史昊，李小麗，楊玉丹，馬青青，侯一丹，高明

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院 腫瘤科，河南 鄭州 450000)

消化道腫瘤是在世界范圍內(nèi)流行的疾病，在前十位發(fā)病率的腫瘤中占據(jù)4席[1]。其中結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)排第3位，是導(dǎo)致全球癌癥相關(guān)死亡的第四大原因[2]。直腸癌約占CRC的30%，局部晚期直腸癌的標準治療是新輔助放化療，再行全直腸系膜切除術(shù)[3-4]。基于5-Fu聯(lián)合鉑類的化療方案是早中期直腸癌新輔助或輔助治療的標準方案，主要包括輸注氟尿嘧啶及亞葉酸，或每日口服卡培他濱、替吉奧[5-6]?；驕y序是腫瘤治療過程中的重要檢查手段，在靶向治療中最核心的一環(huán)就是通過基因檢測獲得靶向治療的間接指導(dǎo)和預(yù)測信息[7]，以尋求最佳治療方案，如KRAS基因，試驗證明FOLFIRI方案聯(lián)合針對表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)的單克隆抗體西妥昔單抗已被證明可降低KRAS野生型患者的進展風(fēng)險[8]。

腫瘤突變負荷(tumor mutational burden，TMB)是通過測序非同義體細胞基因突變的數(shù)量獲得的，更高的TMB意味著腫瘤可能會產(chǎn)生更多的新抗原，誘導(dǎo)特異性T細胞參與反應(yīng)，并進一步增強抗腫瘤免疫。除了一些特定的基因改變外，我們認為絕大多數(shù)腫瘤DNA的改變與靶向治療的反應(yīng)有關(guān)。TMB已用作體細胞突變積累的替代測量。許多臨床研究強化了TMB作為預(yù)測靶向治療結(jié)果的獨立生物標志物的概念。與高TMB患者相比，TMB較低的患者的反應(yīng)率和生存率較差[9-14]。

非小細胞肺癌免疫治療中的預(yù)測性生物標志物包括程序性死亡蛋白配體1(programmed cell death-ligand 1，PD-L1)狀態(tài)、TMB、錯配修復(fù)缺陷(mismatch repair deficiency，dMMR)和微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(microsatellite instability，MSI)等[15]。對于CRC患者，除了程序性死亡蛋白1(programmed cell death protein 1，PD-1)抑制劑單藥一線治療MSI-H/dMMR晚期CRC的地位不可動搖，已作為最高級別的Ⅰ類推薦寫進中國抗癌協(xié)會臨床腫瘤學(xué)協(xié)作專業(yè)委員會(Chinese Society of Clinical Oncology，CSCO)指南，余標志物是否在CRC免疫治療中扮演類似角色尚不確定[16]。本文目的在于探究部分基因的表達是否可作為新的生物標志物，對直腸癌患者免疫治療有指導(dǎo)意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料回顧性分析2015年1月至2021年10月鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院收治的102例直腸惡性腫瘤患者，腫瘤病理類型均為腺癌，患者均接受過基于二代測序(next generation sequencing，NGS)法的基因檢測及至少2周期的抗PD-1免疫治療，患者及家屬在接受治療前均簽署知情同意書。直腸癌患者共有102例，包含男56例，女46例；年齡<55歲50例，≥55歲52例；有吸煙飲酒史21例；Ⅲ期腫瘤15例，Ⅳ期腫瘤87例；以下各組年齡、性別、吸煙飲酒史、腫瘤分期差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

1.2 選取標準

1.2.1納入標準 (1)在治療前接受過基因檢測且能準確查詢到基因檢測報告；(2)在二線治療方案失敗后通過影像學(xué)確認病灶進展后開始接受正規(guī)規(guī)律免疫治療；(3)至少接受過2周期正規(guī)抗PD-1免疫治療后定期復(fù)查；(4)根據(jù)實體瘤療效評價標準(RECIST1.1)[17]評估至少含1個可測量病灶；(5)美國東部腫瘤協(xié)作組(Eastern Cooperative Oncology Group，ECOG)體力狀況評分為0～1分；(6)年齡≥18歲，性別不限；(7)規(guī)律隨訪，依從性良好，臨床資料完整；(8)對治療有較好的耐受性，無嚴重不良反應(yīng)。

