β-actin(登錄號：AF026063)序列，設(shè)計Q-PCR引物(表1)，采用7500 FAST熒光定量PCR檢測系統(tǒng)(Applied Bio systems)進行分析，2法計算近江牡蠣CTL mRNA相對表達結(jié)果。

體外重組CTL的CRD結(jié)構(gòu)域蛋白。將CTL/pMD19-T和pET30a載體用NdeⅠ和HindⅢ雙酶切，將近江牡蠣CTL的CRD結(jié)構(gòu)域目的片段與pET30a載體連接并轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細胞BL21中，重組質(zhì)粒鑒定陽性表達克隆子(CTL/pET30a)；鑒定完畢將質(zhì)粒二次轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細胞BL21中，分時間段IPTG誘導表達，收集菌體，誘導表達產(chǎn)物SDS-PAGE檢測，考馬斯亮藍染色確定最佳誘導時間；在最佳誘導時間大量誘導表達，分離包涵體，過鎳柱，尿素透析蛋白復性；BSA標準品加入考馬斯亮藍染色液，測定不同濃度BSA標準品的595 nm的光吸收值，繪制標準曲線；測定CTL的CRD結(jié)構(gòu)域重組蛋白在595 nm的光吸收值，依據(jù)所建標準曲線計算蛋白濃度。

表1 近江牡蠣CTL引物Table 1 Primers for CTL in C.rivularis

CRD結(jié)構(gòu)域重組蛋白PAMPs結(jié)合譜。CRD結(jié)構(gòu)域重組蛋白PAMPs識別譜檢測方法參照文獻[11]的方法：將PGN、LPS和glucan溶解于pH 9.8 NaCO中，酶標儀每孔含10 μg溶質(zhì)，4 ℃包被過夜，PBST洗板3次；酶標儀每孔加入3% BSA 100 μL，37 ℃封閉30 min，PBST洗板1次；酶標儀每孔加入不同稀釋濃度的CRD重組蛋白，18 ℃孵育3 h，PBST洗板1次；酶標儀每孔加入Anti-6x His tag antibody一抗(稀釋比例1∶1 000)，37 ℃孵育1 h，PBST洗板1次；酶標儀每孔加入Goat Anti-Rabbit lgG(HRP)二抗(稀釋比例1∶2 000)，37 ℃孵育1 h；酶標儀每孔加入100 μL HRP底物TMB溶液，避光37 ℃反應10 min，加入2 mol/L硫酸50 μL終止反應；讀取酶標儀OD值。依據(jù)ELISA試劑盒說明書規(guī)定：樣品OD吸光度值/陰性對照OD吸光度值≥2.1判定為陽性，該試驗中陰性對照OD吸光度值平均為0.04，則0.04×2.1=0.084，該值即為陰性和陽性分界點值，樣品值≥0.084，即判為陽性。

CRD結(jié)構(gòu)域重組蛋白菌結(jié)合活性。CRD結(jié)構(gòu)域重組蛋白菌結(jié)合活性檢測方法參照Lee等的方法：革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌，革蘭氏陰性菌大腸桿菌和鰻弧菌，畢赤酵母和耶羅維亞酵母，分別挑菌接種到LB液體培養(yǎng)基中，畢赤酵母和耶羅維亞酵母28 ℃ 200 r/min過夜培養(yǎng)，金黃色葡萄球菌、鰻弧菌和大腸桿菌37 ℃ 200 r/min 過夜培養(yǎng)；離心收集菌體，PBS緩沖液調(diào)整濃度為1×10CFU/mL；吸取1 mL各菌液懸濁液分別與100 μg CRD結(jié)構(gòu)域重組蛋白混合，室溫旋轉(zhuǎn)孵育；離心收集菌體，PBS緩沖液洗滌菌體，無菌水重懸；各菌體加入蛋白電泳緩沖液，95 ℃水浴10 min，進行SDS-PAGE電泳；電泳后凝膠轉(zhuǎn)NC膜，PBST緩沖液漂洗1次；NC膜5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，PBST漂洗1次；NC膜Anti-6x His tag antibody一抗(稀釋比例1∶1 000)室溫孵育1 h，PBST漂洗1次；NC膜Goat Anti-Rabbit lgG(HRP)二抗(稀釋比例1∶2 000)室溫孵育1 h，TBST漂洗1次；ECL顯影，拍照記錄結(jié)果。