1.2.2排除標準 (1)接受免疫治療小于2周期；(2)雖接受免疫治療至少2周期，但未行影像學(xué)確認病灶進展即改變治療方案；(3)免疫治療使病灶緩解后又行局部手術(shù)或介入治療；(4)治療過程中出現(xiàn)嚴重不良反應(yīng)而停止治療；(5)有神經(jīng)疾病或精神疾病史；(6)已知具有嚴重或未能控制的基礎(chǔ)疾??；(7)存在治療禁忌證。

1.3 治療方法在患者二線方案治療失敗后(影像學(xué)確認病灶進展)，給予患者抗PD-1受體抑制劑應(yīng)用，包括卡瑞利珠單抗(江蘇恒瑞醫(yī)藥有限公司，國藥準字S20190027)、特瑞普利單抗(上海駿實生物科技有限公司，國藥準字S20180015)、信迪利單抗[信達生物(蘇州)有限公司，國藥準字S20180016]，3種抗PD-1受體抑制劑療效差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)?？ㄈ鹄閱慰姑看蚊恐?00 mg配入100 mL 9 g·L-1的氯化鈉溶液中靜脈滴注，每個治療周期1次；特瑞普利單抗每次每支240 mg配入9 g·L-1的氯化鈉溶液100 mL中靜脈滴注，每個治療周期1次；信迪利單抗每次每支200 mg配入9 g·L-1的氯化鈉溶液100 mL中靜脈滴注，每個治療周期1次，14～21 d為1個周期，直至患者不能耐受或因疾病進展而終止治療或死亡，觀察評價臨床療效。

1.4 療效觀察收集患者每個周期治療前的基線資料，采用胸及全腹部增強CT、腦部MRI及全身骨掃描等評估全身病灶，采用實體腫瘤療效評價標準(RECIST1.1)[17]評價療效，包括完全緩解(complete response，CR)、部分緩解(partial response，PR)、疾病穩(wěn)定(stable disease，SD)和疾病進展(progressive disease，PD)?？陀^緩解率(objective response rate，ORR)為CR率與PR率之和；臨床獲益率(clinical benefit rate，CBR)為CR率、PR率、SD率之和。隨訪記錄無進展生存期(progression free survival，PFS)和不良反應(yīng)。免疫治療過程中的常見不良反應(yīng)包括皮疹、胃腸道反應(yīng)、骨髓抑制、肝功能損傷等(1～2級不良反應(yīng)為輕度；≥3級不良反應(yīng)為重度)，患者治療過程中各組無治療相關(guān)死亡出現(xiàn)。至少接受免疫治療2個周期后采用影像學(xué)檢查評估臨床療效。每周期治療前1 d、第4天復(fù)查血常規(guī)及肝、腎功能評估不良反應(yīng)。通過在院觀察及電話隨訪獲得患者的相關(guān)資料。隨訪記錄至患者不能耐受或因疾病進展而終止治療或死亡，隨訪截止至2021年12月31日。研究終點：主要終點為中位PFS，次要終點為ORR及CBR。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 26.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)。組間比較采用校正χ2檢驗、Fisher確切概率法等，通過Kaplan-Meier法繪制生存曲線，采用log-rank檢驗比較生存率。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 突變基因影響采用基于NGS法的基因檢測對符合條件的102例患者的腫瘤組織進行突變基因檢測(其中12例患者僅行K-RAS、N-RAS、BRAF、PIK3CA4項基因檢測；3例患者僅行K-RAS、N-RAS、BRAF3項基因檢測)，記錄突變基因的名字及突變數(shù)量(部分基因的突變?nèi)藬?shù)過少，未列出)。見表1。其中K-RAS、SMAD4、TP53、APC、MYC陽性或陰性例數(shù)均不少于20例，可用于后續(xù)統(tǒng)計分析；余基因陽性或陰性突變例數(shù)相差較大，不予分析。

表1 突變基因及對應(yīng)例數(shù)

2.1.1K-RAS基因 根據(jù)K-RAS基因突變情況分為兩組，ORR及CBR在K-RAS(﹢)和K-RAS(-)的患者中比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。若以PFS考量兩組的差異性，K-RAS(﹢)患者中位PFS為3.5個月(95% CI：2.27～4.73)，K-RAS(-)患者中位PFS為4.0個月(95% CI：2.91～5.09)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.469)。見圖1。

表2 K-RAS基因突變對ORR及CBR的影響比較[n(%)]

圖1 K-RAS基因突變中位PFS比較

2.1.2SMAD4基因 根據(jù)SMAD4基因突變情況分為兩組，ORR及CBR在SMAD4(+)和SMAD4(-)的患者中比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表3。若以PFS考量兩組的差異性，SMAD4(+)患者中位PFS為3.5個月(95% CI：2.40～4.60)，SMAD4(-)患者中位PFS為3.0個月(95% CI：2.20～3.81)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.458)。見圖2。

表3 SMAD4基因突變對ORR及CBR的影響比較[n(%)]

圖2 SMAD4基因突變中位PFS比較

2.1.3TP53基因 根據(jù)TP53基因突變情況分為兩組，TP53(+)和TP53(-)患者ORR及CBR比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表4。若以PFS考量兩組的差異性，TP53(+)患者中位PFS為3.5個月(95% CI：2.83～4.17)，TP53(-)患者中位PFS為2.0個月(95% CI：0.356～3.64)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.589)。見圖3。

表4 TP53基因突變對CBR影響對比[n(%)]

圖3 TP53基因突變中位PFS比較

2.1.4APC基因 根據(jù)APC基因突變情況分為兩組，APC(+)和APC(-)患者的ORR及CBR比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表5。若以PFS考量兩組的差異性，APC(+)患者中位PFS為3.0個月(95% CI：1.96～4.04)，APC(-)患者中位PFS為3.5個月(95% CI：2.29～4.70)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.860)。見圖4。

表5 APC基因突變對CBR影響對比[n(%)]

圖4 APC基因突變中位PFS比較

2.1.5MYC基因 根據(jù)MYC基因突變情況分為兩組，MYC(+)和MYC(-)患者ORR及CBR比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表6。若以PFS考量兩組的差異性，MYC(+)患者中位PFS為2.5個月(95% CI：1.40～3.60)，MYC(-)患者中位PFS為3.5個月(95% CI：2.83～4.17)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.120)。見圖5。

表6 MYC基因突變對CBR影響對比[n(%)]

圖5 MYC基因突變中位PFS比較

2.2 TMB影響采用基于NGS法基因檢測的符合條件的102例患者，對87例患者的腫瘤組織進行了TMB的檢測，記錄每個腫瘤的TMB值，根據(jù)TMB突變量分為兩組(突變量<8為一組，突變量≥8為另一組)。低TMB組和高TMB組患者ORR比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；兩組CBR比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表7。PFS分布見圖6。若以PFS考量兩組的差異性，高TMB患者中位PFS為5.0個月(95% CI：3.12～6.88)，低TMB患者中位PFS為3.0個月(95% CI：1.80～4.20)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。見圖7。

表7 TMB突變量對CBR影響對比[n(%)]

2.3 不良反應(yīng)各組不良反應(yīng)發(fā)生率比較，其中APC(+)與APC(-)、SMAD4(+)與SMAD4(-)患者間肝功能損傷比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，APC(-)患者肝功能損傷發(fā)生率較APC(+)患者高(χ2=9.000，P=0.003)，SMAD4(+)患者肝功能損傷發(fā)生率較SMAD4(-)患者高(χ2=5.896，P=0.015)；MYC(+)與MYC(-)患者間的輕度骨髓抑制出現(xiàn)率差異有統(tǒng)計學(xué)意義，MYC(+)患者輕度骨髓抑制發(fā)生率較MYC(-)患者高(χ2=11.358，P<0.001)；余各組之間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表8。

圖6 PFS分布散點圖

圖7 高TMB組和低TMB組的中位PFS比較

表8 各組不良反應(yīng)發(fā)生率比較

3 討論

近年來，免疫療法的引入作為癌癥治療的突破口。免疫檢查點抑制劑(immune checkpoint inhibitor，ICI)療法，包括抗PD-1、抗PD-L1和抗CTLA-4療法，在增強有效T細胞的活性和抑制腫瘤微環(huán)境生長方面發(fā)揮了作用[18-19]。多數(shù)人認為免疫療法是一種前途光明的治療方法，已進行了數(shù)年的研究。盡管一些研究表明直腸癌患者對免疫療法很敏感，但在臨床實踐中只取得了很小的獲益。目前通過抑制免疫檢查點途徑取得的成功，尤其是PD-1途徑，是免疫治療的一個突破。腫瘤細胞表面的PD-L1與T細胞上的PD-1結(jié)合，抑制T細胞的抗腫瘤功能，導(dǎo)致效應(yīng)期免疫逃逸及免疫循環(huán)?？紤]到藥物有效率，需要預(yù)測性生物標志物來確定更有可能對ICI產(chǎn)生反應(yīng)的患者，并確定對ICI有抵抗力并需要聯(lián)合治療或改變治療的患者[20]。