CRD結(jié)構(gòu)域重組蛋白抑菌活性。CRD重組蛋白抑菌活性檢測方法參照Zhou等的方法：10 mmol/L磷酸鈉緩沖液稀釋革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌、革蘭氏陰性菌大腸桿菌和鰻弧菌、畢赤酵母和耶羅維亞酵母，使得光密度達0.001 8。按照1∶1比例將細菌稀釋液與CRD結(jié)構(gòu)域重組蛋白混合在96孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)。培養(yǎng)12 h后，以無菌超純水代替CRD結(jié)構(gòu)域重組蛋白作為空白對照，與等量培養(yǎng)液混合培養(yǎng)基設(shè)為陰性對照，測試最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)。

2 結(jié)果與分析

克隆獲得1種CTL基因(圖1)，測序分析顯示：CTL基因CDS區(qū)共1 350 bp(包括終止密碼)，編碼449個氨基酸。Signa IP軟件預測其多肽鏈N-端含有1段24個氨基酸的信號肽；SMART網(wǎng)站預測其多肽鏈包含1個胞外段110個氨基酸CRD結(jié)構(gòu)域；CRD結(jié)構(gòu)域含Ca結(jié)合位點2氨基酸基序QPS/WHD及3個保守的半胱氨酸殘基(圖2)。

注：泳道1.DNA Mark；泳道2～6.目標DNA Note：Lane 1.DNA Mark；Lane 2-6.Target DNA圖1 近江牡蠣CTL基因瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Fig.1 Agarose gel electrophoresis of CTL in C.rivularis

注：信號肽由斜體標識；CRD結(jié)構(gòu)域用下滑線標識；Ca2+結(jié)合位點2氨基酸基序用矩形框標識；CRD結(jié)構(gòu)域內(nèi)保守Cys用斜體紅色字母“C”標識 Note：The signal peptide was identified by italics；CRD domain was identified by slide lines；amino acid sequences of Ca2+ binding site 2 were identified by rectangular box；conservative Cys of CRD domain was identified by italic red letter “C”圖2 近江牡蠣CTL基因部分序列Fig.2 Partial sequences of CTL in C.rivularis

熒光定量PCR檢測，2法計算近江牡蠣CTL mRNA相對表達譜，結(jié)果顯示：CTL mRNA在肝胰腺、外套膜、鰓、唇瓣、血細胞、卵巢、肌肉柱組織中均有表達，并呈組織差異分布。肝胰腺、外套膜和血細胞中表達量多，其次為鰓、肌肉柱和卵巢，唇瓣表達量最少(圖3)。

注：不同小寫字母表示組間差異顯著(P<0.05) Note：Different lowercase letters indicate significant difference between groups(P<0.05)圖3 近江牡蠣CTL基因組織表達譜Fig.3 CTL relative mRNA levels in tissue of Crassostrea rivularis

近江牡蠣CTL胞外段的CRD結(jié)構(gòu)域重組蛋白被誘導表達，分子量約為27.45 kD，利用Ni-NTA對重組蛋白進行純化，結(jié)果表明：蛋白純度較高，尿素濃度梯度對變性蛋白進行復性(圖4、5)，保存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

近江牡蠣CTL胞外段的CRD結(jié)構(gòu)域重組蛋白PAMPs識別譜結(jié)果如圖6所示。當CRD結(jié)構(gòu)域重組蛋白濃度為55 μg/mL時，具有LPS、PGN和glucan 3種PAMPs結(jié)合活性，其中對LPS的結(jié)合能力最強，差異顯著(<0.05)。