根據(jù)分析結(jié)果，直腸癌高TMB患者較低TMB患者接受免疫治療而言，呈現(xiàn)出更長的PFS和CBR，Goodman等[21]的研究結(jié)果表明通過基于雜交捕獲的NGS檢測1.2 Mb基因組測量的TMB可以預(yù)測除黑色素瘤和非小細胞肺癌之外的許多類型的抗PD-1/PD-L1免疫治療的結(jié)果，他們驗證了與較低的患者相比，TMB高的患者有著更高的緩解率、更長的PFS和總生存期(overall survival，OS)，并且TMB與結(jié)果之間的相關(guān)性呈線性關(guān)系。但這是基于所有腫瘤類型而言的，當排除黑色素瘤和非小細胞肺癌患者時，較高的TMB與較好的緩解率和PFS之間的關(guān)聯(lián)仍然顯著，OS卻失去了意義。本文的研究對象為直腸癌患者，也同樣證實了高TMB預(yù)示了更好的PFS和CBR，這點與Goodman等[21]結(jié)論一致，但ORR差異無統(tǒng)計學(xué)意義，可能與臨床數(shù)據(jù)過少有關(guān)。TMB可作為直腸癌PD-1/PD-L1治療反應(yīng)的預(yù)測指標之一，但它并不是完美的，高TMB組仍有個別病例PFS短于6個月；低TMB組也存在PFS高于高TMB組(圖6)。

而突變基因結(jié)果顯示K-RAS、SMAD4、TP53、APC、MYC基因突變與否和直腸癌免疫治療預(yù)后無關(guān)，雖然ORR、CBR、PFS均無統(tǒng)計學(xué)意義，但部分基因ORR和CBR的結(jié)果與PFS的結(jié)果似乎產(chǎn)生了矛盾，例如K-RAS(+)組ORR、CBR雖稍高于K-RAS(-)組，但中位PFS卻稍低于后者，可能與兩組樣本量差距較大以及評價療效時主觀性帶來的誤差有關(guān)，雖然存在矛盾，但兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義，所以這種矛盾也失去了意義。突變譜系是非常龐大的，而每名患者的突變基因具有隨機性，個別基因的突變又是極其罕見的，所以迫切需要更多的數(shù)據(jù)來論證。雖然Stockton等[22]的研究發(fā)現(xiàn)在腫瘤治療前組織中可檢測出豐富的PIK3CA和FBXW7基因，并且在治療后仍豐富，這意味著它們可能是反應(yīng)性差的生物標志物。但此項研究涉及的治療手段太多，不限于免疫治療，所以這些基因?qū)τ诿庖咧委煹姆磻?yīng)性仍有待考據(jù)。

可能成為直腸癌免疫治療療效的靶點還有很多，其中包含了PD-L1表達量、微衛(wèi)星穩(wěn)定性(microsatellite stability，MSS)等，但本文收集數(shù)據(jù)過程中，并未發(fā)現(xiàn)過多患者在治療前檢測PD-L1表達量，且超過95%的患者微衛(wèi)星穩(wěn)定。據(jù)Devaraj等[23]調(diào)查，直腸癌患者中的MSI很少見，迄今為止，人們對直腸癌的MSI子集的表達知之甚少，本文數(shù)據(jù)收集也與此相符，所以未對MSS的差異進行探討。關(guān)于PD-L1，學(xué)界存在爭議，既有Ozawa等[24]論證了PD-L1在腫瘤組織中的高表達；又有Jomrich等[25]未在轉(zhuǎn)移腫瘤組織中檢出高表達的PD-L1。由于預(yù)測CRC免疫治療療效的標志物太少，現(xiàn)如今直腸癌的免疫治療仍不作為主流選擇。

本文研究仍有一些局限性。首先，它是回顧性的；其次，用于回顧的患者數(shù)量過少，代表性不強；第三，評估療效上存在一定的主觀性；第四，癌癥不是靜止的，并且可以隨著它們的進化而獲得突變。NGS通常在舊的活檢標本上進行，因此測試的樣本可能無法準確反映腫瘤當前的狀態(tài)。

綜上所述，本研究表明直腸癌高TMB患者相比低TMB患者接受免疫治療而言，呈現(xiàn)出更長的PFS和CBR，TMB作為直腸癌預(yù)后指標有一定意義；K-RAS、SMAD4、TP53、APC、MYC基因突變與否和直腸癌免疫治療預(yù)后無關(guān)，為進一步論證，還需要更大規(guī)模的研究。