近江牡蠣CTL胞外段的CRD結(jié)構(gòu)域重組蛋白能夠結(jié)合2種真菌：畢赤酵母(圖7泳道2)和耶羅維亞酵母(圖7泳道3)；1種革蘭氏陽性菌：金黃色葡萄球菌(圖7泳道4)；2種革蘭氏陰性菌：鰻弧菌(圖7泳道5)和大腸桿菌(圖7泳道6)。

近江牡蠣CTL胞外段的CRD結(jié)構(gòu)域重組蛋白抑菌活性結(jié)果見表2。分析表2可知，C型凝集素CRD結(jié)構(gòu)域重組蛋白能抑制和殺死革蘭氏陽性菌中的金黃色葡萄球菌、革蘭氏陰性菌中的大腸桿菌和鰻弧菌；能抑制但不能殺死畢赤酵母和耶羅維亞酵母。

3 討論

筆者在無脊椎貝類近江牡蠣中克隆獲得一種CTL分子，

圖4 近江牡蠣CTL胞外段的CRD結(jié)構(gòu)域重組蛋白氨基酸序列 Fig.4 Amino acid sequences of CRD domain recombinant protein of CTL in C.rivularis

注：A.SDS-PAGE；B.Western blot；M1.蛋白Marker(Cat.No.M00516)；M2.蛋白Marker(Cat.No.M00521)；泳道1.BSA(2 μg)；泳道2、3.目標蛋白 Note：A.SDS-PAGE；B.Western blot；M1.Protein Marker(Cat.No.M00516)；M2.Protein Marker(Cat.No.M00521)；Lane 1.BSA(2μg)；Lane 2，3.Target protein圖5 近江牡蠣CTL胞外段的CRD結(jié)構(gòu)域重組蛋白Fig.5 CRD domain recombinant protein of CTL in C.rivularis

注：*表示組間差異顯著(P<0.05) Note：* indicates significant difference between groups(P<0.05)圖6 近江牡蠣CTL胞外段的CRD結(jié)構(gòu)域重組蛋白PAMPs識別譜 Fig.6 PAMPs binding spectrum of CRD domain recombinant protein of CTL in C.rivularis

其CRD結(jié)構(gòu)域Ca結(jié)合位點2第一氨基酸基序為QPS，這有別于脊椎動物，但在其他貝類中出現(xiàn)過類似現(xiàn)象。如脊椎動物第一氨基酸基序EPN的第三位氨基酸天冬酰胺被天冬氨酸所取代時，則成為EPD基序，這在櫛孔扇貝()和熱帶蛤()中研究發(fā)現(xiàn)；脊椎動物另一個第一氨基酸基序QPD的第三位氨基酸天冬氨酸被絲氨酸所取代時，則成為QPS基序，這在紫貽貝()中發(fā)現(xiàn)過。上述氨基酸的直接取代將導致Ca結(jié)合位點2質(zhì)子供體和質(zhì)子受體之間發(fā)生變化，可能會影響糖結(jié)合活性和抑菌特異性。近江牡蠣CRD結(jié)構(gòu)域Ca結(jié)合位點2第二氨基酸基序是WHD，同樣有別于脊椎動物保守的WND，這一變化同樣在其他貝類中有過報道。對于脊椎動物第二氨基酸基序WND的研究已證實其作用是當CRD與配體結(jié)合時起輔助作用，對于無脊椎貝類中多種多樣的第二氨基酸基序更多人則認為其可能參與決定糖結(jié)合活性和特異性。

注：1.陽性對照；2.畢赤酵母；3.耶羅維亞酵母；4.金黃色葡萄球菌；5.鰻弧菌；6.大腸桿菌 Note：1.Positive control；2.Pichia pastoris；3.Yarrowia lipolytica；4.Staphylococcus aureus；5.Vibrio anguillarum；6.Bacillus coli圖7 近江牡蠣CTL胞外段的CRD結(jié)構(gòu)域重組蛋白菌結(jié)合譜Fig.7 Bacterial binding spectrum of CRD domain recombinant protein of CTL in C.rivularis

表2 近江牡蠣CTL胞外段的CRD結(jié)構(gòu)域重組蛋白抑菌活性Table 2 Antibacterial activities of CRD domain recombinant protein of CTL in C.rivularis μmol/L

利用近江牡蠣CTL的CRD結(jié)構(gòu)域體外重組蛋白檢測其PAMPs結(jié)合譜，結(jié)果顯示：其體外重組蛋白濃度為55 μg/mL時，具有LPS、PGN和glucan 3種PAMPs結(jié)合活性。脊椎動物大鼠()的相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，第一氨基酸基序為EPN或QPD時，均表現(xiàn)為D-mannose和D-galactose結(jié)合活性。而在無脊椎貝類中，不同的氨基酸基序組合可表現(xiàn)出多種多樣的糖結(jié)合活性。如長牡蠣()QPS/WHD氨基酸基序組合時，表現(xiàn)出了LPS、PGN、mannan和glucan 4種PAMPs結(jié)合活性，這與筆者所得結(jié)果相近；在櫛孔扇貝的研究中發(fā)現(xiàn)EPN/LND和EPN/YND 2類Ca結(jié)合位點2氨基酸基序組合時，則同時表現(xiàn)出了LPS、mannan、PGN和glucan 4種PAMPs結(jié)合活性；而當?shù)谝话被峄蚓鶠镋PN，第二氨基酸基序分別為FAD和LND時，則一個表現(xiàn)為LPS和mannan 2種PAMPs結(jié)合活性，另一個表現(xiàn)為LPS、mannan、PGN和glucan 4種PAMPs結(jié)合活性。若按照脊椎動物中已證實的第一氨基酸基序決定糖結(jié)合活性和特異性，而第二氨基酸基序為輔助作用的原理定義無脊椎貝類顯然是不合適的，推測無脊椎貝類決定糖結(jié)合活性和特異性不僅取決于第一氨基酸基序，還取決于第二氨基酸基序。

筆者利用近江牡蠣CTL的CRD結(jié)構(gòu)域體外重組蛋白檢測菌結(jié)合譜及抑菌活性，結(jié)果顯示，其能結(jié)合、抑制和殺死革蘭氏陽性菌中的金黃色葡萄球菌、革蘭氏陰性菌中的大腸桿菌和鰻弧菌，能結(jié)合、抑制但不能殺死畢赤酵母和耶羅維亞酵母。這與前人在海灣扇貝中所得結(jié)果較一致，當CTL的CRD結(jié)構(gòu)域體外重組蛋白表現(xiàn)出PGN、LPS和glucan 3種PAMPs結(jié)合活性時，其可結(jié)合革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌和酵母，具有多種抑菌和殺菌活性。

筆者利用熒光定量PCR技術(shù)檢測近江牡蠣CTL mRNA相對表達譜，結(jié)果顯示，其在肝胰腺、外套膜和血細胞中的相對表達量顯著高于其他組織中的表達量(<0.05)。在無脊椎貝類中，肝胰腺是合成固有免疫相關(guān)蛋白的重要器官，血細胞是機體清除入侵病原微生物的直接參與者，而外套膜和鰓是外界環(huán)境直接接觸最多的器官，這些器官較多分布免疫相關(guān)基因CTL，可幫助機體快速識別、結(jié)合和清除入侵外源微生物，符合貝類的生理和生活環(huán)境特點。

綜上，該研究證實CTL在無脊椎貝類近江牡蠣固有免疫防御機制中可發(fā)揮識別、結(jié)合、抑制和殺死多種有害菌的重要作用。